Elaboración de perfiles del repertorio de receptores-ligandos de células asesinas naturales humanas

Aquí diseñamos dos paneles complementarios de citometría de masas (CyTOF) y optimizamos un protocolo de tinción de CyTOF con el objetivo de perfilar el receptor de células asesinas naturales y el repertorio de ligandos en el contexto de infecciones virales.

Las células asesinas naturales (NK) se encuentran entre las primeras en responder a las infecciones virales. La capacidad de las células NK para reconocer y matar rápidamente las células infectadas por el virus está regulada por su expresión de receptores inhibidores y activadores codificados por la línea germinal. La participación de estos receptores por parte de sus ligandos afines en las células diana determina si la interacción intercelular dará lugar a la muerte de las células NK. Este protocolo detalla el diseño y optimización de dos paneles complementarios de citometría de masas (CyTOF). Se diseñó un panel para fenotipar las células NK en función de la expresión del receptor. El otro panel fue diseñado para interrogar la expresión de ligandos conocidos para los receptores de células NK en varios subconjuntos de células inmunitarias. Juntos, estos dos paneles permiten el perfil del repertorio de receptores-ligandos de células NK humanas. