فحوصات النقل النووي في الخلايا العصبية القشرية للفأر النفاذة

لقد طورنا طريقة موثوقة لنفاذية غشاء البلازما الانتقائي للخلايا العصبية القشرية الأولية للفأر من أجل التحليل الآلي عالي المحتوى للنقل النووي للخلايا العصبية.

يتورط اضطراب النقل النووي للخلايا بشكل متزايد في التسبب في الأمراض التنكسية العصبية. علاوة على ذلك ، هناك اعتراف متزايد بالاختلافات الخاصة بالخلية في بنية المسام النووية المعقدة ، مما يؤدي إلى الحاجة إلى تكييف طرق النقل النووي لاستخدامها في الخلايا العصبية. تستخدم فحوصات الخلايا المنفذة ، حيث يتم ثقب غشاء البلازما بشكل انتقائي بواسطة الديجيتونين ، على نطاق واسع لدراسة النقل النووي السلبي والنشط في خطوط الخلايا الخالدة ولكن لم يتم تطبيقها على الثقافات العصبية. في محاولاتنا الأولية ، لاحظنا الفقدان السريع لسلامة الغشاء النووي في الخلايا العصبية القشرية الأولية للفأر المعرضة حتى لتركيزات منخفضة من الديجيتونين. افترضنا أن الأغشية النووية العصبية قد تكون معرضة بشكل فريد لفقدان الدعم السيتوبلازمي. بعد اختبار طرق متعددة لتحسين الاستقرار النووي ، لاحظنا السلامة النووية المثلى بعد التحلل المنخفض التوتر في وجود وسادة ألبومين مصل البقر المركزة. تستورد النوى العصبية المحضرة بهذا النهج بشكل موثوق شحنات الفلورسنت المؤتلفة بطريقة تعتمد على الطاقة ، مما يسهل تحليل الاستيراد النووي عن طريق الفحص المجهري عالي المحتوى مع التحليل الآلي. نتوقع أن تكون هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على دراسات النقل النووي السلبي والنشط في الخلايا العصبية الأولية.

إن تعطيل النقل النووي للسيتوبلازمات ، والاتجار المنظم للبروتينات والحمض النووي الريبي بين النواة والسيتوبلازم ، متورط بشكل متزايد في التسبب في الأمراض التنكسية العصبية (تمت مراجعتها مؤخرا¹). لقد أبلغنا نحن وآخرون عن اضطراب هيكلي ووظيفي لجهاز النقل النووي للهويتوبلازمي في أنسجة ما بعد الوفاة والنماذج الحيوانية للتصلب الجانبي الضموري C9orf72 (ALS) والخرف الجبهي الصدغي (FTD) ومرض الزهايمر ومرض هنتنغتون^2،3،4،5. تعد الآليات والعواقب الوظيفية لاضطراب النقل النووي للخلايا من أجل التنكس العصبي ، وأساليب الإنقاذ العلاجي ، مجالات التحقيق المستمر.

المسام النووية عبارة عن مجمعات غشائية كبيرة من ~ 30 بروتين نيوكليوبورين تسمح بانتشار جزيئات صغيرة عبر الغشاء النووي ولكنها تقيد بشكل متزايد مرور الشحنات >40 كيلو دالتون عبر حاجز نفاذية للنيوكليوبورينات الغنية بالفينيل ألانين جلايسين (FG) في القناة المركزية⁶. تخضع الشحنات الأكبر حجما التي تحتوي على إشارة توطين نووية (NLS) أو تسلسلات إشارة التصدير النووي (NES) لنقل نشط بوساطة مستقبلات عبر المسام عبر مستقبلات النقل النووي (importins و exportins) وتدرج حاد من GTPase الصغير الذي تم تشغيله عبر الغشاء النووي (تمت مراجعته^{مؤخرا 7}). تم تطوير مجموعة واسعة من الأساليب لتحليل ديناميكيات النقل النووي في الخلايا المستزرعة ، بما في ذلك الاتجار بالشحنات الداخلية وتركيبات المراسلين الموسومة التي تعمل كركائز للفئات الفرعية الرئيسية لمستقبلات النقل. تم تكييف هذه الأساليب بسهولة مع الخلايا العصبية^2،5،8 وتوفر قراءة لاضطرابات النقل النووي في سياق خلية حية سليمة. ومع ذلك ، في فحوصات الخلايا الحية ، تكون القدرة على التلاعب المباشر بتفاعلات النقل النووي أو التحقيق فيها بمعزل عن العمليات الخلوية الأخرى محدودة.

