Profilage du répertoire des récepteurs et ligands des cellules tueuses naturelles humaines

Ici, nous concevons deux panels de cytométrie de masse complémentaire (CyTOF) et optimisons un protocole de coloration CyTOF dans le but de profiler le récepteur des cellules tueuses naturelles et le répertoire de ligands dans le cadre d’infections virales.

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont parmi les premières à répondre aux infections virales. La capacité des cellules NK à reconnaître et à tuer rapidement les cellules infectées par le virus est régulée par l’expression de récepteurs inhibiteurs et activateurs codés par la lignée germinale. L’engagement de ces récepteurs par leurs ligands apparentés sur les cellules cibles détermine si l’interaction intercellulaire entraînera la destruction des cellules NK. Ce protocole détaille la conception et l’optimisation de deux panels de cytométrie de masse complémentaire (CyTOF). Un panel a été conçu pour phénotyper les cellules NK en fonction de l’expression des récepteurs. L’autre panel a été conçu pour interroger l’expression de ligands connus pour les récepteurs des cellules NK sur plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires. Ensemble, ces deux panels permettent de profiler le répertoire récepteur-ligand des cellules NK humaines. De plus, ce protocole détaille également le processus par lequel nous colorons les échantillons pour le CyTOF. Ce processus a été optimisé pour une meilleure reproductibilité et une meilleure standardisation. L’un des avantages de CyTOF est sa capacité à mesurer plus de 40 marqueurs dans chaque panneau, avec un chevauchement minimal des signaux, ce qui permet aux chercheurs de capturer l’étendue du répertoire récepteur-ligand des cellules NK. Le code-barres au palladium réduit également les variations entre les échantillons, ainsi que la consommation de réactifs, ce qui facilite la coloration des échantillons avec chaque panneau en parallèle. Les limites de ce protocole comprennent le débit relativement faible de CyTOF et l’incapacité de récupérer les cellules après l’analyse. Ces panels ont été conçus pour l’analyse d’échantillons cliniques de patients souffrant d’infections virales aiguës et chroniques, notamment le virus de la dengue, le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et la grippe. Cependant, ils peuvent être utilisés dans n’importe quel contexte pour étudier le répertoire des récepteurs et ligands des cellules NK humaines. Il est important de noter que ces méthodes peuvent être largement appliquées à la conception et à l’exécution des futurs panneaux CyTOF.

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont des cellules immunitaires innées dont le rôle principal est de cibler et de tuer les cellules malignes, infectées ou autrement stressées. Grâce à leur sécrétion de cytokines telles que l’IFNγ et le TNFα, ainsi qu’à leur activité cytotoxique, les cellules NK peuvent également façonner la réponse immunitaire adaptative aux agents pathogènes et aux tumeurs malignes. La réponse NK est médiée en partie par la signalisation combinatoire des récepteurs inhibiteurs et activateurs codés par la lignée germinale, qui se lient à une myriade de ligands exprimés sur des cellules cibles potentielles. Plusieurs récepteurs des cellules NK ont plus d’un ligand, de nouvelles paires récepteur-ligand étant régulièrement identifiées.

On s’intéresse particulièrement à l’étude des cellules NK dans le contexte des infections virales, où leur capacité à répondre rapidement aux cellules stressées peut limiter la propagation virale ou favoriser le développement de stratégies d’évasion des cellules NK. Cet intérêt pour la biologie des cellules NK s’étend au domaine de l’immunothérapie du cancer, où les chercheurs étudient le rôle des cellules NK dans l’immunosurveillance tumorale et dans le microenvironnement tumoral¹. Cependant, la capacité de profiler les interactions cellule-cellule cible NK est compliquée par le fait que les cellules NK humaines peuvent exprimer plus de 30 récepteurs qui peuvent à leur tour interagir avec plus de 30 ligands connus². La détection simultanée de plusieurs récepteurs de cellules NK et de leurs ligands apparentés est donc nécessaire pour saisir la complexité des interactions récepteur-ligand qui contrôlent la fonction NK. Nous nous sommes donc tournés vers la cytométrie de masse (CyTOF), qui permet de détecter simultanément plus de 40 marqueurs au niveau de la cellule unique. Notre objectif était de créer deux panels CyTOF pour profiler le répertoire récepteur-ligand des cellules NK. Nous voulions également concevoir un protocole pour un traitement et une coloration efficaces des échantillons cliniques. Les échantillons humains cliniques fournissent une mine d’informations sur la façon dont le corps réagit à l’infection virale. Par conséquent, nous avons développé ce protocole pour étudier l’expression des récepteurs des cellules NK et de leurs ligands apparentés en parallèle afin une meilleure standardisation, une meilleure récupération, une consommation réduite de réactifs et des effets de lot limités.

