JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقوم هنا بتصميم لوحتين تكميليتين لقياس الكتلة الخلوية (CyTOF) وتحسين بروتوكول تلطيخ CyTOF بهدف تحديد ملامح مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية وذخيرة الترابط في وضع الالتهابات الفيروسية.

Abstract

الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي من بين أول المستجيبين للعدوى الفيروسية. يتم تنظيم قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية على التعرف بسرعة على الخلايا المصابة بالفيروسات وقتلها من خلال تعبيرها عن المستقبلات المثبطة والمنشطة المشفرة بالخط الجرثومي. يحدد تعشيق هذه المستقبلات بواسطة الروابط المماثلة على الخلايا المستهدفة ما إذا كان التفاعل بين الخلايا سيؤدي إلى قتل الخلايا القاتلة الطبيعية. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل تصميم وتحسين لوحتين تكميليتين لقياس الكتلة الخلوية (CyTOF). تم تصميم لوحة واحدة للنمط الظاهري لخلايا NK بناء على تعبير المستقبلات. تم تصميم اللوحة الأخرى لاستجواب التعبير عن الروابط المعروفة لمستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية في العديد من مجموعات الخلايا المناعية. تسمح هاتان اللوحان معا بتنميط ذخيرة مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية. علاوة على ذلك ، يوضح هذا البروتوكول أيضا تفاصيل العملية التي نقوم من خلالها بتلطيخ عينات CyTOF. تم تحسين هذه العملية لتحسين قابلية التكرار والتوحيد القياسي. تتمثل إحدى مزايا CyTOF في قدرتها على قياس أكثر من 40 علامة في كل لوحة ، مع الحد الأدنى من تداخل الإشارة ، مما يسمح للباحثين بالتقاط اتساع ذخيرة مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية. يقلل الترميز الشريطي للبلاديوم أيضا من التباين بين العينات ، وكذلك استهلاك الكواشف ، مما يسهل تلطيخ العينات مع كل لوحة بالتوازي. تشمل قيود هذا البروتوكول الإنتاجية المنخفضة نسبيا ل CyTOF وعدم القدرة على استعادة الخلايا بعد التحليل. تم تصميم هذه اللوحات لتحليل العينات السريرية من المرضى الذين يعانون من عدوى فيروسية حادة ومزمنة ، بما في ذلك فيروس حمى الضنك وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) والإنفلونزا. ومع ذلك ، يمكن استخدامها في أي مكان للتحقيق في ذخيرة مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية. الأهم من ذلك ، يمكن تطبيق هذه الأساليب على نطاق واسع على تصميم وتنفيذ لوحات CyTOF المستقبلية.

Introduction

الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي خلايا مناعية فطرية يتمثل دورها الأساسي في استهداف وقتل الخلايا الخبيثة أو المصابة أو المجهدة بطريقة أخرى. من خلال إفراز السيتوكينات مثل IFNγ و TNFα ، بالإضافة إلى نشاطها السام للخلايا ، يمكن للخلايا القاتلة الطبيعية أيضا تشكيل الاستجابة المناعية التكيفية لمسببات الأمراض والأورام الخبيثة. يتم التوسط في استجابة NK جزئيا عن طريق الإشارات الاندماجية للمستقبلات المثبطة والمنشطة المشفرة بالخط الجرثومي ، والتي تربط عددا لا يحصى من الروابط المعبر عنها على الخلايا المستهدفة المحتملة. تحتوي العديد من مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية على أكثر من رابط واحد مع تحديد أزواج جديدة من المستقبلات والترابط بانتظام.

هناك اهتمام خاص بدراسة الخلايا القاتلة الطبيعية في سياق الالتهابات الفيروسية ، حيث قد تؤدي قدرتها على الاستجابة السريعة للخلايا المجهدة إلى الحد من انتشار الفيروس أو تعزيز تطوير استراتيجيات التهرب من الخلايا القاتلة الطبيعية. يمتد هذا الاهتمام ببيولوجيا الخلايا القاتلة الطبيعية إلى مجال العلاج المناعي للسرطان حيث يبحث الباحثون في دور الخلايا القاتلة الطبيعية في المراقبة المناعية للورم وفي البيئة المكروية للورم1. ومع ذلك ، فإن القدرة على تحديد تفاعلات الخلايا المستهدفة لخلية NK معقدة بسبب حقيقة أن الخلايا البشرية يمكن أن تعبر عن أكثر من 30 مستقبلا والتي بدورها يمكن أن تتفاعل مع أكثر من 30 رابطامعروفا 2. لذلك ، فإن الكشف المتزامن لمستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية المتعددة والروابط المماثلة لها ضروري لالتقاط تعقيد تفاعلات المستقبل والترابط التي تتحكم في وظيفة NK. وبالتالي ، لجأنا إلى القياس الخلوي الكتلي (CyTOF) ، والذي يسمح بالكشف المتزامن لأكثر من 40 علامة على مستوى الخلية الواحدة. كان هدفنا هو إنشاء لوحتين من CyTOF لتعريف ذخيرة مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية. أردنا أيضا تصميم بروتوكول للمعالجة الفعالة وتلوين العينات السريرية. توفر العينات البشرية السريرية ثروة من المعلومات حول كيفية استجابة الجسم للعدوى الفيروسية. لذلك ، قمنا بتطوير هذا البروتوكول للتحقيق في التعبير عن مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية والروابط المماثلة لها بالتوازي من أجل توحيد أفضل ، وتحسين الانتعاش ، وتقليل استهلاك الكاشف ، وتأثيرات الدفعات المحدودة.

