ヒトナチュラルキラー細胞受容体-リガンドレパートリーのプロファイリング

ここでは、2つの相補的マスサイトメトリー(CyTOF)パネルを設計し、ウイルス感染の設定におけるナチュラルキラー細胞受容体とリガンドレパートリーのプロファイリングを目的として、CyTOF染色プロトコルを最適化します。

ナチュラルキラー(NK)細胞は、ウイルス感染に対する最初の応答者の1つです。NK細胞がウイルス感染細胞を迅速に認識して殺す能力は、生殖細胞系にコードされた阻害性および活性化受容体の発現によって制御されています。これらの受容体が標的細胞に同族のリガンドを結合させることで、細胞間相互作用がNK細胞の死滅につながるかどうかが決まります。このプロトコールでは、2つの相補型マスサイトメトリー(CyTOF)パネルの設計と最適化について詳しく説明します。1つのパネルは、受容体発現に基づいてNK細胞を表現型決定するために設計されました。もう1つのパネルは、いくつかの免疫細胞サブセット上のNK細胞受容体の既知のリガンドの発現を調べるために設計されました。これら2つのパネルを組み合わせることで、ヒトNK細胞受容体リガンドのレパートリーのプロファイリングが可能になります。さらに、このプロトコルでは、CyTOFのサンプルを染色するプロセスについても詳しく説明しています。このプロセスは、再現性と標準化を向上させるために最適化されています。CyTOFの利点は、各パネルの40を超えるマーカーを最小限のシグナルオーバーラップで測定できるため、研究者はNK細胞受容体リガンドのレパートリーの幅を捉えることができることです。また、パラジウムバーコード化により、サンプル間のばらつきや試薬の消費量が減少するため、各パネルを並行してサンプルを染色しやすくなります。このプロトコルの限界には、CyTOFのスループットが比較的低いことや、解析後に細胞を回収できないことなどがあります。これらのパネルは、デング熱ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、インフルエンザなどの急性および慢性ウイルス感染症に罹患した患者の臨床サンプルの分析用に設計されました。しかし、ヒトNK細胞受容体リガンドのレパートリーを調べるために、どのような状況でも利用することができます。重要なことは、これらの手法は、将来のCyTOFパネルの設計と実行に広く適用できることです。

ナチュラルキラー(NK)細胞は、悪性細胞、感染細胞、またはその他のストレスを受けた細胞を標的にして殺す主な役割を持つ自然免疫細胞です。NK細胞は、IFNγやTNFαなどのサイトカインの分泌や細胞傷害活性を通じて、病原体や悪性腫瘍に対する適応免疫応答を形成することもできます。NK応答は、生殖細胞系にコードされる抑制性受容体と活性化受容体の組み合わせシグナル伝達によって部分的に媒介され、潜在的な標的細胞に発現する無数のリガンドに結合します。いくつかのNK細胞受容体は複数のリガンドを持ち、新しい受容体-リガンドペアが定期的に同定されています。

NK細胞をウイルス感染の状況で研究することには特に関心があり、ストレスを受けた細胞に迅速に応答するNK細胞の能力がウイルスの拡散を制限したり、NK細胞回避戦略の開発を促進したりする可能性があります。NK細胞生物学へのこの関心は、研究者が腫瘍免疫監視および腫瘍微^{小環境における}NK細胞の役割を調査しているがん免疫療法の分野にまで及びます1。しかし、ヒトNK細胞は30以上の受容体を発現し、さらに30以上の既知のリガンドと相互作用することができるという事実により、NK細胞と標的細胞の相互作用をプロファイリングする能力は複雑^{になります2。}したがって、複数のNK細胞受容体とその同族リガンドを同時に検出することは、NK機能を制御する受容体-リガンド相互作用の複雑さを捉えるために必要です。そこで、シングルセルレベルで40種類以上のマーカーを同時に検出できるマスサイトメトリー(CyTOF)に切り替えました。私たちの目標は、NK細胞受容体リガンドのレパトアをプロファイリングするための2つのCyTOFパネルを作成することでした。また、臨床サンプルの効果的な処理と染色のためのプロトコルを設計したいと考えていました。臨床ヒトサンプルは、ウイルス感染に対する体内の反応に関する豊富な情報を提供します。したがって、このプロトコルは、NK細胞受容体とその同族リガンドの発現を並行して調査し、標準化の向上、回収率の向上、試薬消費量の削減、およびバッチ効果の制限を目的として開発されました。