Plusieurs panels de cytométrie en flux conçus pour caractériser le phénotype des cellules NK humaines ont été publiés précédemment 3,4,5,6,7,8. La plupart de ces panels sont limités dans leur capacité à saisir l’étendue du répertoire récepteur-ligand, ne permettant la détection que d’une sélection limitée de marqueurs. De plus, ces panneaux sont limités par le chevauchement des signaux entre les fluorochromes. CyTOF utilise des anticorps conjugués à des isotopes métalliques, qui sont lus par spectrométrie de masse à temps de vol, réduisant ainsi considérablement le débordement entre les canaux.

Comme nous, d’autres chercheurs se sont tournés vers CyTOF pour étudier les cellules NK^{9, 10, 11, 12, 13, 14}, bien qu’avec généralement moins de marqueurs de cellules NK, ce qui réduit la profondeur du phénotypage. Bien que les protocoles généraux de coloration utilisés par ces groupes soient similaires aux nôtres, il existe quelques différences clés. D’autres protocoles n’impliquent pas d’isoler les cellules NK avant la coloration, même si les chercheurs ne s’intéressent qu’à ce sous-ensemble^13,14. Étant donné que les cellules NK ne représentent que 5 à 20 % des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), la coloration de PBMC entiers plutôt que de cellules NK isolées signifie que la plupart des événements collectés ne seront pas des cellules NK. Cela réduit la quantité de données générées sur le sous-ensemble d’intérêt et entraîne une utilisation inefficace du temps machine. De plus, alors que bon nombre de ces panels interrogent l’expression des récepteurs des cellules NK tels que les récepteurs Ig-like tueurs (KIR), les NKG2A/C/D et les récepteurs naturels de cytotoxicité (NKp30, NKp44 et NKp46), l’expression de ces marqueurs n’est pas placée dans un contexte plus large en raison de l’absence de données sur l’expression de leurs ligands respectifs. Par conséquent, bien que ces méthodes précédemment publiées pour étudier les cellules NK via CyTOF soient suffisantes pour le phénotypage large des cellules NK, utilisées isolément, elles ne peuvent pas fournir une image complète de l’activité des cellules NK. Cela nous amène au principal avantage des méthodes décrites ici, à savoir qu’à ce jour, il n’existe pas de cytométrie en flux publiée ou de panels CyTOF axés sur l’exploration de l’expression des ligands des récepteurs des cellules NK. Il est important de noter que notre panel de ligands dispose de plusieurs canaux ouverts pour permettre l’ajout de marqueurs afin de répondre aux besoins uniques de chaque expérience.

Étant donné que l’une des principales limites de CyTOF est l’incapacité de récupérer l’échantillon après l’analyse, cette méthode peut ne pas convenir aux chercheurs qui ont des échantillons limités avec lesquels ils souhaitent effectuer des expériences supplémentaires. De plus, la nature à faible débit de CyTOF signifie que les données générées seront de mauvaise qualité si le nombre de cellules de départ est faible. À l’exception de ces deux limitations, cette méthode fonctionnera bien dans n’importe quel contexte pour étudier les interactions récepteur-ligand entre les cellules NK et les cellules cibles.

Des PBMC adultes sains anonymisés ont été obtenus à partir de chambres du système de leucoréduction achetées au Stanford Blood Center. Des PBMC provenant de donneurs pédiatriques sains anonymisés et de patients pédiatriques atteints de dengue aiguë ont été obtenus auprès de l’Institut d’études sur la santé Gorgas Memorial à Panama City, au Panama, et dans des hôpitaux appartenant au ministère de la Santé, au système de sécurité sociale de Panama City et dans les zones suburbaines. Le protocole d’étude sur la dengue a été approuvé par l’IRB de l’Hospital del Niño (CBIHN-M-0634), puis approuvé par les comités de l’ICGES, du CSS, de l’hôpital Santo Tomas et de l’Université de Stanford. Les PBMC de patients infectés par le VIH sous traitement antirétroviral ont été obtenus à partir de l’étude ACTG A5321.

1. Marquage des anticorps, préparation du panel et stockage

1. Marquage des anticorps avec des isotopes métalliques
   REMARQUE : Pour augmenter la standardisation inter-expérimentale de la coloration, il est recommandé d’effectuer plusieurs conjugaisons pour chaque anticorps, puis de combiner les produits en un seul mélange maître pour un stockage à long terme, comme décrit ci-dessous.
   1. Déterminez la concentration de chaque anticorps en mesurant l’absorbance à 280 nm avant la conjugaison. Les anticorps utilisés pour ce protocole sont disponibles dans le commerce et ont été achetés auprès des fournisseurs énumérés dans la table des matières.
   2. Étiquetez les anticorps avec des isotopes métalliques à l’aide de trousses d’étiquetage d’anticorps disponibles dans le commerce, conformément aux instructions du fabricant. Utilisez 100 μg d’anticorps pour chaque réaction.
   3. Déterminez la concentration finale de l’anticorps récupéré en mesurant l’absorbance à 280 nm. Stocker les anticorps à court terme à 4 °C.
2. Titrage des anticorps
   REMARQUE : La technologie CyTOF est très sensible aux signaux de contamination potentiels des métaux environnementaux. Par conséquent, tous les tampons/réactifs utilisés doivent être préparés avec de l’eau ultrapure et stockés dans des récipients en plastique ou en verre qui n’ont jamais été lavés avec du savon.
   1. Préparez pour chaque donneur des tubes à centrifuger contenant 9 mL de RPMI complet et chaud (RPMI 1640, 10 % FBS, 1 % L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine) et 20 μL de benzonase par flacon de PBMC à décongeler. Décongelez les PBMC dans un bain-marie et ajoutez-les dans des tubes.
      REMARQUE : La benzonase diminue la viscosité et le bruit de fond de l’ADN libre des cellules lysées.
   2. Centrifugeuse à 300 x g à température ambiante pendant 5 min. Remettez les PBMC en suspension dans 5 ml de support RPMI complet et comptez.
   3. Pour chaque titrage de panneau, plaquez 2 à 4 millions de PBMC/puits dans 6 puits d’une plaque à fond rond de 96 puits (un puits pour chaque titre et un pour non coloré). Centrifuger la plaque à 600 x g à température ambiante pendant 3 min. Retournez la plaque pour retirer le surnageant. Remettre chaque puits en suspension dans 200 μL de CyPBS.
   4. Effectuez la coloration de viabilité au cisplatine comme décrit ci-dessous.
      REMARQUE : Le cisplatine est utilisé pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes en cytométrie de masse.
      1. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de stock de cisplatine 25 μM. Incuber à température ambiante pendant 1 min.
      2. Tremper la réaction de cisplatine en ajoutant 100 μL de FBS dans chaque puits et en mélangeant. Centrifugez et agissez la plaque.
         REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de centrifugation suivantes à 4 °C.
      3. Laver les cellules deux fois avec 200 μL de CyFACS (1x PBS sans contaminants de métaux lourds dans une eau ultrapure avec 0,1 % de BSA, 0,05 % d’azoture de sodium). Centrifugez et retournez la plaque à chaque fois.
   5. Titrez le panel d’anticorps de surface comme décrit ci-dessous.
      REMARQUE : Des mélanges principaux séparés doivent être réalisés pour le panneau de surface NK et le panneau de ligand.
      1. Réaliser un mélange magistral de tous les anticorps de surface à une concentration de 10 μg/mL à l’aide de CyFACS. Visez un volume final de 150 μL. Faites des dilutions en série de 1:2 à l’aide de CyFACS, pour obtenir les concentrations suivantes : 10, 5, 2,5, 1,25 et 0,625 μg/mL.
      2. Filtrer les cocktails d’anticorps à travers une unité de filtration centrifuge (pores de 0,1 μm) à 10 600 x g pendant 3 min avant la coloration.
      3. Remettre les cellules en suspension dans 50 μL du cocktail d’anticorps de surface au titre respectif. Remettez en suspension le puits non taché dans CyFACS. Incuber à 4 °C pendant 30 min.
      4. Laver les cellules avec 150 μL de CyFACS. Centrifugez et agissez la plaque.
      5. Laver les cellules avec 200 μL de CyFACS. Centrifugez et agissez la plaque.
   6. Effectuer la fixation des cellules en remettant en suspension chaque puits dans 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 2 % dans du CyPBS. Incuber la plaque à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 min. Laver les cellules avec 100 μL de CyFACS. Centrifugeuse à 700 x g pendant 5 min.
      ATTENTION : Le PFA est soupçonné de provoquer des anomalies génétiques ainsi que le cancer. De plus, il est nocif s’il entre en contact avec les yeux, la peau ou est inhalé. Manipulez correctement en assurant une bonne ventilation, en ouvrant le récipient avec précaution et en empêchant la formation d’aérosols.
      REMARQUE : Tous les centrifugations ultérieures sont effectuées à 700 x g pendant 5 min à 4 °C.
   7. Perméabiliser les cellules en les remettant en suspension dans 200 μL de 1x tampon de perméabilisation (tampon Perm) dilué dans de l’eau ultrapure. Centrifugez et agissez la plaque. Laver les cellules avec 200 μL de tampon Perm. Centrifugez et agissez la plaque.
      REMARQUE : L’incubation dans le tampon de Perm n’est pas nécessaire.
   8. Titrage du panel d’anticorps intracellulaires
      1. Faites un mélange maître de tous les anticorps intracellulaires à une concentration de 10 μg/mL à l’aide du tampon Perm. Visez un volume final de 150 μL. Faites des dilutions en série de 1:2 à l’aide du tampon Perm pour obtenir les concentrations suivantes : 10, 5, 2,5, 1,25 et 0,625 μg/mL.
      2. Filtrer les cocktails d’anticorps à travers une unité de filtration centrifuge (pores de 0,1 μm) à 10 600 x g pendant 3 min avant la coloration.
      3. Remettre les cellules en suspension dans 50 μL du cocktail d’anticorps intracellulaires au titre respectif. Remettez en suspension le puits non taché dans le tampon permanent. Incuber à 4 °C pendant 45 min.
         REMARQUE : Si un panneau intracellulaire ne doit pas être titré, remettre les puits en suspension dans 50 μL du tampon Perm.
      4. Laver les cellules avec 150 μL de tampon Perm. Centrifugez et agissez la plaque.
      5. Laver les cellules avec 200 μL de tampon Perm. Centrifugez et agissez la plaque.
      6. Lavez les cellules deux fois avec 200 μL de CyFACS. Centrifugez et agissez la plaque.
   9. Coloration de l’intercalateur d’ADN
      REMARQUE : L’intercalateur se lie à l’acide nucléique cellulaire et est utilisé pour identifier les cellules nucléées en cytométrie de masse.
      1. Remettre en suspension les cellules dans 200 μL d’intercalateur dilué 1:10 000 dans du CyPBS et 2 % de PFA. Incuber la plaque pendant une nuit à 4 °C.
      2. Conservez les plaques, si nécessaire, à 4 °C recouvertes d’un film de paraffine jusqu’à une semaine.
         REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de centrifugation suivantes à 700 x g pendant 5 min à 4 °C.
      3. Avant d’analyser les échantillons sur CyTOF, retirez le film de paraffine de la plaque et centrifugez-le à 700 x g pendant 5 min à 4 °C. Retournez l’assiette. Lavez les cellules une fois avec 200 μL de CyFACS. Centrifugez et agissez la plaque.
      4. Laver les cellules trois fois avec 200 μL d’eau ultrapure. Centrifugez et agissez la plaque. Remettez les cellules en suspension dans 200 μL d’eau ultrapure. Immédiatement avant de prélever l’échantillon, ajuster la concentration à environ 6 x 10⁵ cellules/mL dans des billes de normalisation diluées à une concentration de 1 fois dans de l’eau ultrapure.
   10. Exécutez les échantillons sur CyTOF.
   11. Analysez les données et choisissez les titres appropriés pour chaque anticorps en sélectionnant le titre d’anticorps le plus bas, ce qui se traduit par l’intensité du signal la plus élevée et la meilleure séparation entre les populations positives et négatives sur la base d’une évaluation visuelle.
       REMARQUE : Les titrages pour les panneaux NK et ligand sont illustrés respectivement à la figure 1 et à la figure 2 . Si une distinction claire entre les populations positives et négatives n’est pas identifiée, les titres peuvent être évalués sur plusieurs types de cellules ou sur des lignées cellulaires, afin de permettre l’identification des populations cellulaires positives et négatives.
   12. Stockage du panneau d’anticorps
       1. Combinez les anticorps titrés dans un mélange maître et filtrez à travers une unité de filtre à seringue stérile de 0,1 μm. Des mélanges maîtres séparés doivent être réalisés pour le panneau de surface NK, le panneau intracellulaire NK et le panneau de ligand.
       2. Pour l’entreposage à long terme des panneaux, suivez l’une des deux options acceptables :
       3. Envoyez le master mix à une société tierce pour la lyophilisation. Cette méthode est utilisée pour le panneau NK. Les anticorps non conjugués en interne ne peuvent pas être lyophilisés, en raison de la présence d’un stabilisateur d’anticorps, qui interfère avec le processus de lyophilisation. Ces anticorps sont ajoutés au panel le jour de la coloration.
       4. À l’aide d’une pipette à répéteur, faites des aliquotes de 50 μL de chaque mélange maître et conservez-les à -80 °C.