في فحوصات الخلية المنفذة ، يتم ثقب غشاء البلازما بشكل انتقائي ، ويتم إطلاق السيتوبلازم ، تاركا الغلاف النووي ومجمعات المسام النووية سليمة وقادرة على أداء النقل ثنائي الاتجاه السلبي أو المعتمد على الطاقة^9،10. يمكن إعادة تكوين تفاعلات النقل هذه بسهولة عن طريق إضافة محللات الخلية الكاملة أو الكسور السيتوبلازمية أو بروتينات النقل النووي المؤتلف المنقاة وحمولتها. وبالتالي ، فإن فحوصات الخلايا المنفذة تسمح بمجموعة واسعة من التحقيقات الكيميائية الحيوية أو الفيزيائية الحيوية ، بما في ذلك توصيل البروتينات المؤتلفة أو الاصطناعية والحمض النووي الريبي ذات الصلة بدراسة الأمراض التنكسية العصبية.

بالنظر إلى التقارير عن الاختلافات الخاصة بالخلية في البنية المعقدة للمسام النووية وديناميكيات النقل^11،12 ، كنا نهدف إلى تكييف مقايسة الخلية المنفذة لاستخدامها في الثقافات العصبية الأولية. على الرغم من استخدامه على نطاق واسع لتحليل النقل النووي في خطوط الخلايا الخالدة ، على الرغم من البحث الشامل في الأدبيات ، لم نعثر على أي تقارير منشورة عن نفاذية غشاء البلازما العصبية التي تحققت من الحفاظ على سلامة الغشاء النووي. تعتمد معظم البروتوكولات على الديجيتونين ، وهو منظف يستهدف تركيبة الكوليسترول الفريدة لغشاء البلازما ، لتثقيب الغشاء النووي مع ترك الغشاء النووي سليما¹³. أظهرت محاولاتنا الأولية باستخدام الديجيتونين في الخلايا العصبية القشرية الأولية للفأر فقدانا فوريا لسلامة الغشاء النووي ، كما يتضح من انتشار ديكستران فلوري 70 كيلو دالتون في النواة. افترضنا أن تمزق الغلاف النووي قد يكون ناتجا عن اضطراب ميكانيكي من فقدان الدعم السيتوبلازمي ، واختبرنا طرقا متعددة للتحسين ، بما في ذلك الازدحام الجزيئي ، وتثبيت الهيكل الخلوي ، والطرق البديلة لتحلل الخلايا. هنا ، نقوم بتفصيل طريقة النفاذية السريعة منخفضة التوتر باستخدام وسادة ألبومين مصل البقر المركز (BSA) لحماية النوى العصبية وتسهيل التحليل النهائي للاستيراد النووي العصبي. استخدمنا هذه الطريقة مؤخرا لتقييم آلية اضطراب البروتين المتكرر ثنائي الببتيد في C9orf72-ALS / FTD¹⁴ ونتوقع أنها ستكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الدراسات المستقبلية للنقل النووي السلبي والنشط في الخلايا العصبية الأولية.

أولا ، يصف البروتوكول توليد الثقافات العصبية الأولية (الخطوة 1) وإعداد المواد لمقايسة النقل (الخطوة 2) ، متبوعا بمقايسة النقل نفسها (الخطوات 3-4) واكتساب الصور وتحليلها (الخطوة 5). تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية واستخدامه (ACUC) بجامعة جونز هوبكنز.