ヒトNK細胞の表現型を特徴付けるために設計されたいくつかのフローサイトメトリーパネルが以前に発表されています3,4,5,6,7,8。これらのパネルのほとんどは、受容体リガンドのレパートリーの幅を捉える能力に限界があり、限られたマーカーの選択しか検出できません。さらに、これらのパネルは、蛍光色素間の信号の重なりによって制限されます。CyTOFは、金属同位体に結合した抗体を使用し、飛行時間型質量分析法によって読み出されるため、チャネル間のスピルオーバーが大幅に減少します。

私たちと同様に、他の研究者もCyTOFを使用してNK細胞9,10,11,12,13,14を研究していますが、一般的にNK細胞マーカーが少ないため、表現型の深さが減少します。これらのグループが使用する一般的な染色プロトコルは当社のものと似ていますが、いくつかの重要な違いがあります。他のプロトコルでは、研究者がそのサブセット^13,14にのみ関心を持っているにもかかわらず、染色前にNK細胞を単離することは含まれていません。NK細胞が末梢血単核細胞(PBMC)の5〜20%しか占めていないことを考えると、単離されたNK細胞ではなくPBMC全体を染色すると、収集されたイベントのほとんどがNK細胞ではなくなります。これにより、対象のサブセットで生成されるデータの量が減り、マシン時間の使用が非効率的になります。さらに、これらのパネルの多くは、キラーIg様受容体(KIR)、NKG2A/C/D、および天然の細胞毒性受容体(NKp30、NKp44、およびNKp46)などのNK細胞受容体の発現を調査していますが、これらのマーカーの発現は、それぞれのリガンドの発現に関するデータがないため、より広範な文脈に当てはめられていません。したがって、CyTOFを介してNK細胞を調査するこれらの以前に発表された方法は、単独で使用される広範なNK細胞表現型には十分ですが、NK細胞活性の包括的な画像を提供することはできません。このことから、ここで説明した方法の大きな利点は、これまでNK細胞受容体のリガンドの発現を探ることに焦点を当てたフローサイトメトリーやCyTOFパネルが発表されていないことです。重要なことは、当社のリガンドパネルには、各実験の固有のニーズに合わせてマーカーを追加できるように、いくつかのオープンチャネルがあることです。

CyTOFの主な制限の1つは、分析後にサンプルを回収できないことであることを考えると、この方法は、追加の実験を行うことに関心のあるサンプルが限られている研究者には適していない可能性があります。さらに、CyTOFの低スループットの性質は、セルの開始数が少ない場合、生成されるデータの品質が低くなることを意味します。これら2つの制限を除けば、この方法は、NK細胞と標的細胞との間の受容体-リガンド相互作用を研究するためのあらゆる設定で優れた性能を発揮します。

匿名化された健康な成人PBMCは、スタンフォード血液センターから購入した白血球減少システムチャンバーから入手しました。匿名化された健康な小児ドナーおよび小児急性デング熱患者からのPBMCは、パナマシティのGorgas Memorial Institute of Health Studiesおよび保健省に属する病院、パナマシティの社会保障制度、および郊外から入手しました。デング熱研究プロトコルは、Hospital del NiñoのIRB(CBIHN-M-0634)によって承認され、その後、ICGES、CSS、Santo Tomas Hospital、およびStanford Universityの委員会によって承認されました。抗レトロウイルス治療を受けているHIV感染患者からのPBMCは、ACTG研究A5321から得られました。

