透化小鼠皮质神经元中的核转运检测

我们开发了一种可靠的原代小鼠皮质神经元选择性质膜透化方法，用于神经元核质转运的高内涵自动分析。

核质运输的破坏越来越与神经退行性疾病的发病机制有关。此外，人们越来越认识到核孔复合体结构的细胞特异性差异，这促使需要调整核转运方法以用于神经元。透化细胞测定，其中质膜被洋地黄皂苷选择性穿孔，广泛用于研究永生化细胞系中的被动和主动核转运，但尚未应用于神经元培养。在我们的初步尝试中，我们观察到即使在低浓度的洋地黄皂苷下，原代小鼠皮层神经元的核膜完整性也会迅速丧失。我们假设神经元核膜可能特别容易受到细胞质支持丧失的影响。在测试了多种提高细胞核稳定性的方法后，我们观察到在浓缩牛血清白蛋白垫存在下低渗裂解后的最佳细胞核完整性。通过这种方法制备的神经元核以能量依赖性方式可靠地导入重组荧光货物，便于通过高内涵显微镜和自动分析来分析核输入。我们预计该方法将广泛适用于原代神经元中被动和主动核转运的研究。

核质运输的破坏，即蛋白质和 RNA 在细胞核和细胞质之间的调节运输，越来越与神经退行性疾病的发病机制有关（最近综述¹）。我们和其他人报道了 C9orf72 肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 和额颞叶痴呆 （FTD）、阿尔茨海默病和亨廷顿病的死后组织和动物模型中核质运输装置的结构和功能破坏 2,3,4,5 .核质转运中断对神经退行性变的机制和功能后果，以及治疗性挽救的方法，是正在进行的研究领域。

核孔是 ~30 个核孔蛋白的大型跨膜复合物，允许小分子跨核膜扩散，但越来越多地限制货物通过^{中央通道中}富含苯丙氨酸-甘氨酸 （FG） 的核孔蛋白 （FG） 的通透屏障 >40 kD。含有核定位信号 （NLS） 或核输出信号 （NES） 序列的较大货物通过核转运受体 （importins 和 exportins） 和小 GTP 酶 Run 穿过核膜的陡峭梯度 （最近综述⁷） 经历活跃的受体介导的转运穿过孔。已经开发了多种方法来分析培养细胞中的核转运动力学，包括内源性货物和标记的报告基因构建体的运输，这些物质和标记的报告基因构建体作为转运受体主要亚类的底物。这种方法已经很容易适应神经元 ^2,5,8，并在完整的活细胞背景下提供核转运扰动的读数。然而，在活细胞检测中，直接纵核转运反应或独立于其他细胞过程研究它们的能力是有限的。

在透化细胞测定中，质膜选择性穿孔，细胞质被释放，使核膜和核孔复合物完好无损，并能够执行被动或能量依赖性双向转运 ^9,10。通过添加全细胞裂解物、细胞质组分或纯化的重组核转运蛋白及其货物，可以很容易地重构这种转运反应。因此，透化细胞测定允许进行广泛的生化或生物物理研究，包括递送与神经退行性疾病研究相关的重组或合成蛋白质和 RNA。

鉴于核孔复合体结构和转运动力学的细胞特异性差异^{的报道 11,12}，我们的目标是调整透化细胞测定以用于原代神经元培养。尽管广泛用于分析永生化细胞系中的核转运，但尽管进行了详尽的文献搜索，但我们没有发现已发表的神经元质膜透化报告可以验证核膜完整性的保存。大多数方案依赖于洋地黄皂苷（一种针对质膜独特胆固醇组成的去污剂）在保持核膜完整的情况下穿孔^{核膜 13}。我们在原代小鼠皮层神经元中使用洋地黄皂苷的初步尝试显示核膜完整性立即丧失，70 kD 荧光葡聚糖扩散到细胞核中证明了这一点。我们假设核膜破裂可能是由细胞质支持丧失引起的机械扰动引起的，并测试了多种优化方法，包括分子拥挤、细胞骨架稳定和细胞裂解的替代方法。在这里，我们详细介绍了一种使用浓缩牛血清白蛋白 （BSA） 垫的快速低渗透化方法，以保护神经元核并促进神经元核输入的下游分析。我们最近使用这种方法来评估 C9orf72-ALS/FTD¹⁴ 中二肽重复蛋白破坏的机制，并预计它将广泛适用于原代神经元中被动和主动核转运的未来研究。