تم نشر العديد من لوحات قياس التدفق الخلوي المصممة لتوصيف النمط الظاهري لخلايا NK البشرية سابقا3،4،5،6،7،8. معظم هذه الألواح محدودة في قدرتها على التقاط اتساع ذخيرة المستقبلات والترابط ، مما يسمح فقط باكتشاف مجموعة محدودة من العلامات. علاوة على ذلك ، فإن هذه اللوحات محدودة بتداخل الإشارة بين الفلوروكروم. يستخدم CyTOF أجساما مضادة مترافقة مع النظائر المعدنية ، والتي تتم قراءتها بواسطة قياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة ، مما يقلل بشكل كبير من الامتداد بين القنوات.

مثلنا ، لجأ باحثون آخرون إلى CyTOF لدراسة الخلايا القاتلة الطبيعية9،10،11،12،13،14 ، على الرغم من وجود عدد أقل من علامات الخلايا القاتلة الطبيعية بشكل عام ، مما يقلل من عمق التنميط الظاهري. في حين أن بروتوكولات التلوين العامة التي تستخدمها هذه المجموعات مماثلة لبروتوكولاتنا ، إلا أن هناك بعض الاختلافات الرئيسية. لا تتضمن البروتوكولات الأخرى عزل الخلايا القاتلة الطبيعية قبل التلوين على الرغم من أن الباحثين مهتمون فقط بهذه المجموعة الفرعية13،14. بالنظر إلى أن الخلايا القاتلة الطبيعية تشكل فقط 5-20٪ من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) ، فإن تلطيخ PBMCs الكاملة بدلا من الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة يعني أن معظم الأحداث التي تم جمعها لن تكون خلايا NK. هذا يقلل من كمية البيانات التي تم إنشاؤها على المجموعة الفرعية ذات الاهتمام ويؤدي إلى الاستخدام غير الفعال لوقت الماكينة. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن العديد من هذه اللوحات تستجوب التعبير عن مستقبلات الخلايا القاتلة مثل المستقبلات الشبيهة ب Ig القاتلة (KIRs) و NKG2A / C / D ومستقبلات السمية الخلوية الطبيعية (NKp30 و NKp44 و NKp46) ، لا يتم وضع التعبير عن هذه العلامات في سياق أوسع بسبب عدم وجود بيانات حول التعبير عن الروابط الخاصة بها. وبالتالي ، في حين أن هذه الطرق المنشورة سابقا للتحقيق في خلايا NK عبر CyTOF كافية للتنميط الظاهري للخلايا القاتلة الطبيعية ، المستخدمة بمعزل عن بعضها البعض ، إلا أنها لا تستطيع تقديم صورة شاملة لنشاط الخلايا القاتلة الطبيعية. يقودنا هذا إلى الميزة الرئيسية للطرق الموضحة هنا ، وهي أنه حتى هذه اللحظة لا يوجد قياس التدفق الخلوي المنشور أو لوحات CyTOF التي تركز على استكشاف التعبير عن الروابط لمستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية. الأهم من ذلك ، أن لوحة الترابط الخاصة بنا تحتوي على العديد من القنوات المفتوحة للسماح بإضافة علامات لتناسب الاحتياجات الفريدة لكل تجربة.

بالنظر إلى أن أحد القيود الرئيسية ل CyTOF هو عدم القدرة على استعادة العينة بعد التحليل ، فقد لا تكون هذه الطريقة مناسبة للباحثين الذين لديهم عينات محدودة يهتمون بها بإجراء تجارب إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، تعني طبيعة الإنتاجية المنخفضة ل CyTOF أن البيانات التي تم إنشاؤها ستكون ذات جودة رديئة إذا كان عدد الخلايا منخفضا. باستثناء هذين القيدين ، ستعمل هذه الطريقة بشكل جيد في أي إعداد للتحقيق في تفاعلات المستقبلات والترابط بين الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المستهدفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم الحصول على PBMCs البالغين الأصحاء مجهولي المصدر من غرف نظام تقليل الصبغة التي تم شراؤها من مركز ستانفورد للدم. تم الحصول على PBMCs من متبرعين أصحاء من الأطفال ومرضى حمى الضنك الحادة لدى الأطفال من معهد جورجاس التذكاري للدراسات الصحية في مدينة بنما ، بنما والمستشفيات التابعة لوزارة الصحة ، ونظام الضمان الاجتماعي في مدينة بنما ، ومناطق الضواحي. تمت الموافقة على بروتوكول دراسة حمى الضنك من قبل IRB لمستشفى ديل نينيو (CBIHN-M-0634) ، ثم تمت الموافقة عليه من قبل لجان ICGES و CSS ومستشفى سانتو توماس وجامعة ستانفورد. تم الحصول على PBMCs من المرضى المصابين بفيروس العوز المناعي البشري الذين يتلقون العلاج المضاد للفيروسات القهقرية من دراسة ACTG A5321.