1. ثقافات الخلايا العصبية القشرية الأولية للفأر

1. تحضير حلول المخزون.
   1. المخزن المؤقت للتسلخ: امزج 50 مل من 10x HBSS ، و 15 مل من 1 M جلوكوز (في dH₂O) ، و 5 مل من 1 M HEPES ، و 5 مل من 100 ملي بيروفات الصوديوم ، و 5 مل من 100x البنسلين - الستربتومايسين. ارفع الحجم إلى 500 مل باستخدام فلتر dH₂O. معقم وخزنه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   2. غراء: يخفف غراء إلى 30 ملغ/مل مع محلول التسليح. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   3. DNase: تمييع DNase I إلى 10 مجم / مل مع مخزن التسليح. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
   4. وسط الطلاء: أضف 5٪ مصل بقري للجنين (FBS) ، و 2٪ B-27 ، و 1٪ جلوتاماكس ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين إلى الوسط العصبي القاعدي. فلتر معقم وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   5. وسط التغذية: أضف 2٪ B-27 و 1٪ جلوتاماكس و 1٪ بنسلين ستربتومايسين إلى الوسط العصبي القاعدي. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. قم بتغطية اللوحات.
   1. قم بتغطية الألواح ذات القاع الزجاجي البصري المكونة من 96 بئرا ب poly-D-lysine (20 ميكروغرام / مل) واللامينين (1: 100) في dH₂O. ضع اللوحة في حاضنة طوال الليل.
   2. في يوم التشريح ، اشطف الآبار ثلاث مرات ب dH₂O المعقم واستبدلها بوسط عصبي قاعدي. التوازن في حاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
3. تشريح وهضم القشرية.
   ملاحظة: قم بإجراء التشريح على مقعد نظيف باستخدام أدوات معقمة لمنع تلوث المزرعة.
   1. قتل الرحيم للأنثى الحامل E15-16 C57BL / 6J عن طريق خلع عنق الرحم. رش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. اعمل بسرعة. استخدم المقص والملقط المسنن لعمل شق في البطن في خط الوسط ، واستئصال الرحم ، ثم نقل الأجنة من الكيس الأمنيوسي إلى طبق بتري. اقطع رأس الأجنة بالمقص واجمع الرؤوس في طبق بتري مقاس 10 سم يحتوي على عازلة تشريح.
   2. تحت المجهر التشريح ، استخدم ملقطا دقيقا لإزالة الجمجمة وتقشير السحايا. انقل الأدمغة الكاملة إلى طبق بتري طازج مقاس 10 سم يحتوي على عازلة تشريح. افصل نصفي الكرة الأرضية وقم بإزالة الهياكل تحت القشرية.
   3. اقطع القشرة بشفرة حلاقة معقمة وانقلها إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 5 مل من محلول التشريح. أضف 100 ميكرولتر من غراء (مخزون 30 مجم / مل ، التركيز النهائي 0.6 مجم / مل) و 50 ميكرولتر من DNase (مخزون 10 مجم / مل ، التركيز النهائي 0.1 مجم / مل). يهضم في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: الهضم بعد 10 دقائق يضر ببقاء الخلايا.
   4. قم بإزالة المادة الطافية واغسلها مرتين ب 10 مل من وسائط الطلاء لوقف الهضم. اسمح للأنسجة بالاستقرار بالجاذبية بين كل غسلة.
   5. قم بترتيتر برفق في وسائط طلاء سعة 2 مل باستخدام ماصة P1000 حتى تختفي قطع كبيرة من الأنسجة (حوالي 20 مرة). أضف 8 مل أخرى من وسائط الطلاء لرفع الحجم إلى حوالي 10 مل وتمرير تعليق الخلية عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
4. لوحة والحفاظ على الخلايا العصبية.
   1. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في وسط طلاء مسخن مسبقا. عد الخلايا وخفف إلى 500,000 خلية / مل في وسط الطلاء. اقلبها برفق للخلط ونقلها إلى خزان معقم متعدد القنوات.
   2. استنشق الوسائط العصبية القاعدية من الآبار وأضف على الفور 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات (50,000 خلية / بئر). لا تدع الآبار المطلية تجف.
   3. بعد 24 ساعة من التشريح ، قم بتغيير 50٪ من الوسط بوسط التغذية. استمر في التغيير المتوسط بنسبة 50٪ كل يومين حتى اليوم 5-7 لإجراء فحوصات المختبر .