首先，该方案描述了原代神经元培养物的产生（第 1 步）和运输测定材料的制备（第 2 步），然后是运输测定本身（第 3-4 步）和图像采集和分析（第 5 步）。此处描述的所有方法均已获得约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会 （ACUC） 的批准。

1. 原代小鼠皮层神经元培养

1. 准备储备溶液。
   1. 解剖缓冲液：混合 50 mL 10x HBSS、15 mL 1 M 葡萄糖（以 dH₂O 为单位）、5 mL 1 M HEPES、5 mL 100 mM 丙酮酸钠和 5 mL 100x 青霉素-链霉素。用 dH₂O 使体积达到 500 mL。无菌过滤器并储存在 4 °C。
   2. 木瓜蛋白酶：用解剖缓冲液将木瓜蛋白酶稀释至 30 mg/mL。储存在 4 °C。
   3. DNase：用解剖缓冲液将 DNase I 稀释至 10 mg/mL。分装并储存在 -20 °C。
   4. 铺板培养基：向神经基础培养基中加入 5% 胎牛血清 （FBS）、2% B-27、1% 谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素。无菌过滤并储存在 4 °C。
   5. 补料培养基：向 Neurobasal 培养基中加入 2% B-27、1% Glutamax 和 1% 青霉素-链霉素。储存在 4 °C。
2. 涂布板。
   1. 在无菌 dH₂O 中用聚-D-赖氨酸 （20 μg/mL） 和层粘连蛋白 （1：100） 包被光学玻璃底 96 孔板。将板放入培养箱中过夜。
   2. 在解剖当天，用无菌 dH₂O 冲洗孔 3 次，并更换为 Neurobasal 培养基。在培养箱中平衡至少 30 分钟。
3. 解剖和消化皮质。
   注：使用高压灭菌工具在洁净工作台上进行解剖，以防止培养物污染。
   1. 通过宫颈脱位对 E15-16 C57BL/6J 孕妇实施安乐死。用 70% 乙醇喷洒腹部。快速工作。用剪刀和带齿的镊子做一个腹部中线切口，切除子宫，然后将胚胎从羊膜囊转移到培养皿中。用剪刀将胚胎斩首，并将头部收集在含有解剖缓冲液的 10 厘米培养皿中。
   2. 在解剖显微镜下，使用细镊子去除颅骨并剥去脑膜。将整个大脑转移到含有解剖缓冲液的新鲜 10 厘米培养皿中。分离半球并去除皮质下结构。
   3. 用无菌剃须刀片切碎皮质，然后将它们转移到含有 5 mL 解剖缓冲液的锥形管中。加入 100 μL 木瓜蛋白酶（原液 30 mg/mL，终浓度 0.6 mg/mL）和 50 μL DNase（原液 10 mg/mL，终浓度 0.1 mg/mL）。在 37 °C 水浴中消化 10 分钟。
      注：消化超过 10 分钟对细胞存活有害。
   4. 去除上清液，用 10 mL 电镀介质洗涤两次以停止消化。在每次洗涤之间让组织在重力作用下沉降。
   5. 用 P1000 移液器在 2 mL 电镀培养基中轻轻研磨，直到大块组织消失（约 20 次）。再加入 8 mL 铺板介质，使体积达到约 10 mL，并将细胞悬液通过 40 μm 细胞过滤器。
4. 电镀和维护神经元。
   1. 以 200 x g 离心 5 分钟。将细胞重悬于预热的铺板培养基中。对细胞进行计数，并在铺板培养基中稀释至 500,000 个细胞/mL。轻轻倒置以混合并转移到无菌多通道储液槽中。
   2. 从孔中吸出 neurobasal 培养基，并立即用多通道移液器（50,000 个细胞/孔）每孔添加 100 μL 细胞。不要让包被的孔干燥。
   3. 解剖 24 小时后，用补料培养基更换 50% 的培养基。继续每隔一天更换 50% 培养基，直到第 5-7 天以进行 体外 测定。