1. 抗体の標識、パネル調製、保管

1. 金属同位体による抗体標識
   注:染色の実験間の標準化を促進するために、以下に説明するように、各抗体に対して複数の標識を行い、その後、製品を単一のマスターミックスに結合して長期保存することをお勧めします。
   1. 標識前に280 nmで吸光度を測定することにより、各抗体の濃度を測定します。このプロトコールに使用された抗体は市販されており、 材料表に記載されているベンダーから購入しました。
   2. 市販の抗体標識キットを使用して、製造元の指示に従って金属同位体で抗体を標識します。各反応に100 μgの抗体を使用してください。
   3. 回収した抗体の最終濃度は、280 nmの吸光度を測定して測定します。抗体は4°Cで短期保存してください。
2. 抗体滴定
   注:CyTOFテクノロジーは、環境金属からの潜在的な汚染信号に非常に敏感です。したがって、使用するすべてのバッファー/試薬は、超純水で調製し、石鹸で洗浄したことのないプラスチックまたはガラス容器に保管する必要があります。
   1. 解凍する PBMC のバイアルあたり 9 mL の温かい完全な RPMI (RPMI 1640、10% FBS、1% L-グルタミン、1% ペニシリン/ストレプトマイシン) と 20 μL のベンゾナーゼを含む各ドナーの遠心分離チューブを準備します。PBMCを水浴で解凍し、チューブに加えます。
      注:ベンゾナーゼは、溶解した細胞からの遊離DNAから粘度とバックグラウンドを減少させます。
   2. 300 x g 、室温で5分間遠心分離します。PBMCを5 mLの完全RPMI培地に再懸濁し、カウントします。
   3. 各パネル滴定について、丸底96ウェルプレート(各力価に1ウェル、未染色に1ウェル)の6ウェルに2〜400万PBMC/ウェルをプレート化します。プレートを600 x g で室温で3分間遠心分離します。プレートをフリックして上澄み物を取り除きます。各ウェルを200 μLのCyPBSに再懸濁します。
   4. 以下に説明するようにシスプラチン生存率染色を行います。
      注:シスプラチンは、マスサイトメトリーで生細胞と死細胞を区別するために使用されます。
      1. 細胞を100 μLの25 μMシスプラチンストックに再懸濁します。室温で1分間インキュベートします。
      2. シスプラチン反応をクエンチするには、各ウェルに100 μLのFBSを添加して混合します。プレートを遠心分離してフリックします。
         注:その後のすべての遠心分離ステップを4°Cで実行します。
      3. 200 μL の CyFACS (重金属汚染物質を含まない 1x PBS、0.1% BSA、0.05% アジ化ナトリウム含有超純水溶液) で細胞を 2 回洗浄します。毎回プレートを遠心分離してフリックします。
   5. 表面抗体パネルを下記のように滴定します。
      注:NK表面パネルとリガンドパネルには、別々のマスターミックスを作成する必要があります。
      1. CyFACSを使用して、すべての表面抗体を10 μg/mLの濃度でマスターミックスします。最終容量は150 μLを目標に、CyFACSを使用して1:2の連続希釈を行い、10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mLの濃度を得ます。
      2. 抗体カクテルを遠心フィルターユニット(孔径0.1 μm)で10,600 x g で3分間染色する前にろ過します。
      3. めっきした細胞を50 μLの表面抗体カクテルにそれぞれの力価で再懸濁します。未染色の井戸をCyFACSに再懸濁します。4°Cで30分間インキュベートします。
      4. 細胞を150 μLのCyFACSで洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
      5. 細胞を200 μLのCyFACSで洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
   6. CyPBS中の2%パラホルムアルデヒド(PFA)の100μLに各ウェルを再懸濁することにより、細胞の固定を行います。プレートを室温で暗所で20分間インキュベートします。細胞を100 μLのCyFACSで洗浄します。700 x g で5分間遠心分離します。
      注意:PFAは、がんだけでなく遺伝的欠陥を引き起こすと疑われています。また、目や皮膚に触れたり、吸い込んだりすると有害です。換気を良くし、容器を慎重に開き、エアロゾルの形成を防ぐことにより、適切に取り扱ってください。
      注:その後のすべての遠心分離機のスピンは、700 x g で4°Cで5分間実行されます。