2. Protocole de coloration

1. Décongeler les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) comme décrit aux étapes 1.2.1 et 1.2.2. Mettez de côté au moins 1 million de PBMC pour la coloration du panneau de ligand dans un tube à centrifuger de 15 ml. Gardez ces PBMC sur la glace pendant l’isolement des cellules NK.
2. Isolement des cellules NK
   REMARQUE : Les étapes d’isolement de cellule NK suivantes sont une version modifiée du protocole d’un fournisseur spécifique. Cependant, tout kit ou protocole qui effectue une sélection négative magnétique des cellules NK serait une alternative appropriée. De plus, cette étape est facultative car ce protocole est également adapté au phénotypage des cellules NK à partir de PBMC entiers.
   1. Faites tourner les PBMC restants à 450 x g pendant 5 min. Mettre en suspension la pastille de cellule dans 40 μL de tampon MACS (PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) par 10^{à 7} cellules au total.
   2. Ajouter 10 μL de cocktail biotine-anticorps de cellules NK pour 10^{à 7} cellules au total. Bien mélanger et incuber 5 min sur glace.
   3. Ajouter 30 μL de tampon MACS pour 10⁷ cellules au total et 20 μL de cocktail MicroBead de cellules NK pour 10⁷ cellules au total. Bien mélanger et incuber 10 min sur glace.
   4. Préparez les colonnes d’élution en les rinçant avec 500 μL de tampon MACS. Ajouter 2 mL de RPMI complet froid dans des tubes de prélèvement de 15 mL.
   5. Ajoutez un tampon MACS aux tubes contenant des cellules pour porter le volume à 500 μL. Pipetez tout le volume de 500 μL sur la colonne d’élution préparée. Rincez le tube avec 500 μL supplémentaires de tampon MACS et transférez-le dans la colonne.
   6. Une fois le débit arrêté, rincez deux fois la colonne d’élution avec un tampon MACS de 500 μL. Une fois le flux arrêté, comptez les cellules NK.
3. Plaques et cellules de lavage.
   1. La centrifugeuse a isolé les cellules NK et les PBMC à 300 x g à température ambiante pendant 10 min. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 5 millions de cellules/mL dans le CyPBS (1x PBS sans contaminants de métaux lourds dans l’eau ultrapure). Cellules en U à 96 puits.
      REMARQUE : Chaque aliquote du panneau de cellules NK peut colorer jusqu’à 3 millions de cellules. Si six échantillons individuels de cellules NK sont codés à barres et regroupés avant la coloration, le nombre total combiné de cellules NK ne doit pas dépasser 3 millions. Le panel de ligands peut colorer jusqu’à 6 millions de PBMC par échantillon. Si six échantillons individuels sont codés à barres et regroupés avant la coloration, le nombre total combiné de PBMC ne devrait pas dépasser 6 millions.
   2. Plaque de centrifugation à 600 x g à température ambiante pendant 3 min. Agissez la plaque pour retirer le surnageant.
      REMARQUE : Effectuez tous les essorages ultérieurs de la centrifugeuse à 600 x g pendant 3 min jusqu’à l’étape 2.7.
   3. Remettre les cellules en suspension dans 200 μL de CyPBS. Centrifugez et agissez la plaque.
4. Effectuez la coloration de viabilité au cisplatine comme décrit à l’étape 1.2.4.
5. Coloration par code-barres
   REMARQUE : Ces panneaux sont utilisés conjointement avec une méthode modifiée de codage à barres à base de palladium sur des cellules vivantes non fixées afin de minimiser les effets de lot et de maximiser la récupération des cellules¹⁵. Cependant, cette étape est facultative car le code-barres n’est pas nécessaire pour obtenir des données de qualité.