2. 核转运测定成分的制备

1. 传输缓冲区（TRB，改编自¹⁵）
   1. 要制备 5x TRB，请将 100 mM HEPES、550 mM KOAc、10 mM Mg（OAc）₂、25 mM NaOAc、2.5 mM EGTA 和 1.25 M 蔗糖溶解在 dH₂O 中。将 pH 值调节至 7.3 并将缓冲液储存在 4 °C。
   2. 在运输实验当天，准备 1x TRB-BSA。在 dH₂O 中稀释 5x TRB，加入不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物、2 mM DTT 和 50 mg/mL BSA。
2. 能量再生混合物（ERM，改编自 ^9,16）
   1. 要制备 20x ERM，请将 2 mM ATP 锂盐、2 mM GTP 锂盐、80 mM 磷酸肌酸和 400 U/mL 肌酸激酶溶解在 1x TRB 中。
   2. 在 -20 °C 下冷冻一次性等分试样。
3. 全细胞提取物（WCE，转运受体和 Ran 循环蛋白来源）的制备。
   注：根据实验目标，可以使用细胞质或全细胞提取物 （WCE）。在这里，WCE 的制备被描述为用于初始神经元转运测定¹⁰。
   1. HEK293T细胞在 15 个 150 mm 培养皿中生长至汇合。用胰蛋白酶-EDTA 分离，重悬于含有 10% 胎牛血清的培养基中以抑制胰蛋白酶，并以 200 x g 的离心沉淀细胞 5 分钟。将细胞重悬于 10 mL 冰冷的 1x TRB 中，并加入新鲜添加的蛋白酶抑制剂混合物。
   2. 使用手持式探针超声仪在冰上进行 3 x 10 次脉冲超声处理。通过在 4 °C 下以 14,000 x g 离心 15 分钟来澄清。
   3. 在 -80 °C 下储存之前，测量蛋白质浓度（目标 8-10 mg/mL）并在液氮中快速冷冻一次性等分试样。
4. 重组核进口货物
   注：步骤 3-5 中的运输方案可适用于任何荧光核运输货物，以询问感兴趣的主动或被动核运输途径。在这里，该方案描述了 Rango （Ran 调节的 importin β cargo）的表达和核输入，它由 importin α1 的输入蛋白 β 结合结构域组成，两侧是荧光蛋白 CyPet 和 YPet^14,17。Rango 是一种多功能传感器，可用于 FRET 以及核进口分析，在核进口分析中，它用作货物β直接进口。
   1. 通过热休克用 Rango 质粒（含有 N 端 6-His 标签）转化大 肠杆菌 BL21（DE3） 细胞，如下所示。在冰上解冻 50 μL 等分试样的 BL21 （DE3） 细胞。与 100-200 ng 质粒结合。敲击试管 4-5 次混合，然后在冰上孵育 30 分钟，然后放在 42 °C 板上 40 秒。立即放回冰块中再冰敷 2-5 分钟。
   2. 在室温下加入 900 μL SOC 培养基，并在摇床上于 37 °C 孵育 1 小时，然后将细胞铺展在预热的琼脂平板（1.5% 琼脂、LB 培养基、100 μg/mL 氨苄青霉素）上。将板在 37 °C 下孵育过夜。 将板在 4 °C 下储存长达 1 周或立即用于蛋白质生产。
   3. 通过在 BL21 （DE3） 板中接种 3 个 25 mL 起始培养物，并在 50 mL 试管中接种增加菌落数 （~3-10） 来开始蛋白质生产。在 37 °C 下在摇床上孵育过夜后，选择 OD_{为 600 nm} < 1.0 的培养物，使用 2.8 L 无挡板 Fernbach 培养瓶在 LB 培养基中接种 1L 培养物。在 37 °C 下生长直至达到 OD_{600 nm} = 0.1-0.3。
      注：使用较旧的 BL21（DE3） LB 琼脂平板或高密度发酵剂培养物 （OD_{600 nm} >1.0） 可能会降低蛋白质制备物的产量和纯度。
   4. 置于冰上冷却至室温 （22-25 °C）。用 0.3 mM IPTG（终浓度）诱导蛋白质表达，并在室温下在振荡器 （80-120 rpm） 上孵育 12-14 小时。
   5. 通过离心（6,000 x g，15 分钟，4 °C）收集细胞，并重悬于 30 mL 冰冷的 10 mM 咪唑的 PBS 溶液（pH 7.4）中，补充有不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物。裂解两次，通过冰冷的法国压力池，并通过离心（16,000 x g ，40 分钟，4 °C）澄清裂解物。
   6. 将裂解物与高流速镍亲和琼脂糖树脂（30-60 分钟，4 °C）一起孵育，每 1 L 大肠杆菌 培养物使用 1 mL 树脂。将树脂放入色谱柱中，用 10-20 体积的冰冷的 10 mM 咪唑/PBS （pH 7.4） 洗涤。以 25 mM 咪唑/PBS 增量（25-200 mM，pH 7.4）洗脱 Rango，每一步使用 5 倍柱床体积。
   7. 使用 SDS-PAGE 选择并合并纯度最高的批次。
   8. 通过将 10 mM HEPES、100 mM KCl、10 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂ 和 50 mM 蔗糖溶解在 dH₂O 中来制备 XB 缓冲液。将 pH 值调节至 7.7。
   9. 在 XB 缓冲液中透析蛋白质，并在截留分子量为 30 kD 的超滤装置上离心（7500 x g ，4 °C）浓缩。
   10. 通过 Bradford 或其他首选方法测量蛋白质浓度，并在 -80 °C 下储存前在液氮中快速冷冻一次性等分试样。

