İnsan Doğal Öldürücü Hücre Reseptörü-Ligand Repertuarının Profillenmesi

Burada, iki tamamlayıcı kütle sitometrisi (CyTOF) paneli tasarlıyoruz ve viral enfeksiyonların ortamında doğal öldürücü hücre reseptörünü ve ligand repertuarını profillemek amacıyla bir CyTOF boyama protokolünü optimize ediyoruz.

Doğal öldürücü (NK) hücreler, viral enfeksiyonlara ilk yanıt verenler arasındadır. NK hücrelerinin viral olarak enfekte olmuş hücreleri hızlı bir şekilde tanıma ve öldürme yeteneği, germ hattı kodlu inhibitör ve aktive edici reseptörlerin ekspresyonu ile düzenlenir. Bu reseptörlerin aynı kökenli ligandları tarafından hedef hücreler üzerindeki angajmanı, hücreler arası etkileşimin NK hücre öldürmesine yol açıp açmayacağını belirler. Bu protokol, iki tamamlayıcı kütle sitometrisi (CyTOF) panelinin tasarımını ve optimizasyonunu detaylandırır. Bir panel, reseptör ekspresyonuna dayalı olarak NK hücrelerini fenotiplemek için tasarlanmıştır. Diğer panel, çeşitli bağışıklık hücresi alt kümelerinde NK hücre reseptörleri için bilinen ligandların ekspresyonunu sorgulamak için tasarlanmıştır. Birlikte, bu iki panel, insan NK hücre reseptörü-ligand repertuarının profillenmesine izin verir. Ayrıca, bu protokol aynı zamanda CyTOF için numuneleri boyama sürecini de detaylandırır. Bu süreç, gelişmiş tekrarlanabilirlik ve standardizasyon için optimize edilmiştir. CyTOF'un bir avantajı, araştırmacıların NK hücre reseptörü-ligand repertuarının genişliğini yakalamasına olanak tanıyan, minimum sinyal örtüşmesi ile her panelde 40'tan fazla işaretleyiciyi ölçme yeteneğidir. Paladyum barkodlama ayrıca numuneler arası varyasyonun yanı sıra reaktif tüketimini de azaltarak numunelerin her bir panelle paralel olarak boyanmasını kolaylaştırır. Bu protokolün sınırlamaları arasında CyTOF'un nispeten düşük verimi ve analizden sonra hücrelerin kurtarılamaması yer alır. Bu paneller, dang virüsü, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ve grip dahil olmak üzere akut ve kronik viral enfeksiyonlardan muzdarip hastalardan alınan klinik örneklerin analizi için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, insan NK hücre reseptörü-ligand repertuarını araştırmak için herhangi bir ortamda kullanılabilirler. Daha da önemlisi, bu yöntemler gelecekteki CyTOF panellerinin tasarımına ve yürütülmesine geniş çapta uygulanabilir.

Doğal öldürücü (NK) hücreler, birincil rolü kötü huylu, enfekte veya başka bir şekilde stresli hücreleri hedeflemek ve öldürmek olan doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir. IFNγ ve TNFα gibi sitokinlerin salgılanması ve sitotoksik aktiviteleri sayesinde, NK hücreleri ayrıca patojenlere ve malignitelere karşı adaptif bağışıklık tepkisini de şekillendirebilir. NK yanıtına kısmen, potansiyel hedef hücreler üzerinde eksprese edilen sayısız ligandı bağlayan germ hattı kodlu inhibitör ve aktive edici reseptörlerin kombinatoryal sinyalizasyonu aracılık eder. Birkaç NK hücre reseptörü, düzenli olarak tanımlanan yeni reseptör-ligand çiftleri ile birden fazla liganda sahiptir.