2. تحضير مكونات مقايسة النقل النووي

1. عازل النقل (TRB ، مقتبس من¹⁵)
   1. لتحضير 5x TRB ، قم بإذابة 100 ملي مولار HEPES ، و 550 ملي مولار KOAc ، و 10 ملي مجم (OAc) ₂ ، و 25 ملي NaOAc ، و 2.5 ملي مولار EGTA ، و 1.25 م سكروز في dH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 وقم بتخزين المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية.
   2. في يوم تجربة النقل ، قم بإعداد 1x TRB-BSA. خفف 5x TRB في dH₂O ، أضف كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA ، و 2 ملي من DTT ، و 50 مجم / مل من BSA.
2. مزيج تجديد الطاقة (ERM ، مقتبس من^9،16)
   1. لتحضير 20x ERM ، قم بإذابة ملح الليثيوم ATP 2 ملي مولار ، و 2 ملي مولار ملح الليثيوم GTP ، و 80 ملي فوسفات الكرياتين ، و 400 وحدة / مل من الكرياتين كيناز في 1x TRB.
   2. قم بتجميد الحصص ذات الاستخدام الواحد عند -20 درجة مئوية.
3. تحضير مستخلص الخلية الكاملة (WCE ، مصدر مستقبلات النقل وبروتينات دورة Ran).
   ملاحظة: يمكن استخدام مستخلص السيتوبلازمي أو مستخلص الخلية الكاملة (WCE) ، اعتمادا على الأهداف التجريبية. هنا ، يتم وصف تحضير WCE على أنه يستخدم في فحوصات نقل الخلايا العصبية الأولية¹⁰.
   1. تنمو الخلايا HEK293T التقاء في خمسة عشر طبقا استزراعيا مقاس 150 مم. افصله مع التربسين EDTA ، وأعد تعليقه في الوسائط التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني لتثبيط التربسين ، وخلايا الحبيبات عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من الثلج البارد 1x TRB مع كوكتيل مثبط البروتياز المضاف حديثا.
   2. صوتنة على الجليد ، 3 × 10 نبضات ، باستخدام مسبار صوتي محمول باليد. قم بالتوضيح بالطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   3. قم بقياس تركيز البروتين (الهدف 8-10 مجم / مل) وقم بتجميد الحصص ذات الاستخدام الواحد في النيتروجين السائل قبل تخزينه عند -80 درجة مئوية.
4. شحنات الاستيراد النووية المؤتلفة
   ملاحظة: يمكن تكييف بروتوكول النقل في الخطوات من 3 إلى 5 مع أي شحنة نقل نووي فلورية ، لاستجواب مسار النقل النووي النشط أو السلبي ذي الأهمية. هنا ، يصف البروتوكول التعبير والاستيراد النووي ل Rango (importin β cargo الخاضع للرقابة Ran) ، والذي يتكون من مجال الاستيراد β المرتبط ب importin α1 محاط ببروتينات الفلورسنت CyPet و YPet^14،17. Rango هو جهاز استشعار متعدد الاستخدامات يمكن استخدامه في FRET بالإضافة إلى فحوصات الاستيراد النووي ، حيث يعمل كاستيراد مباشر للبضائع β.
   1. قم بتحويل بكتريا قولونية BL21 (DE3) الخلايا باستخدام بلازميد رانجو (الذي يحتوي على علامة N-terminal 6-His Tag) عن طريق الصدمة الحرارية على النحو التالي. قم بإذابة 50 ميكرولتر من خلايا BL21 (DE3) على الجليد. يمزج مع 100-200 نانوغرام البلازميد. امزج عن طريق النقر على الأنبوب 4-5 مرات ثم احتضانه على الثلج لمدة 30 دقيقة قبل وضعه على طبق 42 درجة مئوية لمدة 40 ثانية. انقله على الفور إلى الثلج لمدة 2-5 دقائق أخرى.