   7. 超純水で希釈した1x Permeabilization Buffer(Perm buffer)200 μLに再懸濁することにより、細胞を透過処理します。プレートを遠心分離してフリックします。細胞を200 μLのPermバッファーで洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
      注:Permバッファーでのインキュベーションは必要ありません。
   8. 細胞内抗体パネル滴定
      1. Perm Bufferを使用して、10 μg/mLの濃度ですべての細胞内抗体のマスターミックスを作成します。最終容量は150 μLを目標に、Perm Bufferを使用して1:2の希釈液を連続して行い、10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mLの濃度を得ます。
      2. 抗体カクテルを遠心フィルターユニット(孔径0.1 μm)で10,600 x g で3分間染色する前にろ過します。
      3. 播種した細胞を50 μLの細胞内抗体カクテルにそれぞれの力価で再懸濁します。未染色のウェルをPerm Bufferに再懸濁します。4°Cで45分間インキュベートします。
         注:細胞内パネルを滴定しない場合は、50 μLのPermバッファーにウェルを再懸濁します。
      4. 細胞を150 μLのPermバッファーで洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
      5. 細胞を200 μLのPermバッファーで洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
      6. 細胞を200 μLのCyFACSで2回洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
   9. DNAインターカレーター染色
      注:インターカレーターは細胞核酸に結合し、マスサイトメトリーで有核細胞を同定するために使用されます。
      1. CyPBSおよび2% PFAで1:10,000に希釈した200 μLのインターカレーターに細胞を再懸濁します。プレートを4°Cで一晩インキュベートします。
      2. 必要に応じて、プレートをパラフィンフィルムで覆った4°Cで最大1週間保存してください。
         注:その後のすべての遠心分離ステップを700 x g で4°Cで5分間実行します。
      3. CyTOFでサンプルを泳動する前に、パラフィンフィルムをプレートから取り出し、700 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 プレートをフリックします。細胞を200 μLのCyFACSで1回洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
      4. 細胞を200μLの超純水で3回洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。細胞を200 μLの超純水に再懸濁します。サンプルを泳動する直前に、超純水で1倍の濃度に希釈したノーマライゼーションビーズの濃度を約6 x 10⁵ 細胞/mLに調整します。
   10. CyTOFでサンプルを実行します。
   11. データを解析し、最も低い抗体価を選択することで、各抗体に適切な力価を選択します。これにより、シグナル強度が最も高く、視覚的評価に基づいて陽性集団と陰性集団が最適に分離されます。
       注:NKパネルとリガンドパネルの滴定をそれぞれ 図1 と 図2 に示します。陽性集団と陰性集団の明確な区別が特定されない場合は、複数の細胞タイプまたは細胞株で力価を評価して、陽性細胞集団と陰性細胞集団の両方を同定することができます。
   12. 抗体パネル保管
       1. 滴定した抗体をマスターミックスに組み合わせ、滅菌済みの0.1 μmシリンジフィルターユニットでろ過します。NK表面パネル、NK細胞内パネル、およびリガンドパネルに対して別々のマスターミックスを作成する必要があります。
       2. パネルの長期保管には、次の2つの許容可能なオプションのいずれかに従ってください。
       3. マスターミックスを第三者企業に送って凍結乾燥してもらいます。この方法は、NKパネルに使用されます。社内で標識されていない抗体は、抗体安定剤が存在するため、凍結乾燥プロセスを妨げるため、凍結乾燥できません。これらの抗体は、染色日にパネルに添加されます。
       4. リピーターピペットを使用して、各マスターミックスの50 μLアリコートを作成し、-80°Cで保存します。