NK hücrelerinin, stresli hücrelere hızlı bir şekilde yanıt verme yeteneklerinin viral yayılmayı sınırlayabileceği veya NK hücresinden kaçınma stratejilerinin geliştirilmesini teşvik edebileceği viral enfeksiyonlar bağlamında incelenmesine özel bir ilgi vardır. NK hücre biyolojisine olan bu ilgi, araştırmacıların NK hücrelerinin tümör immünosürveyansında ve tümör mikroçevresindekiler rolünü araştırdıkları kanser immünoterapisi alanına kadar uzanmaktadır¹. Bununla birlikte, NK hücresi-hedef hücre etkileşimlerinin profilini çıkarma yeteneği, insan NK hücrelerinin 30'dan fazla reseptörü eksprese edebilmesi ve bunun da 30'dan fazla bilinen ligand ile etkileşime girebilmesi nedeniyle karmaşıktır². Bu nedenle, çoklu NK hücre reseptörlerinin ve bunların akraba ligandlarının eşzamanlı tespiti, NK fonksiyonunu kontrol eden reseptör-ligand etkileşimlerinin karmaşıklığını yakalamak için gereklidir. Sonuç olarak, tek hücre düzeyinde 40'tan fazla markörün aynı anda tespit edilmesini sağlayan kütle sitometrisine (CyTOF) döndük. Amacımız, NK hücre reseptörü-ligand repertuarının profilini çıkarmak için iki CyTOF paneli oluşturmaktı. Ayrıca klinik numunelerin etkili bir şekilde işlenmesi ve boyanması için bir protokol tasarlamak istedik. Klinik insan örnekleri, vücudun viral enfeksiyona nasıl tepki verdiği hakkında zengin bilgiler sağlar. Bu nedenle, daha iyi standardizasyon, daha iyi geri kazanım, daha az reaktif tüketimi ve sınırlı parti etkileri için NK hücre reseptörlerinin ve bunların aynı kökenli ligandlarının ekspresyonunu paralel olarak araştırmak için bu protokolü geliştirdik.

İnsan NK hücrelerinin fenotipini karakterize etmek için tasarlanmış çeşitli akış sitometri panelleri daha önce^{yayınlanmıştır} 3,4,5,6,7,8. Bu panellerin çoğu, reseptör-ligand repertuarının genişliğini yakalama yetenekleri bakımından sınırlıdır ve yalnızca sınırlı bir işaretleyici seçiminin tespit edilmesine izin verir. Ayrıca, bu paneller florokromlar arasındaki sinyal örtüşmesi ile sınırlıdır. CyTOF, uçuş zamanı kütle spektrometresi ile okunan metal izotoplarına konjuge antikorlar kullanır ve böylece kanallar arasındaki yayılmayı önemli ölçüde azaltır.

Bizim gibi, diğer araştırmacılar da NK hücreleri 9,10,11,12,13,14'ü incelemek için CyTOF'a başvurdular, ancak genellikle daha az NK hücre markörü vardı, bu da fenotipleme derinliğini azaltıyor. Bu gruplar tarafından kullanılan genel boyama protokolleri bizimkine benzer olsa da, bazı önemli farklılıklar vardır. Diğer protokoller, araştırmacılar sadece bu alt küme^13,14 ile ilgilenseler de, boyamadan önce NK hücrelerinin izole edilmesini içermez. NK hücrelerinin periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) sadece% 5-20'sini oluşturduğu göz önüne alındığında, izole edilmiş NK hücreleri yerine tüm PBMC'lerin boyanması, toplanan olayların çoğunun NK hücreleri olmayacağı anlamına gelir. Bu, ilgilenilen alt kümede oluşturulan veri miktarını azaltır ve makine zamanının verimsiz kullanımına neden olur. Ek olarak, bu panellerin çoğu, öldürücü Ig benzeri reseptörler (KIR'ler), NKG2A/C/D ve doğal sitotoksisite reseptörleri (NKp30, NKp44 ve NKp46) gibi NK hücre reseptörlerinin ekspresyonunu sorgularken, bu belirteçlerin ekspresyonu, ilgili ligandlarının ekspresyonu hakkında veri olmaması nedeniyle daha geniş bir bağlama yerleştirilmemiştir. Sonuç olarak, CyTOF yoluyla NK hücrelerini araştırmak için daha önce yayınlanmış bu yöntemler, izolasyonda kullanılan geniş NK hücre fenotiplemesi için yeterli olsa da, NK hücre aktivitesinin kapsamlı bir resmini sağlayamazlar. Bu bizi burada açıklanan yöntemlerin en büyük avantajına getiriyor, bu da bu noktaya kadar NK hücre reseptörleri için ligandların ekspresyonunu keşfetmeye odaklanan yayınlanmış bir akış sitometrisi veya CyTOF panelinin olmamasıdır. Daha da önemlisi, ligand panelimiz, her deneyin benzersiz ihtiyaçlarına uygun işaretleyicilerin eklenmesine izin vermek için birkaç açık kanala sahiptir.