   2. أضف 900 ميكرولتر من وسائط SOC في درجة حرارة الغرفة واحتضانها على شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل نشر الخلايا على صفيحة أجار مسخنة مسبقا (1.5٪ أجار ، وسائط LB ، 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين). احتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية. قم بتخزين الطبق في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو استخدمه على الفور لإنتاج البروتين.
   3. ابدأ إنتاج البروتين عن طريق تلقيح ثلاثة 25 مل من المزارع البادئة في أنابيب سعة 50 مل مع عدد متزايد من المستعمرات (~ 3-10) من لوحة BL21 (DE3). بعد الحضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية على شاكر ، حدد المزارع التي تحتوي على OD_{600 نانومتر} < 1.0 لتلقيح مزرعة 1 لتر في وسائط LB باستخدام قارورة فيرنباخ خالية من الحاجز سعة 2.8 لتر. تنمو عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى OD_{600 نانومتر} = 0.1-0.3.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي استخدام ألواح أجار BL21 (DE3) LB القديمة أو الكثافة العالية لمزارع المبتدئين (OD_{600 nm} >1.0) إلى تقليل إنتاجية ونقاء مستحضر البروتين.
   4. تبرد إلى درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية) عن طريق وضعها على الثلج. تحفيز التعبير عن البروتين مع 0.3 ملي مولار IPTG (التركيز النهائي) واحتضانه على شاكر (80-120 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 12-14 ساعة.
   5. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (6,000 × جم ، 15 دقيقة ، 4 درجات مئوية) وأعد تعليقها في 30 مل من إيميدازول 10 ملي مولار في PBS (درجة الحموضة 7.4) ، مع استكمال كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA. يمر Lyse بمقدار اثنين من خلال خلية ضغط فرنسية مثلجة وتوضيح المحللة عن طريق الطرد المركزي (16,000 × جم ، 40 دقيقة ، 4 درجات مئوية).
   6. احتضان المحللة براتنج الاغاروز عالي التدفق من النيكل (30-60 دقيقة ، 4 درجات مئوية) ، باستخدام 1 مل من الراتنج لكل 1 لتر من ثقافة الإشريكية القولونية . ضع الراتنج في أعمدة الكروماتوغرافيا ، واغسله ب 10-20 حجما من المثلج البارد 10 ملي مولار إيميدازول / PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4). Elute Rango بزيادات 25 ملي مولار إيميدازول / PBS (25-200 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.4) ، باستخدام حجم سرير 5 أضعاف في كل خطوة.
   7. استخدم SDS-PAGE لتحديد الدفعات بأعلى نقاء وتجميعها.
   8. قم بإعداد المخزن المؤقت XB عن طريق إذابة 10 ملي مولار HEPES ، و 100 ملي مولار KCl ، و 10 ملي مولار CaCl₂ ، و 1 ملي مولار MgCl₂ ، و 50 ملي مولار سكروز في dH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.7.
   9. غسيل البروتين في المخزن المؤقت XB وتركيزه عن طريق الطرد المركزي (7500 × جم ، 4 درجات مئوية) على جهاز ترشيح فائق بقطع الوزن الجزيئي 30 كيلو دالتون.
   10. قم بقياس تركيز البروتين برادفورد أو أي طريقة أخرى مفضلة ، وقم بتجميد الحصص ذات الاستخدام الواحد في النيتروجين السائل قبل التخزين عند -80 درجة مئوية.