3. 确定最佳质膜透化条件

注意：由于每批神经元之间存在差异，请优化每批神经元的透化条件。在进行核转运测定前的同一天执行此作。

1. 在塑料 96 孔分期板中，制备 0 μM、10 μM、20 μM 和 40 μM 的 Tris-HCl pH 7.5（引起渗透膨胀）的连续稀释液，三种 BSA 浓度分别为：50 mg/mL、100 mg/mL 和 150 mg/mL（用于分子拥挤/机械支撑）。将溶液预热至 37 °C。
2. 在预热的 PBS 中冲洗神经元一次。取出 PBS 并从暂存板中转移 Tris/BSA。返回培养箱 4 分钟。
3. 从培养箱中取出，将培养板放在冰上。在 1x TRB-BSA 中冲洗 2 x 5 分钟（如步骤 2.1.2 中制备）。
4. 最后一次冲洗后，在 1x TRB-BSA 中加入 70 kD 的德克萨斯红标记的葡聚糖 （0.6 mg/mL） 和 Hoechst （1：10,000）。将板在室温下放在工作台上 15 分钟，避光。
5. 使用共聚焦显微镜成像以识别缓冲液和 BSA 浓度，其中质膜透化百分比最高，但核膜仍然限制 70 kD 葡聚糖的进入（目标≥ 80%）。将这些条件用于后续实验。

4. 核输入试验

1. 准备转运反应
   注：为了使板中的所有反应能够同时开始，请在神经元透化之前，在冰上的塑料 96 孔暂存板中制备反应混合物。每种条件至少执行两次技术重复。在每个板上包括对照。
   1. 在 1x TRB-BSA 中制备由 2.5 mg/mL WCE、1x ERM、荧光货物（200 nM Rango）和 Hoechst 33342（10 mg/mL，1：10,000）组成的基础反应混合物，每孔足够 50 μL。选项：包括 70 kD Texas 红色标记的葡聚糖，以允许在整个运输反应过程中监测核孔完整性，请记住，需要共聚焦显微镜来对核葡聚糖排除进行成像。
      注：提供的 WCE 浓度是分析优化的合理起点。对每批 WCE 进行实证测试，以确定所需货物高效核进口所需的最佳浓度。避免合并使用不同批次的 WCE 制备的重复数据，因为导入效率可能会有所不同。
   2. 准备对照，包括 （1） 单独货物：Rango，但没有 WCE 或 ERM 和 （2） 抑制剂：荧光货物、ERM、WCE 和 100 μM importazole（IPZ，importin β¹⁸ 的小分子抑制剂）。作为替代抑制剂，使用 0.8 mg/mL 小麦胚芽凝集素 （WGA）¹⁹。
      注：在开始运输之前，将含有 WCE 的测定混合物中的抑制剂平衡至少 30 分钟。为了获得最大的抑制效果，相应孔中的透化后冲洗步骤也应包括抑制剂。
2. 透化和冲洗神经元
   1. 根据步骤 3 中确定的最佳、批次特异性方案透化神经元。
   2. 从培养箱中取出培养板，并立即将其置于冰上。在 1x TRB-BSA 中冲洗 2 次 5 分钟。在指定孔的冲洗液中加入抑制剂。
3. 运行 transport 反应。
   1. 最后一次冲洗后，去除 1x TRB-BSA。使用多通道移液器（50 μL/孔）将预混的转运反应转移到透化细胞上，快速工作。
   2. 立即在室温下将板加载到高内涵显微镜中以开始延时成像（参见步骤 4.4）或将板放在工作台上，避光，并让反应进行所需的时间段（例如，30-120 分钟）在固定和成像之前。
   3. 如果需要，在 4% 多聚甲醛/PBS 中固定 15 分钟，在 PBS 中冲洗 2 次 5 分钟，然后转移到 50% 甘油/PBS 中用于后续成像。将固定板在 4 °C 下避光保存（稳定长达 1 周或更长时间）。
4. 实时成像
   注意：在此阶段应用任何首选的图像采集和分析方法。
   1. 将板加载到高内涵显微镜中。在运行实验样品之前，运行初始测试板以优化和保存成像参数，包括放大倍率、聚焦、曝光时间（Hoechst 和 FITC）和间隔。保存参数以重新加载每个后续板。
      注：对于定量分析，请将荧光进口货物 （FITC） 的曝光时间设置为远低于稳态或要使用的最晚时间点的饱和度。使用测试板确定这一点，以半最大饱和度为目标，以允许不同实验条件下的强度变化。收集每个帧和时间点的 Hoechst 图像，以便在随后的自动分析期间进行核识别。
   2. 如果需要，使用 Hoechst 作为焦点波长调整焦点偏移并运行成像协议。每 5 分钟收集一次图像，持续 30 分钟。根据感兴趣的导入反应的成像速度和动力学，根据需要调整间隔和反应时间。

5. 图像分析

1. 在显微镜 Review Plate 对话框中，打开来自代表性框架的 Hoechst 和 FITC 图像。在 Run Analysis （运行分析 ） 选项卡下，选择 Translocation-Enhanced module（Translocation-Enhanced 模块），然后配置设置。将 Hoechst 设置为区间映像，将 FITC 设置为易位探测映像。
2. 在隔间下，调整近似的核宽度、局部背景以上的强度和最小/最大面积。激活 Auto Separate Touching Compartments， 因为神经元倾向于聚集。通过选择 Test Run （测试运行） 来查看结果。调整设置以最大限度地提高神经元核识别的准确性，同时限制错误包含非神经元核或碎片。
   注意：如果存在神经胶质细胞污染，通常可以根据细胞核大小在此步骤中排除。确定最佳区室鉴定设置是准确性和细胞数量之间的权衡，必须根据检测、细胞类型和培养密度根据经验进行设置。严格的参数将省略大量单元格，但包含的误差较少，而自由参数将更具包容性，但包含更多的错误。如果包括可能影响细胞核大小的不同细胞群（即疾病突变体）或处理，我们建议设置足够宽的大小/强度参数以适应所有条件，以避免在实验中需要多个参数集。
3. 为避免来自核边缘的伪影，请在 Hoechst 染色定义的隔室边缘内部和外部定义几个像素的测量区域。根据放大倍率和像素合并，为内部区域距离设置 2-4 像素，为外部区域距离设置 1-2 像素。调整外部区域宽度（1-2 像素）。
4. 选择所需的背景估计方法（建议使用默认的 Auto Constant 方法）。在 Configure data log （配置数据日志） 中，选择所需的输出参数，包括平均内部强度、平均外部强度和内部/外部平均强度（细胞核与细胞质 （N/C） 比率）。保存分析参数。
   注意：强烈建议在每个实验中包括内部阳性和阴性对照，以确保参数最大限度地提高检测感兴趣生物事件的灵敏度。
5. 使用 Plate Utilities 对话框，使用保存的参数在所需的板上运行分析并导出测量值。
6. 按处理条件查看和总结数据。选项：应用过滤器以删除非生理数据，例如探针强度 = 0 和 N/C 比率的极值（即 <0.1 和 >100）。在所有条件和实验中均等地应用任何筛选条件。
7. 作为基线荧光的附加校正，将数据归一化到省略裂解物和 ER 的对照孔中。为了便于生物学重复（即独立的神经元培养制备）之间的比较，将最终核输入数据表示为时间 0 的百分比。

质膜的选择性透化（图 1A）是该方案中最关键的步骤，必须在进行核输入分析之前进行验证。由于每种培养制剂之间存在差异，因此通常会运行初始滴定板，以确定低渗 Tris-HCl 缓冲液和 BSA 缓冲垫的最佳批次特异性浓度，如步骤 3 所述。由于缺乏 70 kD 葡聚糖渗透到细胞质区室或分别存在于细胞质区室和细胞核区室内，因此透化不足和过度透化的细?...

上面详述的方案提供了一种可靠且可重复的方法，用于选择性透化原代小鼠皮层神经元的质膜以进行核输入分析。这里显示了直接输入β货物 （Rango） 的核输入分析方法的应用，但相同的方法可用于分析各种荧光货物的被动和主动输入。透化能够以完整细胞中不可行的方式精确纵转运反应，正如我们最近对 ALS 和 FTD¹⁴ 相关的突变 C9orf72 二肽重复蛋...

作者没有什么可披露的。

这项工作得到了 NINDS K08NS104273（对 L.R.H.）的支持。