   1. Remettre chaque puits en suspension dans 50 μL de code-barres prémélangé respectif et incuber à 4 °C pendant 30 min. Laver les cellules avec 150 μL de CyFACS. Centrifugez et agissez la plaque.
   2. Lavez les cellules deux fois avec 200 μL de CyFACS. Centrifugez et agissez la plaque. Remettre tous les puits en suspension dans 30 μL de CyFACS. Combinez jusqu’à six puits de cellules colorées avec des codes-barres uniques en un seul puits et effectuez la centrifugation et le basculement de la plaque.
6. Coloration de surface
   1. Dissoudre la lyosphère de surface du panneau NK dans 50 μL de CyFACS avec des anticorps de surface supplémentaires ajoutés (anti-CD16, anti-HLA-DR, anti-LILRB1). Décongeler le panneau de ligand stocké à -80 °C et faire tourner le tube à l’aide d’une mini-centrifugeuse. Ajout de marqueurs de surface de ligand supplémentaires (anti-CD16, anti-CD19).
      REMARQUE : Tout cocktail d’anticorps qui n’a pas été préalablement filtré (c’est-à-dire avant la lyophilisation ou la congélation) doit être filtré à travers une unité de filtre centrifuge (pores de 0,1 μm) à 10 600 x g pendant 3 minutes avant la coloration.
   2. Remettez chaque puits en suspension dans 50 μL du panneau respectif. Incuber à 4 °C pendant 30 min. Laver les cellules avec 150 μL de CyFACS. Centrifugez et agissez la plaque. Laver à nouveau les cellules avec 200 μL de CyFACS. Centrifugez et agissez la plaque.
7. Fixez les cellules comme décrit à l’étape 1.2.6.
   REMARQUE : Effectuez tous les essorages ultérieurs de la centrifugeuse à 700 x g pendant 5 min à 4 °C.
8. Perméabiliser les cellules comme décrit à l’étape 1.2.7.
9. Coloration intracellulaire
   1. Dissoudre la lyosphère intracellulaire du panneau NK dans 50 μL de tampon Perm. Préparez un cocktail d’anticorps intracellulaires pour les échantillons de PBMC si vous le souhaitez.
      REMARQUE : Tout cocktail d’anticorps qui n’a pas été préalablement filtré (c’est-à-dire avant la lyophilisation ou la congélation) doit être filtré à travers une unité de filtre centrifuge (pores de 0,1 μm) à 10 600 x g pendant 3 minutes avant la coloration.
   2. Remettre les puits en suspension dans 50 μL des panneaux intracellulaires respectifs. Si un panneau intracellulaire n’est pas utilisé en conjonction avec le panneau de surface du ligand, remettre en suspension les puits PBMC dans 50 μL du tampon Perm. Incuber à 4 °C pendant 45 min.
   3. Laver les cellules avec 150 μL de tampon Perm. Centrifugeuse et plaque de projection. Laver les cellules avec 200 μL de tampon Perm. Centrifugez et agissez la plaque.
   4. Lavez les cellules deux fois avec 200 μL de CyFACS. Centrifugez et agissez la plaque.
10. Coloration de l’intercalateur d’ADN. Effectuez la coloration de l’intercalateur d’ADN comme décrit à l’étape 1.2.9.1. Incuber la plaque pendant une nuit à 4 °C.
    REMARQUE : L’intercalateur se lie à l’acide nucléique cellulaire et est utilisé pour identifier les cellules nucléées en cytométrie de masse. Les plaques peuvent être conservées recouvertes d’un film de paraffine jusqu’à une semaine à 4 °C.
11. Avant d’analyser les échantillons sur CyTOF, laver les cellules comme décrit aux étapes 1.2.9.3 et 1.2.9.4.
12. Exécutez des échantillons sur CyTOF.