3. تحديد الظروف المثلى لنفاذية غشاء البلازما

ملاحظة: نظرا للاختلافات بين كل دفعة من الخلايا العصبية ، قم بتحسين ظروف النفاذية لكل دفعة من الخلايا العصبية. قم بإجراء ذلك في نفس اليوم قبل إجراء فحوصات النقل النووي.

1. في لوحة التدريج البلاستيكية المكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد تخفيف تسلسلي لدرجة الحموضة Tris-HCl 7.5 (لإحداث تورم تناضحي) ، عند 0 ميكرومتر ، 10 ميكرومتر ، 20 ميكرومتر ، و 40 ميكرومتر في كل تركيز من تركيزات BSA الثلاثة: 50 مجم / مل ، 100 مجم / مل ، و 150 مجم / مل (للازدحام الجزيئي / الدعم الميكانيكي). قم بتسخين المحاليل مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
2. اشطف الخلايا العصبية مرة واحدة في PBS الدافئ مسبقا. قم بإزالة PBS ونقل Tris / BSA من لوحة التدريج. العودة إلى الحاضنة لمدة 4 دقائق.
3. أخرجه من الحاضنة وضع طبق الثقافة على الثلج. اشطف 2 × 5 دقائق في 1 × TRB-BSA (كما هو محضر في الخطوة 2.1.2).
4. بعد الشطف النهائي ، أضف 70 كيلو دالتون من ديكستران تكساس الأحمر (0.6 مجم / مل) و Hoechst (1: 10،000) في 1x TRB-BSA. اترك الطبق على المقعد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، محميا من الضوء.
5. صورة باستخدام مجهر متحد البؤر لتحديد المخزن المؤقت وتركيز BSA حيث تكون نسبة نفاذية غشاء البلازما هي الأعلى ، لكن الغشاء النووي لا يزال يقيد دخول ديكستران 70 كيلو دالتون (الهدف ≥ 80٪). استخدم هذه الشروط للتجارب اللاحقة.