2. 染色プロトコール

1. ステップ1.2.1および1.2.2で説明されているように、末梢血単核細胞(PBMC)を解凍します。15 mLの遠心分離チューブでリガンドパネル染色用に少なくとも100万個のPBMCを確保します。これらのPBMCは、NK細胞の単離中は氷上に置いてください。
2. NK細胞の単離
   注:以下のNK細胞単離手順は、特定のベンダーのプロトコルの修正版です。しかし、NK細胞の磁気ベースのネガティブセレクションを行う任意のキットまたはプロトコルが適切な代替手段となるでしょう。さらに、このプロトコルはPBMC全体からのNK細胞の表現型解析にも適しているため、このステップはオプションです。
   1. 残りのPBMCを450 x g で5分間回転させます。細胞ペレットを、全細胞10⁷ 個あたり40 μLのMACSバッファー(PBS、0.5% BSA、2 mM EDTA)に再懸濁します。
   2. NK細胞ビオチン抗体カクテル10 μLを全^細胞7 個あたり10 μL加えます。よく混ぜて、氷上で5分間インキュベートします。
   3. 合計10⁷ 細胞あたり30 μLのMACSバッファーを^、合計7 細胞あたり20 μLのNK細胞MicroBead Cocktailを添加します。よく混ぜ合わせ、氷上で10分間インキュベートします。
   4. 溶出カラムは、500 μL の MACS バッファーですすいで調製します。2 mLのコールドコンプリートRPMIを15 mLコレクションチューブに加えます。
   5. 細胞を含むチューブにMACSバッファーを添加して、容量を最大500 μLにし、調製した溶出カラムに500 μLの全容量をピペットで移します。さらに500 μLのMACSバッファーでチューブを洗い流し、カラムに移します。
   6. 流れが止まったら、溶出カラムを500 μL MACSバッファーで2回すすぎます。フローが停止したら、NK細胞をカウントします。
3. 細胞をプレート化して洗浄します。
   1. 単離されたNK細胞およびPBMCを300 x g 、室温で10分間遠心分離します。CyPBS(超純水中に重金属汚染物質を含まない1x PBS)に500万細胞/mLの濃度で細胞を再懸濁します。U底の96ウェルプレートにセルをプレート化。
      注:NK細胞パネルの各アリコートは、最大300万個の細胞を染色できます。染色前に6つのNK細胞サンプルをバーコード化し、プールする場合、NK細胞の総数は300万を超えないようにする必要があります。リガンドパネルは、サンプルあたり最大600万個のPBMCを染色できます。染色前に6つのサンプルをバーコード化してプールする場合、PBMCの総数は600万を超えないようにする必要があります。
   2. プレートを600 x g 、室温で3分間遠心分離します。プレートをフリックして上澄み液を取り除きます。
      注:ステップ2.7まで、その後のすべての遠心分離スピンを600 x g で3分間実行します。
   3. 細胞を200 μLのCyPBSに再懸濁します。プレートを遠心分離してフリックします。
4. ステップ1.2.4で説明したようにシスプラチン生存率染色を行います。
5. バーコード染色
   注:これらのパネルは、バッチ効果を最小限に抑え、細胞回収を最大化するために、未固定の生細胞に対して修正されたTwo-of-4、パラジウムベースのバーコード法と組み合わせて使用されます¹⁵。ただし、高品質のデータを取得するためにバーコード化は必要ないため、この手順はオプションです。
   1. 各ウェルを50 μLのそれぞれのプレミックスバーコードに再懸濁し、4°Cで30分間インキュベートします。細胞を150 μLのCyFACSで洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
   2. 細胞を200 μLのCyFACSで2回洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。すべてのウェルを30 μLのCyFACSに再懸濁します。独自のバーコードで染色した細胞の最大6ウェルを1つのウェルに結合し、遠心分離とプレートのフリックを行います。
6. 表面染色
   1. 表面NKパネル液楼を50 μLのCyFACSに溶解し、追加の表面抗体(抗CD16、抗HLA-DR、抗LILRB1)を添加します。-80°Cで保存した配位子パネルを解凍し、ミニ遠心分離機を使用してチューブをスピンダウンします。追加のリガンドパネル表面マーカー(抗CD16、抗CD19)のスパイク。
      注:以前にろ過されていない抗体カクテル(凍結乾燥または凍結前)は、染色前に遠心フィルターユニット(孔径0.1 μm)で10,600 x g で3分間ろ過する必要があります。
   2. 各ウェルを各パネルの50 μLに再懸濁します。4°Cで30分間インキュベートします。細胞を150 μLのCyFACSで洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。細胞を200μLのCyFACSで再度洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
7. ステップ 1.2.6 で説明したようにセルを修正します。
   注:その後のすべての遠心分離スピンを700 x g で5分間、4°Cで実行します。
8. ステップ1.2.7で説明したように細胞を透過処理します。
9. 細胞内染色
   1. 細胞内NKパネルリオスフェアを50μLのPermバッファーに溶解します。必要に応じて、PBMCサンプル用の細胞内抗体カクテルを調製します。
      注:以前にろ過されていない抗体カクテル(凍結乾燥または凍結前)は、染色前に遠心フィルターユニット(孔径0.1 μm)で10,600 x g で3分間ろ過する必要があります。
   2. ウェルを50 μLのそれぞれの細胞内パネルに再懸濁します。細胞内パネルをリガンド表面パネルと組み合わせて使用しない場合は、PBMCウェルを50 μLのPermバッファーに再懸濁します。4°Cで45分間インキュベートします。
   3. 細胞を150 μLのPermバッファーで洗浄します。遠心分離機とフリックプレート。細胞を200 μLのPermバッファーで洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
   4. 細胞を200 μLのCyFACSで2回洗浄します。プレートを遠心分離してフリックします。
10. DNAインターカレーター染色。ステップ1.2.9.1で説明したようにDNAインターカレーター染色を行います。プレートを4°Cで一晩インキュベートします。
    注:インターカレーターは細胞核酸に結合し、マスサイトメトリーで有核細胞を同定するために使用されます。プレートは、パラフィンフィルムで覆って4°Cで最大1週間保存できます。
11. CyTOFでサンプルを実行する前に、ステップ1.2.9.3および1.2.9.4の説明に従って細胞を洗浄します。
12. CyTOFでサンプルを実行します。