CyTOF'un ana sınırlamalarından birinin, analizden sonra numunenin geri kazanılamaması olduğu göz önüne alındığında, bu yöntem, ek deneyler yapmakla ilgilendikleri sınırlı numuneye sahip araştırmacılar için uygun olmayabilir. Ek olarak, CyTOF'un düşük verim doğası, başlangıç hücre sayısı düşükse üretilen verilerin düşük kalitede olacağı anlamına gelir. Bu iki sınırlama dışında, bu yöntem NK hücreleri ve hedef hücreler arasındaki reseptör-ligand etkileşimlerini araştırmak için herhangi bir ortamda iyi performans gösterecektir.

Anonimleştirilmiş sağlıklı yetişkin PBMC'ler, Stanford Kan Merkezi'nden satın alınan lökoredüksiyon sistem odalarından elde edildi. Kimliği gizlenmiş sağlıklı pediatrik donörlerden ve pediatrik akut dang hastalarından elde edilen PBMC'ler, Panama City, Panama'daki Gorgas Memorial Sağlık Araştırmaları Enstitüsü'nden ve Sağlık Bakanlığı'na ait hastanelerden, Panama City'deki Sosyal Güvenlik Sisteminden ve banliyö bölgelerinden elde edildi. Dang humması çalışma protokolü, Hospital del Niño'nun IRB'si (CBIHN-M-0634) tarafından onaylandı, daha sonra ICGES, CSS, Santo Tomas Hastanesi ve Stanford Üniversitesi komiteleri tarafından onaylandı. Antiretroviral tedavi gören HIV ile enfekte hastalardan alınan PBMC'ler ACTG çalışması A5321'den elde edildi.