1. وضع العلامات على الأجسام المضادة ، وإعداد اللوحة ، والتخزين

  1. وضع العلامات على الأجسام المضادة بالنظائر المعدنية
    ملاحظة: لزيادة التوحيد القياسي بين التجارب للتلوين ، يوصى بإجراء اقترانات متعددة لكل جسم مضاد ثم دمج المنتجات في مزيج رئيسي واحد للتخزين طويل الأجل كما هو موضح أدناه.
    1. حدد تركيز كل جسم مضاد عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر قبل الاقتران. الأجسام المضادة المستخدمة لهذا البروتوكول متاحة تجاريا وتم شراؤها من البائعين المدرجين في جدول المواد.
    2. قم بتسمية الأجسام المضادة بالنظائر المعدنية باستخدام مجموعات ملصقات الأجسام المضادة المتوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم 100 ميكروغرام من الجسم المضاد لكل تفاعل.
    3. حدد التركيز النهائي للجسم المضاد المسترد عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر. تخزين الأجسام المضادة على المدى القصير عند 4 درجات مئوية.
  2. معايرة الأجسام المضادة
    ملاحظة: تقنية CyTOF حساسة للغاية للإشارات الملوثة المحتملة من المعادن البيئية. لذلك ، يجب تحضير جميع المخازن المؤقتة / الكواشف المستخدمة بالماء عالي النقاء وتخزينها في عبوات بلاستيكية أو زجاجية لم يتم غسلها بالصابون.
    1. إعداد أنابيب الطرد المركزي لكل متبرع تحتوي على 9 مل من RPMI الدافئ الكامل (RPMI 1640 ، 10٪ FBS ، 1٪ L-glutamine ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) و 20 ميكرولتر من البنزوناز لكل قارورة من PBMCs المراد إذابتها. قم بإذابة PBMCs في حمام مائي وأضفها إلى الأنابيب.
      ملاحظة: يقلل البنزوناز من اللزوجة والخلفية من الحمض النووي الحر من الخلايا المحللة.
    2. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بإعادة تعليق PBMCs في 5 مل من وسائط RPMI الكاملة والعد.
    3. لكل معايرة بالتحليل الحجمي ، قم بوضع 2-4 ملايين PBMCs / بئر في 6 آبار من صفيحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا (بئر واحد لكل عيار وواحد غير ملطخ). جهاز الطرد المركزي للوحة عند 600 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. انقر فوق اللوحة لإزالة المادة الطافية. أعد تعليق كل بئر في 200 ميكرولتر من CyPBS.
    4. قم بإجراء تلطيخ جدوى سيسبلاتين كما هو موضح أدناه.
      ملاحظة: يستخدم سيسبلاتين للتمييز بين الخلايا الحية والميتة في قياس الكتلة الخلوية.
      1. قم بتعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من مخزون سيسبلاتين 25 ميكرومتر. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
      2. قم بإخماد تفاعل السيسبلاتين بإضافة 100 ميكرولتر من FBS إلى كل بئر والخلط. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
        ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي اللاحقة عند 4 درجات مئوية.
      3. اغسل الخلايا مرتين ب 200 ميكرولتر من CyFACS (1x PBS بدون ملوثات المعادن الثقيلة في ماء فائق النقاء مع 0.1٪ BSA ، 0.05٪ أزيد الصوديوم). جهاز طرد مركزي ونفض الغبار على اللوحة في كل مرة.
    5. قم بمعايرة لوحة الأجسام المضادة السطحية كما هو موضح أدناه.
      ملاحظة: يجب عمل خلطات رئيسية منفصلة للوحة سطح NK ولوحة الترابط.
      1. قم بعمل مزيج رئيسي من جميع الأجسام المضادة السطحية بتركيز 10 ميكروغرام / مل باستخدام CyFACS. استهدف الحجم النهائي 150 ميكرولتر. قم بعمل تخفيفات تسلسلية 1: 2 باستخدام CyFACS ، للحصول على التركيزات التالية: 10 و 5 و 2.5 و 1.25 و 0.625 ميكروغرام / مل.
      2. قم بتصفية كوكتيلات الأجسام المضادة من خلال وحدة مرشح الطرد المركزي (حجم المسام 0.1 ميكرومتر) عند 10,600 × جم لمدة 3 دقائق قبل التلوين.
      3. أعد تعليق الخلايا المطلية في 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية عند العيار المعني. أعد تعليق البئر غير الملوثة في CyFACS. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
      4. اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من CyFACS. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
      5. اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من CyFACS. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
    6. قم بتثبيت الخلايا عن طريق إعادة تعليق كل بئر في 100 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) في CyPBS. احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة. اغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من CyFACS. جهاز طرد مركزي بحجم 700 × جم لمدة 5 دقائق.
      تنبيه: يشتبه في أن PFA يسبب عيوبا وراثية وكذلك السرطان. بالإضافة إلى ذلك ، فهو ضار إذا لامس العينين أو الجلد أو تم استنشاقه تعامل بشكل مناسب عن طريق ضمان التهوية الجيدة ، وفتح الوعاء بعناية ، ومنع تكون الهباء الجوي.