4. فحص الاستيراد النووي

1. تحضير تفاعلات النقل
   ملاحظة: لتمكين بدء جميع التفاعلات في اللوحة في وقت واحد ، قم بإعداد مزيج التفاعل في صفيحة انطلاق بلاستيكية مكونة من 96 بئرا على الجليد ، قبل نفاذية الخلايا العصبية. قم بإجراء ما لا يقل عن تكرارين تقنيين لكل شرط. قم بتضمين عناصر التحكم في كل لوحة.
   1. تحضير مزيج التفاعل الأساسي الذي يتكون من 2.5 مجم / مل من WCE ، 1x ERM ، شحن الفلورسنت (200 نانومتر رانغو) ، و Hoechst 33342 (10 مجم / مل ، 1: 10،000) في 1x TRB-BSA ، يكفي ل 50 ميكرولتر لكل بئر. الخيار: قم بتضمين 70 كيلو دالتون من تكساس ديكستران ذو علامة حمراء للسماح بمراقبة سلامة المسام النووية طوال تفاعل النقل ، مع الأخذ في الاعتبار أن الفحص المجهري متحد البؤر ضروري لتصوير استبعاد ديكستران النووي.
      ملاحظة: تركيز WCE المقدم هو نقطة انطلاق معقولة لتحسين المقايسة. إجراء اختبار تجريبي لكل دفعة من WCE لتحديد التركيز الأمثل المطلوب للاستيراد النووي الفعال للشحنة المطلوبة. تجنب دمج البيانات من النسخ المتماثلة المعدة بدفعات مختلفة من WCE لأن كفاءة الاستيراد قد تختلف.
   2. قم بإعداد الضوابط بما في ذلك (1) البضائع وحدها: رانغو ، ولكن لا يوجد WCE أو ERM و (2) المثبط: البضائع الفلورية ، ERM ، WCE ، و 100 ميكرومتر importazole (IPZ ، مثبط جزيئي صغير من importin β¹⁸). كمثبط بديل ، استخدم 0.8 مجم / مل من رص جنين القمح (WGA) ¹⁹.
      ملاحظة: قم بموازنة المثبطات في مزيج الفحص الذي يحتوي على WCE لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء النقل. للحصول على أقصى قدر من التثبيط ، يجب أن تتضمن خطوات شطف ما بعد النفاذية في الآبار المقابلة أيضا المثبط.
2. نفاذية وشطف الخلايا العصبية
   1. تنفذ الخلايا العصبية وفقا للبروتوكول الأمثل الخاص بالدفعة المحدد في الخطوة 3.
   2. قم بإزالة لوحة الثقافة من الحاضنة وضعها على الفور على الجليد. اشطف 2x لمدة 5 دقائق في 1x TRB-BSA. قم بتضمين مثبط في شطف الآبار المخصصة.
3. قم بتشغيل تفاعل النقل.
   1. بعد الشطف النهائي ، قم بإزالة 1x TRB-BSA. تعمل بسرعة ، واستخدم ماصة متعددة القنوات (50 ميكرولتر / بئر) لنقل تفاعلات النقل المخلوطة مسبقا إلى الخلايا المنفذة.
   2. قم بتحميل اللوحة على الفور في مجهر عالي المحتوى في درجة حرارة الغرفة لبدء التصوير بفاصل زمني (انظر الخطوة 4.4) أو ضع اللوحة على المقعد ، محميا من الضوء ، واسمح للتفاعل بالاستمرار للفترة الزمنية المطلوبة (على سبيل المثال ، 30-120 دقيقة) قبل التثبيت والتصوير.
   3. إذا رغبت في ذلك ، قم بتثبيته في 4٪ بارافورمالدهيد / PBS لمدة 15 دقيقة ، واشطفها 2x لمدة 5 دقائق في PBS ، ثم انقله إلى 50٪ جلسرين / PBS للتصوير اللاحق. حافظ على الألواح الثابتة محمية من الضوء عند 4 درجات مئوية (مستقرة لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو أكثر).
4. التصوير المباشر
   ملاحظة: قم بتطبيق أي طريقة مفضلة للحصول على الصور وتحليلها في هذه المرحلة.
   1. قم بتحميل اللوحة في مجهر عالي المحتوى. قم بتشغيل لوحة اختبار أولية لتحسين معلمات التصوير وحفظها، بما في ذلك التكبير والتركيز البؤري وأوقات التعريض الضوئي (Hoechst وFITC) والفترات الزمنية قبل تشغيل العينات التجريبية. احفظ المعلمات لإعادة التحميل مع كل لوحة لاحقة.
      ملاحظة: للتحليل الكمي، اضبط وقت التعرض لشحنة استيراد الفلورسنت (FITC) أقل بكثير من التشبع في الحالة المستقرة أو آخر نقطة زمنية لاستخدامها. قم بإنشاء ذلك باستخدام لوحة الاختبار ، مع استهداف التشبع الأقصى لنصف الحد الأقصى للسماح بالاختلافات في الشدة عبر الظروف التجريبية. اجمع صور Hoechst لكل إطار ونقطة زمنية للسماح بتحديد الهوية النووية أثناء التحليل الآلي اللاحق.
   2. اضبط إزاحة التركيز البؤري، إذا لزم الأمر، باستخدام Hoechst كطول موجي للتركيز البؤري وقم بتشغيل بروتوكول التصوير. اجمع الصور كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة. اضبط الفاصل الزمني ووقت رد الفعل حسب الحاجة بناء على سرعة التصوير وحركية تفاعل الاستيراد محل الاهتمام.