1. Antikor etiketleme, panel hazırlama ve depolama

1. Metal izotopları ile antikor etiketleme
   NOT: Boyamanın deneyler arası standardizasyonunu artırmak için, her bir antikor için birden fazla konjugasyon yapılması ve ardından ürünlerin aşağıda açıklandığı gibi uzun süreli depolama için tek bir ana karışımda birleştirilmesi önerilir.
   1. Konjugasyondan önce 280 nm'de absorbansı ölçerek her bir antikorun konsantrasyonunu belirleyin. Bu protokol için kullanılan antikorlar ticari olarak temin edilebilir ve Malzeme Tablosunda listelenen satıcılardan satın alınmıştır.
   2. Üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen antikor etiketleme kitlerini kullanarak antikorları metal izotoplarla etiketleyin. Her reaksiyon için 100 μg antikor kullanın.
   3. 280 nm'de absorbansı ölçerek geri kazanılan antikorun nihai konsantrasyonunu belirleyin. Antikorları kısa süreli olarak 4 °C'de saklayın.
2. Antikor titrasyonları
   NOT: CyTOF teknolojisi, çevresel metallerden gelen potansiyel kirletici sinyallere karşı çok hassastır. Bu nedenle, kullanılan tüm tamponlar/reaktifler ultra saf su ile hazırlanmalı ve hiç sabunla yıkanmamış plastik veya cam kaplarda saklanmalıdır.
   1. Çözülecek PBMC'lerin şişesi başına 9 mL ılık, tam RPMI (RPMI 1640, %10 FBS, %1 L-glutamin, %1 penisilin / streptomisin) ve 20 μL benzonaz içeren her donör için santrifüj tüpleri hazırlayın. PBMC'leri bir su banyosunda çözdürün ve tüplere ekleyin.
      NOT: Benzonaz, parçalanmış hücrelerden elde edilen serbest DNA'dan viskoziteyi ve arka planı azaltır.
   2. Oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. PBMC'leri 5 mL tam RPMI ortamında yeniden askıya alın ve sayın.
   3. Her panel titrasyonu için, yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakanın 6 oyuğunda (her titre için bir kuyucuk ve lekelenmemiş için bir kuyucuk) 2-4 milyon PBMC/kuyucuk plakalayın. Plakayı oda sıcaklığında 600 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarmak için plakayı hafifçe vurun. Her kuyucuğu 200 μL CyPBS'de yeniden süspanse edin.
   4. Aşağıda açıklandığı gibi sisplatin canlılık boyaması gerçekleştirin.
      NOT: Sisplatin, kütle sitometrisinde canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için kullanılır.
      1. 100 μL'lik 25 μM sisplatin stoğundaki hücreleri yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
      2. Her kuyucuğa 100 μL FBS ekleyerek ve karıştırarak sisplatin reaksiyonunu söndürün. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
         NOT: Sonraki tüm santrifüj adımlarını 4 °C'de gerçekleştirin.
      3. Hücreleri 200 μL CyFACS ile iki kez yıkayın (% 0.1 BSA,% 0.05 sodyum azid içeren ultra saf suda ağır metal kirleticileri içermeyen 1x PBS). Her seferinde plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
   5. Yüzey antikor panelini aşağıda açıklandığı gibi titre edin.
      NOT: NK yüzey paneli ve ligand paneli için ayrı ana karışımlar yapılmalıdır.
      1. CyFACS kullanarak 10 μg/mL konsantrasyonda tüm yüzey antikorlarının ana karışımını yapın. Aşağıdaki konsantrasyonları elde etmek için CyFACS kullanarak seri 1: 2 seyreltmeler yapın: 10, 5, 2.5, 1.25 ve 0.625 μg / mL.
      2. Antikor kokteyllerini, boyamadan önce 3 dakika boyunca 10.600 x g'da bir santrifüj filtre ünitesinden (0.1 μm gözenek boyutu) süzün.
      3. Kaplanmış hücreleri, ilgili titrede 50 μL yüzey antikor kokteyli içinde yeniden süspanse edin. CyFACS'ta lekelenmemiş kuyuyu yeniden askıya alın. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      4. Hücreleri 150 μL CyFACS ile yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
      5. Hücreleri 200 μL CyFACS ile yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
   6. CyPBS'de her bir oyuğu 100 μL %2 paraformaldehit (PFA) içinde yeniden süspanse ederek hücrelerin fiksasyonunu gerçekleştirin. Plakayı oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika inkübe edin. Hücreleri 100 μL CyFACS ile yıkayın. 700 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
      DİKKAT: PFA'nın kanserin yanı sıra genetik kusurlara da neden olduğundan şüphelenilmektedir. Ek olarak, gözlerle, ciltle temas etmesi veya solunması zararlıdır. İyi havalandırma sağlayarak, hazneyi dikkatli bir şekilde açarak ve aerosol oluşumunu önleyerek uygun şekilde kullanın.