      ملاحظة: يتم إجراء جميع دورات أجهزة الطرد المركزي اللاحقة عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. نفاذية الخلايا عن طريق إعادة تعليق 200 ميكرولتر من 1x النفاذية العازلة (المخزن المؤقت بيرم) المخفف في ماء فائق النقاء. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة. اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من المحلول المؤقت بيرم. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
      ملاحظة: الحضانة في المخزن المؤقت Perm ليست ضرورية.
    8. معايرة لوحة الأجسام المضادة داخل الخلايا
      1. اصنع مزيجا رئيسيا من جميع الأجسام المضادة داخل الخلايا بتركيز 10 ميكروغرام / مل باستخدام Perm Buffer. اهدف إلى حجم نهائي يبلغ 150 ميكرولتر. قم بعمل تخفيفات تسلسلية 1: 2 باستخدام Perm Buffer للحصول على التركيزات التالية: 10 و 5 و 2.5 و 1.25 و 0.625 ميكروغرام / مل.
      2. قم بتصفية كوكتيلات الأجسام المضادة من خلال وحدة مرشح الطرد المركزي (حجم المسام 0.1 ميكرومتر) عند 10,600 × جم لمدة 3 دقائق قبل التلوين.
      3. أعد تعليق الخلايا المطلية في 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا عند العيار المعني. أعد تعليق البئر غير الملوثة في Perm Buffer. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.
        ملاحظة: إذا لم يتم معايرة اللوحة داخل الخلايا ، فأعد تعليق الآبار في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت بيرم.
      4. اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت بيرم. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
      5. اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من المحلول المؤقت بيرم. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
      6. اغسل الخلايا مرتين ب 200 ميكرولتر من CyFACS. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
    9. تلطيخ الحمض النووي
      ملاحظة: يرتبط Intercalator بالحمض النووي الخلوي ويستخدم لتحديد الخلايا المنواة في قياس الكتلة الخلوية.
      1. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من intercalator مخفف 1: 10,000 في CyPBS و 2٪ PFA. احتضان الطبق طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      2. قم بتخزين الأطباق ، إذا لزم الأمر ، على حرارة 4 درجات مئوية مغطاة بغشاء البارافين لمدة تصل إلى أسبوع.
        ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات أجهزة الطرد المركزي اللاحقة عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      3. قبل تشغيل العينات على CyTOF ، قم بإزالة فيلم البارافين من اللوحة وجهاز الطرد المركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقر فوق اللوحة. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر من CyFACS. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
      4. اغسل الخلايا ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من الماء فائق النقاء. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من الماء فائق النقاء. مباشرة قبل تشغيل العينة ، اضبط التركيز على حوالي 6 × 105 خلايا / مل في حبات التطبيع المخففة إلى تركيز 1x في الماء عالي النقاء.
    10. قم بتشغيل العينات على CyTOF.
    11. قم بتحليل البيانات واختيار العيارات المناسبة لكل جسم مضاد عن طريق اختيار أقل عيار للأجسام المضادة مما ينتج عنه أعلى شدة إشارة وأفضل فصل بين المجموعات السكانية الإيجابية والسلبية بناء على التقييم البصري.
      ملاحظة: يتم عرض المعايرة بالتحليل الحجمي للوحتين NK واللوحين الترابط في الشكل 1 والشكل 2 على التوالي. إذا لم يتم تحديد تمييز واضح بين المجموعات السكانية الإيجابية والسلبية، فيمكن تقييم العيارات على أنواع متعددة من الخلايا أو على خطوط الخلايا، للسماح بتحديد مجموعات الخلايا الإيجابية والسلبية.
    12. تخزين لوحة الأجسام المضادة
      1. اجمع بين الأجسام المضادة الممعايرة في مزيج رئيسي وقم بالتصفية من خلال وحدة فلتر حقنة معقمة 0.1 ميكرومتر. يجب عمل خلطات رئيسية منفصلة للوحة سطح NK ، واللوحة داخل الخلايا NK ، ولوحة الترابط.
      2. لتخزين الألواح على المدى الطويل ، اتبع أحد الخيارين المقبولين:
      3. أرسل المزيج الرئيسي إلى شركة خارجية للتجميد بالتجميد. يتم إستخدام هذه الطريقة للوحة NK. لا يمكن تجميد الأجسام المضادة غير المترافقة في المنزل ، بسبب وجود مثبت الأجسام المضادة ، مما يتداخل مع عملية التجميد بالتجميد. تضاف هذه الأجسام المضادة إلى اللوحة في يوم التلوين.
      4. استخدم ماصة مكرر لعمل 50 ميكرولتر من كل مزيج رئيسي وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