Les anticorps ont été conjugués à des isotopes métalliques à l’aide de trousses d’étiquetage disponibles dans le commerce, conformément aux instructions du fabricant. Les clones d’anticorps ont été validés par cytométrie en flux et cytométrie de masse avant d’être utilisés dans ce panel. Une première liste de clones a été sélectionnée en fonction de l’examen de la littérature et de la disponibilité des anticorps. Les niveau...

Nous décrivons ici la conception et l’application de deux panels CyTOF complémentaires visant à profiler le répertoire récepteur-ligand des cellules NK. Ce protocole comprend plusieurs étapes essentielles à l’obtention de données de qualité. CyTOF utilise des ions de métaux lourds, plutôt que des fluorochromes, comme sondes de marquage pour les anticorps¹⁹. Cette technologie est donc soumise à des signaux potentiellement contaminants provenant des ...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les auteurs tiennent à remercier tous les membres actuels et anciens du Blish Laboratory qui ont contribué à ce panel. Merci au Groupe d’essais cliniques sur le sida et à l’équipe ACTG A5321, ainsi qu’à la Dre Sandra López-Vergès et à Davis Beltrán de l’Institut Gorgas Memorial d’études sur la santé pour la conservation des échantillons. Enfin, merci à Michael Leipold, Holden Maecker et au Centre de surveillance immunitaire humaine de Stanford pour l’utilisation de leurs machines Helios. Ce travail a été soutenu par NIH U19AI057229, NIH R21 AI135287, NIH R21 AI130532, NIH DP1 DA046089 et Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Infectious Diseases #1016687 to CB, NIH Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award T32 AI007502, TL1 TR001084 et NIH/NIAID K08 AI138640 à EV, National Science Foundation Graduate Research Fellowship DGE-1656518 to JM et NIH training grant T32-AI-007290 (PI Olivia Martinez). L’étude de l’ACTG a reçu une subvention de AI-68634 (Centre de gestion des statistiques et des données), UM1-A1-26617, AI-131798 et AI-68636 (ACTG). CB est chercheur à la faculté Tashia et John Morgridge en médecine translationnelle pédiatrique de l’Institut de recherche sur la santé maternelle et infantile de Stanford et chercheur au Chan Zuckerberg Biohub.