      NOT: Sonraki tüm santrifüj dönüşleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 700 x g'de gerçekleştirilir.
   7. Ultra saf suda seyreltilmiş 200 μL 1x Geçirgenleştirme Tamponu (Perm tamponu) içinde yeniden süspanse ederek hücreleri geçirgen hale getirin. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun. Hücreleri 200 μL Perma tamponu ile yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
      NOT: Perma tamponunda inkübasyon gerekli değildir.
   8. Hücre içi antikor paneli titrasyonu
      1. Perm Buffer kullanarak 10 μg/mL konsantrasyonda tüm hücre içi antikorların ana karışımını yapın. Aşağıdaki konsantrasyonları elde etmek için Perm Buffer kullanarak seri 1: 2 seyreltmeler yapın: 10, 5, 2.5, 1.25 ve 0.625 μg / mL.
      2. Antikor kokteyllerini, boyamadan önce 3 dakika boyunca 10.600 x g'da bir santrifüj filtre ünitesinden (0.1 μm gözenek boyutu) süzün.
      3. Kaplanmış hücreleri, ilgili titrede 50 μL hücre içi antikor kokteyli içinde yeniden süspanse edin. Lekelenmemiş kuyuyu Perm Tamponunda yeniden süspanse edin. 4 °C'de 45 dakika inkübe edin.
         NOT: Hücre içi bir panel titre edilmeyecekse, kuyucukları 50 μL Perm tamponunda yeniden süspanse edin.
      4. Hücreleri 150 μL Perma tamponu ile yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
      5. Hücreleri 200 μL Perma tamponu ile yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
      6. Hücreleri 200 μL CyFACS ile iki kez yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
   9. DNA interkalatör boyama
      NOT: İnterkalatör, hücresel nükleik aside bağlanır ve kütle sitometrisinde çekirdekli hücreleri tanımlamak için kullanılır.
      1. CyPBS ve% 2 PFA'da 1: 10.000 seyreltilmiş 200 μL interkalatör içindeki hücreleri yeniden askıya alın. Plakayı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
      2. Gerekirse plakaları 4 °C'de parafin film ile kaplı olarak bir haftaya kadar saklayın.
         NOT: Sonraki tüm santrifüj adımlarını 700 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da gerçekleştirin.
      3. Numuneleri CyTOF üzerinde çalıştırmadan önce, parafin filmi plakadan çıkarın ve 700 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Plakayı hafifçe vurun. Hücreleri 200 μL CyFACS ile bir kez yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
      4. Hücreleri 200 μL ultra saf su ile üç kez yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun. Hücreleri 200 μL ultra saf suda yeniden süspanse edin. Numuneyi çalıştırmadan hemen önce, ultra saf suda 1x konsantrasyona seyreltilmiş normalizasyon boncuklarında konsantrasyonu yaklaşık 6 x^{10 5} hücre/mL'ye ayarlayın.
   10. Örnekleri CyTOF'ta çalıştırın.
   11. Verileri analiz edin ve görsel değerlendirmeye dayalı olarak en yüksek sinyal yoğunluğu ve pozitif ve negatif popülasyonlar arasında en iyi ayrım ile sonuçlanan en düşük antikor titresini seçerek her antikor için uygun titreleri seçin.
       NOT: NK ve ligand panelleri için titrasyonlar sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Pozitif ve negatif popülasyonlar arasında net bir ayrım tanımlanmazsa, titreler hem pozitif hem de negatif hücre popülasyonlarının tanımlanmasına izin vermek için birden fazla hücre tipinde veya hücre hatlarında değerlendirilebilir.
   12. Antikor paneli saklama
       1. Titre edilmiş antikorları bir ana karışımda birleştirin ve steril bir 0,1 μm şırınga filtre ünitesinden süzün. NK yüzey paneli, NK hücre içi panel ve ligand paneli için ayrı ana karışımlar yapılmalıdır.
       2. Panellerin uzun süreli depolanması için kabul edilebilir iki seçenekten birini izleyin:
       3. Ana karışımı liyofilizasyon için üçüncü taraf bir şirkete gönderin. Bu yöntem NK paneli için kullanılır. Kurum içinde konjuge edilmeyen antikorlar, liyofilizasyon sürecine müdahale eden antikor stabilizatörünün varlığı nedeniyle liyofilize edilemez. Bu antikorlar lekelenme günü panele eklenir.
       4. Her bir ana karışımdan 50 μL alikot yapmak için bir tekrarlayıcı pipet kullanın ve bunları -80 °C'de saklayın.