5. تحليل الصور

1. في مربع حوار لوحة مراجعة المجهر، افتح صور Hoechst و FITC من إطار تمثيلي. ضمن علامة التبويب تشغيل التحليل ، حدد الوحدة النمطية المحسنة للنقل ، وقم بتكوين الإعدادات. قم بتعيين Hoechst كصورة المقصورة و FITC كصورة مسبار الإزاحة.
2. أسفل المقصورات، اضبط العرض النووي التقريبي، والشدة فوق الخلفية المحلية، والحد الأدنى/الحد الأقصى للمساحة. قم بتنشيط مقصورات اللمس المنفصلة تلقائيا حيث تميل الخلايا العصبية إلى التجمع. عرض النتائج عن طريق تحديد تشغيل الاختبار. اضبط الإعدادات لزيادة دقة تحديد النوى العصبية مع الحد من التضمين الخاطئ للنوى أو الحطام غير العصبي.
   ملاحظة: يمكن عادة استبعاد التلوث الدبقي ، إذا كان موجودا ، في هذه الخطوة بناء على الحجم النووي. يعد تحديد إعدادات تحديد المقصورة المثلى مقايضة بين الدقة ورقم الخلية ويجب تعيينها تجريبيا اعتمادا على الفحص ونوع الخلية وكثافة الثقافة. ستحذف المعلمات الصارمة العديد من الخلايا ولكنها تتضمن أخطاء أقل ، في حين أن المعلمات الليبرالية ستكون أكثر شمولا ولكنها تحتوي على المزيد من الأخطاء. إذا تم تضمين مجموعات خلايا مختلفة (أي طفرات المرض) أو العلاجات التي قد تؤثر على الحجم النووي ، فإننا نوصي بتعيين معلمات الحجم / الشدة التي تكون واسعة بما يكفي لاستيعاب جميع الظروف لتجنب الحاجة إلى مجموعات معلمات متعددة داخل التجربة.
3. لتجنب القطع الأثرية من الحافة النووية ، حدد مناطق القياس عدة بكسل داخل وخارج حافة المقصورة المحددة بواسطة تلطيخ Hoechst. اعتمادا على التكبير والتجميع، قم بتعيين 2-4 بكسل لمسافة المنطقة الداخلية، و1-2 بكسل لمسافة المنطقة الخارجية. اضبط عرض المنطقة الخارجية (1-2 بكسل).
4. حدد طريقة تقدير الخلفية المطلوبة (يوصى باستخدام الثابت التلقائي الافتراضي). في تكوين سجل البيانات، حدد معلمات الإخراج المطلوبة، بما في ذلك متوسط الشدة الداخلية، ومتوسط الشدة الخارجية، ومتوسط الشدة الداخلية/الخارجية (نسبة النواة إلى السيتوبلازمية (N/C)). احفظ معلمات التحليل.
   ملاحظة: يتم تشجيع إدراج الضوابط الداخلية الإيجابية والسلبية في كل تجربة لضمان أن تزيد المعلمات من الحساسية لاكتشاف الحدث البيولوجي ذي الأهمية.
5. استخدم مربع الحوار Plate Utilities لتشغيل التحليل على اللوحة (اللوحات) المطلوبة باستخدام المعلمات المحفوظة وتصدير القياسات.
6. مراجعة وتلخيص البيانات حسب حالة العلاج. الخيار: قم بتطبيق المرشحات لإزالة البيانات غير الفسيولوجية ، مثل شدة المسبار = 0 وأقصى نسبة N / C (أي <0.1 و >100). قم بتطبيق أي عوامل تصفية بالتساوي في جميع الشروط والتجارب.
7. كتصحيح إضافي لمضان خط الأساس ، قم بتطبيع البيانات إلى آبار التحكم التي تم فيها حذف المحللة والطوارئ. لتسهيل المقارنات عبر التكرارات البيولوجية (أي مستحضرات الثقافة العصبية المستقلة) ، عبر عن بيانات الاستيراد النووي النهائية كنسبة مئوية من الوقت 0.

النفاذية الانتقائية لغشاء البلازما (الشكل 1 أ) هي الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول ويجب التحقق منها قبل الشروع في تحليل الاستيراد النووي. نظرا للاختلافات بين كل مستحضر للاستزراع، يتم تشغيل لوحة المعايرة بالتحليل الحجمي الأولية بشكل روتيني لتحديد الترك...

يوفر البروتوكول المفصل أعلاه طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لاختراق غشاء البلازما بشكل انتقائي للخلايا العصبية القشرية الأولية للفأر لتحليل الاستيراد النووي. ويبين هنا تطبيق لطريقة تحليل الواردات النووية لشحنة β مستوردة مباشرة (رانغو)، ولكن يمكن استخدام هذا النهج نفسه ل...

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

تم دعم هذا العمل من قبل NINDS K08NS104273 (إلى L.R.H.).