2. بروتوكول تلطيخ

  1. قم بإذابة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) كما هو موضح في الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2. خصص ما لا يقل عن 1 مليون PBMCs لتلوين لوحة الترابط في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. احتفظ ب PBMCs هذه على الجليد أثناء عزل الخلايا القاتلة الطبيعية.
  2. عزل الخلايا القاتلة الطبيعية
    ملاحظة: خطوات عزل الخلايا القاتلة الطبيعية التالية هي نسخة معدلة من بروتوكول مورد معين. ومع ذلك ، فإن أي مجموعة أو بروتوكول يقوم باختيار سلبي مغناطيسي لخلايا NK سيكون بديلا مناسبا. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الخطوة اختيارية لأن هذا البروتوكول مناسب أيضا للتنميط الظاهري لخلايا NK من PBMCs بأكملها.
    1. قم بتدوير PBMCs المتبقية عند 450 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS (PBS ، 0.5٪ BSA ، 2 ملي مولار EDTA) لكل 107 خلايا إجمالية.
    2. أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل البيوتين والأجسام المضادة للخلايا القاتلة الطبيعية لكل 107 خلايا إجمالية. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 5 دقائق على الثلج.
    3. أضف 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS لكل 10 7خلايا إجمالية و 20 ميكرولتر من كوكتيل MicroBead للخلايا القاتلة الطبيعية لكل 107 خلايا إجمالية. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 10 دقائق على الثلج.
    4. قم بإعداد أعمدة الشطف عن طريق الشطف ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS. أضف 2 مل من RPMI الكامل البارد إلى أنابيب تجميع 15 مل.
    5. أضف المخزن المؤقت MACS إلى الأنابيب التي تحتوي على خلايا لرفع الحجم إلى 500 ميكرولتر. اشطف الأنبوب ب 500 ميكرولتر أخرى من المخزن المؤقت MACS وانقله إلى العمود.
    6. بعد توقف التدفق ، اشطف عمود الشطف باستخدام 500 ميكرولتر من MACS المخزن المؤقت مرتين. بعد توقف التدفق ، عد الخلايا القاتلة الطبيعية.
  3. لوحة وغسل الخلايا.
    1. عزلت أجهزة الطرد المركزي الخلايا القاتلة الطبيعية و PBMCs عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بتعليق الخلايا بتركيز 5 ملايين خلية/مل في CyPBS (1x PBS بدون ملوثات المعادن الثقيلة في المياه فائقة النقاء). خلايا الصفيحة في صفيحة U ذات قاع 96 بئر.
      ملاحظة: يمكن لكل حصة من لوحة الخلايا القاتلة الطبيعية أن تلطخ ما يصل إلى 3 ملايين خلية. إذا تم ترميز ست عينات من الخلايا القاتلة الطبيعية وتجميعها قبل تلطيخها ، فيجب ألا يتجاوز العدد الإجمالي الإجمالي لخلايا NK 3 ملايين. يمكن للوحة الترابط تلطيخ ما يصل إلى 6 ملايين PBMCs لكل عينة. إذا تم ترميز ست عينات فردية وتجميعها قبل تلطيخها ، فيجب ألا يتجاوز العدد الإجمالي الإجمالي لثنائيات PBMCs 6 ملايين.
    2. لوحة الطرد المركزي عند 600 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. انقر فوق اللوحة لإزالة المادة الطافية.
      ملاحظة: قم بإجراء جميع دورات أجهزة الطرد المركزي اللاحقة عند 600 × جم لمدة 3 دقائق حتى الخطوة 2.7.
    3. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من CyPBS. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
  4. قم بإجراء تلطيخ جدوى سيسبلاتين كما هو موضح في الخطوة 1.2.4.
  5. تلطيخ الباركود
    ملاحظة: تستخدم هذه اللوحات جنبا إلى جنب مع طريقة ترميز شريطية معدلة من اثنين من أربعة قائمة على البلاديوم على الخلايا الحية غير الثابتة لتقليل تأثيرات الدفعات وزيادة استعادة الخلية15. ومع ذلك ، فإن هذه الخطوة اختيارية لأن الترميز الشريطي ليس ضروريا للحصول على بيانات عالية الجودة.
    1. أعد تعليق كل بئر في 50 ميكرولتر من الباركود المخلوط مسبقا واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من CyFACS. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
    2. اغسل الخلايا مرتين ب 200 ميكرولتر من CyFACS. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة. أعد تعليق جميع الآبار في 30 ميكرولتر من CyFACS. اجمع ما يصل إلى ستة آبار من الخلايا الملطخة برموز شريطية فريدة في بئر واحد وقم بإجراء الطرد المركزي ونقر اللوحة.
  6. تلطيخ السطح
    1. قم بإذابة الغلاف الليوسفير للوحة NK السطحي في 50 ميكرولتر من CyFACS مع الأجسام المضادة السطحية الإضافية (مضاد ل CD16 ، مضاد HLA-DR ، مضاد ل LILRB1). قم بإذابة الجليد في لوحة الترابط المخزنة عند -80 درجة مئوية وقم بتدوير الأنبوب باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. ارتفاع في علامات سطح لوحة الترابط الإضافية (مضاد ل CD16 ، مضاد ل CD19).
      ملاحظة: يجب ترشيح أي كوكتيل أجسام مضادة لم يتم ترشيحه مسبقا (أي قبل التجميد أو التجميد) من خلال وحدة مرشح الطرد المركزي (حجم المسام 0.1 ميكرومتر) عند 10,600 × جم لمدة 3 دقائق قبل التلوين.
    2. أعد تعليق كل بئر في 50 ميكرولتر من اللوحة المعنية. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من CyFACS. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة. اغسل الخلايا مرة أخرى ب 200 ميكرولتر من CyFACS. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
  7. إصلاح الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2.6.
    ملاحظة: قم بإجراء جميع دورات أجهزة الطرد المركزي اللاحقة عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. تخلل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2.7.
  9. تلطيخ داخل الخلايا
    1. قم بإذابة الطبقة الليوسفيرية للوحة NK داخل الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت بيرم. قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا لعينات PBMC إذا رغبت في ذلك.
      ملاحظة: يجب ترشيح أي كوكتيل أجسام مضادة لم يتم ترشيحه مسبقا (أي قبل التجميد أو التجميد) من خلال وحدة مرشح الطرد المركزي (حجم المسام 0.1 ميكرومتر) عند 10,600 × جم لمدة 3 دقائق قبل التلوين.
    2. أعد تعليق الآبار في 50 ميكرولتر من الألواح داخل الخلايا المعنية. إذا لم يتم استخدام لوحة داخل الخلايا جنبا إلى جنب مع لوحة سطح الترابط ، فقم بإعادة تعليق آبار PBMC في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت Perm. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.
    3. اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت بيرم. جهاز طرد مركزي ولوحة نفض الغبار اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من المحلول المؤقت بيرم. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
    4. اغسل الخلايا مرتين ب 200 ميكرولتر من CyFACS. جهاز طرد مركزي ونقر اللوحة.
  10. تلطيخ الحمض النووي. قم بإجراء تلطيخ محترم الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 1.2.9.1. احتضان الطبق طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يرتبط Intercalator بالحمض النووي الخلوي ويستخدم لتحديد الخلايا المنواة في قياس الكتلة الخلوية. يمكن تخزين الأطباق مغطاة بغشاء البارافين لمدة تصل إلى أسبوع عند 4 درجات مئوية.
  11. قبل تشغيل العينات على CyTOF ، اغسل الخلايا كما هو موضح في الخطوتين 1.2.9.3 و 1.2.9.4.
  12. قم بتشغيل العينات على CyTOF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم اقتران الأجسام المضادة مع النظائر المعدنية باستخدام مجموعات الملصقات المتاحة تجاريا ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم التحقق من صحة استنساخ الأجسام المضادة عن طريق قياس التدفق الخلوي وقياس الكتلة الخلوية قبل استخدامها في هذه اللوحة. تم اختيار قائ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نصف هنا تصميم وتطبيق لوحتين مجانيتين من CyTOF تهدف إلى تحديد ملامح ذخيرة مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية. يتضمن هذا البروتوكول العديد من الخطوات الحاسمة للحصول على بيانات عالية الجودة. يستخدم CyTOF أيونات المعادن الثقيلة ، بدلا من الفلوروكرومات ، كمجسات تسمية للأجسام