2. Boyama protokolü

1. Periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) adım 1.2.1 ve 1.2.2'de açıklandığı gibi çözün. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde ligand panel boyama için en az 1 milyon PBMC ayırın. NK hücre izolasyonu sırasında bu PBMC'leri buz üzerinde tutun.
2. NK hücre izolasyonu
   NOT: Aşağıdaki NK hücre izolasyon adımları, belirli bir satıcının protokolünün değiştirilmiş bir sürümüdür. Bununla birlikte, NK hücrelerinin manyetik tabanlı negatif seçimini gerçekleştiren herhangi bir kit veya protokol uygun bir alternatif olacaktır. Ek olarak, bu protokol tüm PBMC'lerden NK hücrelerinin fenotiplenmesi için de uygun olduğundan bu adım isteğe bağlıdır.
   1. Kalan PBMC'leri 450 x g'da 5 dakika döndürün. Hücre peletini 10 7 toplam hücre başına 40 μL MACS tamponunda (PBS,%^0.5 BSA, 2 mM EDTA) yeniden süspanse edin.
   2. Toplam 10⁷ hücre başına 10 μL NK hücresi Biotin-Antikor Kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
   3. 10⁷ toplam hücre başına 30 μL MACS tamponu ve 10⁷ toplam hücre başına 20 μL NK hücre Mikro Boncuk Kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
   4. 500 μL MACS tamponu ile durulayarak elüsyon kolonlarını hazırlayın. 15 mL toplama tüplerine 2 mL soğuk tam RPMI ekleyin.
   5. Hacmi 500 μL'ye çıkarmak için hücre içeren tüplere MACS tamponu ekleyin. 500 μL'lik hacmin tamamını hazırlanan elüsyon kolonuna pipetleyin. Tüpü başka bir 500 μL MACS tamponu ile durulayın ve kolona aktarın.
   6. Akış durduktan sonra, elüsyon kolonunu 500 μL MACS tamponu ile iki kez durulayın. Akış durduktan sonra NK hücrelerini sayın.
3. Plaka ve yıkama hücreleri.
   1. İzole edilmiş NK hücrelerini ve PBMC'leri oda sıcaklığında 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. CyPBS'de 5 milyon hücre / mL konsantrasyonda hücreleri yeniden süspanse edin (ultra saf suda ağır metal kirleticileri olmadan 1x PBS). U tabanlı, 96 oyuklu bir plakadaki plaka hücreleri.
      NOT: NK hücre panelinin her bir alikotu 3 milyona kadar hücreyi lekeleyebilir. Boyamadan önce altı ayrı NK hücre numunesi barkodlanıyor ve havuzlanıyorsa, toplam NK hücresi sayısı 3 milyonu geçmemelidir. Ligand paneli, numune başına 6 milyona kadar PBMC'yi lekeleyebilir. Boyamadan önce altı ayrı numune barkodlanıyor ve bir araya getiriliyorsa, toplam PBMC sayısı 6 milyonu geçmemelidir.
   2. Santrifüj plakası 600 x g'da oda sıcaklığında 3 dakika. Süpernatanı çıkarmak için plakayı hafifçe vurun.
      NOT: Sonraki tüm santrifüj dönüşlerini 600 x g'da 3 adım 2.7'ye kadar gerçekleştirin.
   3. Hücreleri 200 μL CyPBS'de yeniden süspanse edin. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
4. Adım 1.2.4'te açıklandığı gibi sisplatin canlılık boyamasını gerçekleştirin.
5. Barkodlama boyama
   NOT: Bu paneller, toplu etkileri en aza indirmek ve hücre geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için canlı sabitlenmemiş hücreler üzerinde modifiye edilmiş dörtte iki, Paladyum bazlı barkodlama yöntemi ile birlikte kullanılır¹⁵. Ancak, kaliteli veri elde etmek için barkodlama gerekli olmadığından bu adım isteğe bağlıdır.
   1. Her bir kuyucuğu 50 μL'lik ilgili önceden karıştırılmış barkodda yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri 150 μL CyFACS ile yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
   2. Hücreleri 200 μL CyFACS ile iki kez yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun. Tüm kuyucukları 30 μL CyFACS'ta yeniden askıya alın. Benzersiz barkodlarla boyanmış altı adede kadar hücre kuyusunu tek bir kuyuda birleştirin ve plakanın santrifüjlenmesini ve hafifçe vurulmasını gerçekleştirin.
6. Yüzey boyama
   1. Yüzey NK panel liyosferini 50 μL CyFACS'ta (anti-CD16, anti-HLA-DR, anti-LILRB1) ek yüzey antikorları ile çözün. -80 ° C'de saklanan ligand panelini çözün ve bir mini santrifüj kullanarak tüpü döndürün. Ek ligand panel yüzey işaretleyicilerinde ani artış (anti-CD16, anti-CD19).
      NOT: Daha önce filtrelenmemiş herhangi bir antikor kokteyli (yani, liyofilizasyon veya dondurmadan önce), boyamadan önce 3 dakika boyunca 10.600 x g'de bir santrifüj filtre ünitesinden (0.1 μm gözenek boyutu) süzülmelidir.
   2. Her bir kuyucuğu ilgili panelin 50 μL'sinde yeniden askıya alın. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri 150 μL CyFACS ile yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun. Hücreleri tekrar 200 μL CyFACS ile yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
7. Hücreleri adım 1.2.6'da açıklandığı gibi düzeltin.
   NOT: Sonraki tüm santrifüj dönüşlerini 700 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da gerçekleştirin.
8. Hücreleri adım 1.2.7'de açıklandığı gibi geçirgen hale getirin.
9. Hücre içi lekelenme
   1. Hücre içi NK panel liyosferini 50 μL Perm tamponunda çözün. İstenirse PBMC örnekleri için hücre içi bir antikor kokteyli hazırlayın.
      NOT: Daha önce filtrelenmemiş herhangi bir antikor kokteyli (yani, liyofilizasyon veya dondurmadan önce), boyamadan önce 3 dakika boyunca 10.600 x g'de bir santrifüj filtre ünitesinden (0.1 μm gözenek boyutu) süzülmelidir.
   2. İlgili hücre içi panellerin 50 μL'sindeki kuyuları yeniden askıya alın. Ligand yüzey paneli ile birlikte bir hücre içi panel kullanılmıyorsa, PBMC kuyularını 50 μL Perm tamponunda yeniden süspanse edin. 4 °C'de 45 dakika inkübe edin.
   3. Hücreleri 150 μL Perma tamponu ile yıkayın. Santrifüj ve fiske plakası. Hücreleri 200 μL Perma tamponu ile yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
   4. Hücreleri 200 μL CyFACS ile iki kez yıkayın. Plakayı santrifüjleyin ve hafifçe vurun.
10. DNA interkalatör boyama. Adım 1.2.9.1'de açıklandığı gibi DNA interkalatör boyamayı gerçekleştirin. Plakayı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    NOT: İnterkalatör, hücresel nükleik aside bağlanır ve kütle sitometrisinde çekirdekli hücreleri tanımlamak için kullanılır. Plakalar parafin film ile kaplı olarak 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
11. Numuneleri CyTOF'ta çalıştırmadan önce, hücreleri 1.2.9.3 ve 1.2.9.4 adımlarında açıklandığı gibi yıkayın.
12. Örnekleri CyTOF'ta çalıştırın.