抗体は、製造元の指示に従って、市販の標識キットを使用して金属同位体に結合しました。抗体クローンは、このパネルで使用する前に、フローサイトメトリーおよびマスサイトメトリーによって検証されました。クローンの初期リストは、文献のレビューと抗体の利用可能性に基づいて選択した。NK細胞受容体の一部のリガンドの発現レベ?...

ここでは、NK細胞受容体-リガンドレパートリーのプロファイリングを目的とした2つの相補型CyTOFパネルの設計と応用について説明します。このプロトコルには、高品質のデータを取得するために重要ないくつかの手順が含まれています。CyTOFは、抗体の標識プローブとして、蛍光色素ではなく重金属イオンを使用します¹⁹。したがって、この技術は?...

著者は何も開示していません。

著者は、このパネルに貢献したBlish Laboratoryの現在および以前のメンバー全員に感謝します。AIDS Clinical Trials GroupとACTG A5321チーム、サンプルキュレーションにご協力いただいたGorgas Memorial Institute for Health StudiesのSandra López-Vergès博士とDavis Beltrán氏に感謝いたします。最後に、Heliosマシンを使用してくださったMichael Leipold氏、Holden Maecker氏、Stanford Human Immune Monitoring Centerに感謝します。この研究は、NIH U19AI057229、NIH R21 AI135287、NIH R21 AI130532、NIH DP1 DA046089、Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Infectious Diseases #1016687からCB、NIH Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award T32 AI007502、TL1 TR001084、NIH/NIAID K08 AI138640 to EV、National Science Foundation Graduate Research Fellowship DGE-1656518 to JM、NIH training grant T32-AI-007290 (PI Olivia Martinez) の支援を受けました。ACTG研究は、AI-68634(統計データ管理センター)、UM1-A1-26617、AI-131798、およびAI-68636(ACTG)から助成金を受けました。CBは、スタンフォード母子健康研究所の小児トランスレーショナル医学のタシア・アンド・ジョン・モーリッジ・ファカルティ・スカラーであり、チャン・ザッカーバーグ・バイオハブの研究者です。