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر بليش الذين ساهموا في هذه الجلسة. شكرا لمجموعة التجارب السريرية للإيدز وفريق ACTG A5321 وكذلك الدكتورة ساندرا لوبيز فيرجيس وديفيس بيلتران في معهد جورجاس التذكاري للدراسات الصحية لتنظيم العينات. أخيرا ، شكرا لمايكل ليبولد وهولدن مايكر ومركز ستانفورد لمراقبة المناعة البشرية لاستخدام آلات Helios الخاصة بهم. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة U19AI057229 ، والمعاهد الوطنية للصحة R21 AI135287 ، والمعاهد الوطنية للصحة R21 AI130532 ، والمعاهد الوطنية للصحة DP1 DA046089 ، ومحققي صندوق بوروز ويلكوم في التسبب في الأمراض المعدية # 1016687 إلى CB ، وجائزة المعاهد الوطنية للصحة روث إل كيرششتاين لخدمة البحوث المؤسسية T32 AI007502 و TL1 TR001084 و NIH / NIAID K08 AI138640 إلى EV ، وزمالة أبحاث الدراسات العليا لمؤسسة العلوم الوطنية DGE-1656518 إلى JM ومنحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة T32-الذكاء الاصطناعي-007290 (PI Olivia Martinez). تلقت دراسة ACTG دعما من الذكاء الاصطناعي-68634 (مركز إدارة البيانات والبيانات) و UM1-A1-26617 و الذكاء الاصطناعي-131798 و الذكاء الاصطناعي-68636 (ACTG). CB هو باحث في كلية تاشيا وجون مورجريدج في الطب الانتقالي للأطفال من معهد ستانفورد لأبحاث صحة الأم والطفل وباحث في Chan Zuckerberg Biohub.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
89YSigma-Aldrich204919
102-Palladium nitrateTrace Sciences InternationalSpecial Order
104-Palladium nitrateTrace Sciences InternationalSpecial Order
106-Palladium nitrateTrace Sciences InternationalSpecial Order
108-Palladium nitrateTrace Sciences InternationalSpecial Order
115InTrace Sciences InternationalSpecial Order
141PrFluidigm201141A
142NdFluidigm201142A
143NdFluidigm201143A
144NdFluidigm201144A
145NdFluidigm201145A
146NdFluidigm201146A
147SmFluidigm201147A
148NdFluidigm201148A
149SmFluidigm201149A
150NdFluidigm201150A
151EuFluidigm201151A
152SmFluidigm201152A
153EuFluidigm201153A
154SmFluidigm201154A
155GdFluidigm201155A
156GdFluidigm201156A
157GdTrace Sciences InternationalN/A
158GdFluidigm201158A
159TbFluidigm201159A
160GdFluidigm201160A
161DyFluidigm201161A
162DyFluidigm201162A
163DyFluidigm201163A
164DyFluidigm201164A
165HoFluidigm201165A
166ErFluidigm201166A
167ErFluidigm201167A
168ErFluidigm201168A
169TmFluidigm201169A
170ErFluidigm201170A
171YbFluidigm201171A
172YbFluidigm201172A
173YbFluidigm201173A
174YbFluidigm201174A
175LuFluidigm201175A
176YbFluidigm201176A
209Bi anti-CD16Fluidigm3209002BClone 3G8. Used at a 1:50 dilution. 
697 cellsCreative BioarrayCSC-C0217
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 0.5 with Ultracel-30 Membrane, 30 kDaMilliporeUFC503096
Anhydrous acetonitrileFisher ScientificBP1165-50
anti-2B4Biolegend329502Clone C1.7.
anti-B7-H6R&D SystemsMAB7144Clone 875001.
anti-CCR2Biolegend357202Clone K036C2.
anti-CD2Biolegend300202Clone RPA-2.10.
anti-CD3Biolegend300402Clone UCHT1.
anti-CD4Biolegend317402Clone OKT4.
anti-CD4Biolegend344602Clone SK3.
anti-CD7Biolegend343102Clone CD7-6B7.
anti-CD8Biolegend344702Clone SK1.
anti-CD11bBiolegend301302Clone ICRF44.
anti-CD14Biolegend301802Clone M5E2.
anti-CD19Biolegend302202Clone HIB19.
anti-CD33Biolegend303402Clone WM53.
anti-CD38Biolegend303502Clone HIT2.
anti-CD48Biolegend336702Clone BJ40.
anti-CD56BD Pharmingen559043Clone NCAM16.2.
anti-CD57Biolegend322302Clone HCD57.
anti-CD62LBiolegend304802Clone DREG-56.
anti-CD69Biolegend310902Clone FN50.
anti-CD94Biolegend305502Clone DX22.
anti-CD95Biolegend305602Clone DX2.
anti-CD155Biolegend337602Clone SKII.4.
anti-CXCR6Biolegend356002Clone K041E5.
anti-DNAM-1BD Biosciences559787Clone DX11.
anti-DR4Biolegend307202Clone DJR1.
anti-DR5Biolegend307302Clone DJR2-2.
anti-FAS-LBiolegend306402Clone NOK-1.
anti-FcRgMillipore06-727Polyclonal antibody.
anti-HLA-C,EMilliporeMABF233Clone DT9.
anti-HLA-Bw4Miltenyi BiotecSpecial OrderClone REA274.
anti-HLA-Bw6Miltenyi Biotec130-124-530Clone REA143.
anti-HLA-DRBiolegend307602Clone L243.
anti-HLA-EBiolegend342602Clone 3D12.
anti-ICAM-1Biolegend353102Clone HA58.
anti-Ki-67Biolegend350502Clone Ki-67.
anti-KIR2DL1/KIR2DS5R&D SystemsMAB1844Clone 143211.
anti-KIR2DL3R&D SystemsMAB2014Clone 180701.
anti-KIR2DL5Miltenyi Biotec130-096-200Clone UP-R1.