Antikorlar, üreticinin talimatlarına göre, ticari olarak temin edilebilen etiketleme kitleri kullanılarak metal izotoplarına konjuge edildi. Antikor klonları, bu panelde kullanılmadan önce akış sitometrisi ve kütle sitometrisi ile doğrulandı. Literatürün gözden geçirilmesine ve antikor mevcudiyetine dayalı olarak ilk klon listesi seçildi. NK hücre reseptörleri için bazı ligandların ekspresyon seviyeleri, sağlıklı PBMC'lerde dü?...

Burada, NK hücre reseptörü-ligand repertuarının profilini çıkarmayı amaçlayan iki tamamlayıcı CyTOF panelinin tasarımını ve uygulamasını açıklıyoruz. Bu protokol, kaliteli veri elde etmek için kritik olan birkaç adım içerir. CyTOF, antikorlar¹⁹ için etiket probları olarak florokromlar yerine ağır metal iyonları kullanır. Bu nedenle bu teknoloji, çevresel metallerden²⁰ gelen potansiyel kirletici sinyallere tabid...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Yazarlar, bu panele katkıda bulunan Blish Laboratuvarı'nın tüm mevcut ve eski üyelerine teşekkür eder. AIDS Klinik Araştırmalar Grubu ve ACTG A5321 ekibinin yanı sıra Gorgas Memorial Sağlık Araştırmaları Enstitüsü'nden Dr. Sandra López-Vergès ve Davis Beltrán'a numune kürlemesi için teşekkür ederiz. Son olarak, Michael Leipold, Holden Maecker ve Stanford İnsan Bağışıklık İzleme Merkezi'ne Helios makinelerini kullandıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH U19AI057229, NIH R21 AI135287, NIH R21 AI130532, NIH DP1 DA046089 ve Burroughs Wellcome Fund Araştırmacıları tarafından Enfeksiyon Hastalıklarının Patogenezinde #1016687 CB, NIH Ruth L. Kirschstein Kurumsal Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü T32 AI007502, TL1 TR001084 ve NIH/NIAID K08 AI138640 EV, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu DGE-1656518 JM ve NIH eğitim hibesi T32-AI-007290 (PI Olivia Martinez) tarafından desteklenmiştir. ACTG çalışması, AI-68634 (İstatistik ve Veri Yönetim Merkezi), UM1-A1-26617, AI-131798 ve AI-68636 (ACTG) tarafından hibe desteği aldı. CB, Stanford Anne Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü'nden Pediatrik Translasyonel Tıp alanında Tashia ve John Morgridge Fakültesi Araştırmacısı ve Chan Zuckerberg Biohub'ın Araştırmacısıdır.