anti-KIR2DS4R&D SystemsMAB1847Clone 179315.
anti-KIR3DL1BD Biosciences555964Clone DX-9.
anti-LFA-3Biolegend330902Clone TS2/9.
anti-LILRB1R&D Systems292319Clone MAB20172.
anti-LLT-1R&D SystemsAF3480Clone 402659.
anti-MICAR&D SystemsMAB1300-100Clone 159227.
anti-MICBR&D SystemsMAB1599-100Clone 236511.
anti-Nectin-1Biolegend340402Clone R1.302.
anti-Nectin-2Biolegend337402Clone TX31.
anti-NKG2AR&D SystemsMAB1059Clone 131411.
anti-NKG2CR&D SystemsMAB1381Clone 134522.
anti-NKG2DBiolegend320802Clone 1D11.
anti-NKp30Biolegend325202Clone P30-15.
anti-NKp44Biolegend325102Clone P44-8.
anti-NKp46Biolegend331902Clone 9E2.
anti-NTB-ABiolegend317202Clone NT-7.
anti-Pan HLA class IBiolegend311402Clone W6/32.
anti-PD1Biolegend329902Clone EH12.2H7.
anti-PerforinAbcamab47225Clone B-D48.
anti-Siglec-7Biolegend347702Clone S7.7.
anti-SykBiolegend644302Clone 4D10.2.
anti-TACTILEBiolegend338402Clone NK92.39.
anti-TIGITR&D SystemsMAB7898Clone 741182.
anti-ULBP-1R&D SystemsMAB1380-100Clone 170818.
anti-ULBP-2, 5, 6R&D SystemsMAB1298-100Clone 165903.
Antibody StabilizerCandor Bioscience131 050
Benzonase NucleaseMillipore70664
Bond-Breaker TCEP SolutionThermo Fisher Scientific77720
Bovine Serum Albumin solutionSigma-AldrichA9576
Calcium chloride dihydrate (CaCl2+2H2O)Sigma-Aldrich223506-25G
Cis-Platinum(II)diamine dichloride (cisplatin)Enzo Life SciencesALX-400-040-M250A 100 mM stock solution was prepared in DMSO and divided into 25 µL aliquots. Used at a 25 µM dilution for live/dead stain. Signal appears in 194Pt and 195Pt channels.
DMSOSigma-AldrichD2650
eBioscience Permeabilization BufferThermo Fisher Scientific00-8333-56
EDTA (0.5 M)HoeferGR123-100A double-concentrated HEPES buffer with EDTA was made according to the following recipe: 1.3 g NaCl (Thermo Fisher Scientific), 27 mg CaCl2+2H2O (Sigma-Aldrich), 23 mg MgCl2 (Sigma-Aldrich), 83.6 mg KH2PO4 (Thermo Fisher Scientific), 4 mL of 1M HEPES (Thermo Fisher Scientific), 2 mL of 0.5M EDTA (Hoefer, Holliston, MA, USA), and 100mL H2O. The pH of this double-concentrated HEPES buffer was adjusted to a pH of 7.3 using 1M HCl and 1M NaOH.
EQ Four Element Calibration BeadsFluidigm201078
Fetal Bovine SerumThermo Fisher ScientificN/A
Helios mass cytometerFluidigmN/A
HEPES (1M)Thermo Fisher Scientific15630080
HyClone Antibiotic/Antimycotic Solution (Pen/Strep/Fungiezone) solutionFisher ScientificSV3007901
Iridium - 191Ir/193Ir intercalatorDVS Sciences (Fluidigm)201192BUsed at a 1:10000 dilution.
Isothiocyanobenzyl-EDTA (ITCB-EDTA)Dojindo Molecular Technologies, Inc.M030-10Diluted to 1.25 mg/mL in anhydrous acetonitrile.
K562 cellsAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC CCL-243
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher ScientificSH30034
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
Maxpar X8 Antibody Labeling KitsFluidigmN/ANo catalog number as kits come with metals. 
Millex-VV Syringe Filter Unit, 0.1 µmMilliporeSLVV033RS
Milli-Q Advantage A10 Water Purification SystemMilliporeZ00Q0V0WW
MS ColumnsMiltenyi Biotec
NALM6 cellsAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC CRL-3273
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 3KPall CorporationOD003C35
NK Cell Isolation Kit, humanMiltenyi Biotec130-092-657
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15710
PBSThermo Fisher Scientific10010023
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificMP021954531
Qdot 655 anti-CD19Thermo Fisher ScientificQ10179Clone SJ25-C1. Used at a 1:50 dilution. Signal appears in 112Cd-114Cd channels. 
Qdot 655 anti-HLA-DRThermo Fisher ScientificQ22158Clone Tü36. Used at a 1:200 dilution.
Rockland PBSRockland Immunochemicals, Inc.MB-008 Used to make CyPBS (10X Rockland PBS diluted to 1X in Milli-Q water) and CyFACS buffers (10X Rockland PBS diluted to 1X in Milli-Q water with 0.1% BSA and 0.05% sodium azide). Buffers were sterile-filtered through a 0.22 µM filter and sotred at 4°C in Stericup bottles. 
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific21870092
Sodium azide (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration SystemMillipore SigmaS2GPU10RE
Tuning solutionFluidigm201072
Washing solution Fluidigm201070

References

  1. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (3), 200-218 (2020).
  2. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
  3. Eller, M. A., Currier, J. R. OMIP-007: phenotypic analysis of human natural killer cells. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (6), 447-449 (2012).
  4. Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-029: Human NK-cell phenotypization. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 87 (11), 986-988 (2015).
  5. Hammer, Q., Romagnani, C. OMIP-039: Detection and analysis of human adaptive NKG2C + natural killer cells : Detection of Human Adaptive NKG2C + NK Cells. Cytometry. 91 (10), 997-1000 (2017).
  6. Liechti, T., Roederer, M. OMIP-058: 30-Parameter flow cytometry panel to characterize iNKT, NK, unconventional and conventional T cells. Cytometry. 95 (9), 946-951 (2019).
  7. Béziat, V., et al. NK cell responses to cytomegalovirus infection lead to stable imprints in the human KIR repertoire and involve activating KIRs. Blood. 121 (14), 2678-2688 (2013).
  8. Pfefferle, A., et al. Intra-lineage plasticity and functional reprogramming maintain natural killer cell repertoire diversity. Cell Reports. 29 (8), 2284-2294 (2019).
  9. Barcenilla, H., Åkerman, L., Pihl, M., Ludvigsson, J., Casas, R. Mass cytometry identifies distinct subsets of regulatory T cells and Natural killer cells associated with high risk for Type 1 diabetes. Frontiers in Immunology. 10, 982(2019).
  10. Kurioka, A., et al. CD161 defines a functionally distinct subset of pro-inflammatory Natural killer cells. Frontiers in Immunology. 9, 486(2018).
  11. Romee, R., et al. Cytokine-induced memory-like natural killer cells exhibit enhanced responses against myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 8 (357), (2016).
  12. Shinko, D., et al. Mass cytometry reveals a sustained reduction in CD16+ Natural killer cells following chemotherapy in colorectal cancer patients. Frontiers in Immunology. 10, 2584(2019).
  13. Pohlmeyer, C. W., et al. Identification of NK cell subpopulations that differentiate HIV-infected subject cohorts with diverse levels of virus control. Journal of Virology. 93 (7), 01790(2019).
  14. Palgen, J. -L., et al. NK cell immune responses differ after prime and boost vaccination. Journal of Leukocyte Biology. 105 (5), 1055-1073 (2019).
  15. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  16. Takahashi, C., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
  17. Baumgart, S., Peddinghaus, A., Schulte-Wrede, U., Mei, H. E., Grützkau, A. OMIP-034: Comprehensive immune phenotyping of human peripheral leukocytes by mass cytometry for monitoring immunomodulatory therapies. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 34-38 (2017).
  18. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 87 (5), 380-382 (2015).
  19. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  20. Leipold, M. D., Newell, E. W., Maecker, H. T. Multiparameter phenotyping of human PBMCs using mass cytometry. Methods in Molecular Biology. 1343, 81-95 (2015).
  21. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (6), 467-475 (2012).
  22. Zivanovic, N., Jacobs, A., Bodenmiller, B. A practical guide to multiplexed mass cytometry. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 95-109 (2014).
  23. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150 (3), 248-264 (2017).
  24. Wilk, A. J., et al. Charge-altering releasable transporters enable specific phenotypic manipulation of resting primary natural killer cells. BioRxiv. , 970491(2020).
  25. Vendrame, E., et al. TIGIT is upregulated by HIV-1 infection and marks a highly functional adaptive and mature subset of natural killer cells. AIDS. 34 (6), 801-813 (2020).
  26. Zhao, N. Q., et al. Natural killer cell phenotype is altered in HIV-exposed seronegative women. PloS One. 15 (9), 0238347(2020).
  27. McKechnie, J. L., et al. HLA upregulation during dengue virus infection suppresses the natural killer cell response. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 268(2019).
  28. McKechnie, J. L., et al. Mass cytometry analysis of the NK cell receptor-ligand repertoire reveals unique differences between dengue-infected children and adults. ImmunoHorizons. 4 (10), 634-647 (2020).
  29. Ranganath, T., et al. Characterization of the impact of daclizumab beta on circulating natural killer cells by mass cytometry. Frontiers in immunology. 11, 714(2020).
  30. Fernandez, I. Z., et al. A novel human IL2RB mutation results in T and NK cell--driven immune dysregulation. The Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1255-1267 (2019).
  31. Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (45), 9626-9634 (2017).
  32. Nikzad, R., et al. Human natural killer cells mediate adaptive immunity to viral antigens. Science Immunology. 4 (35), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CyTOF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved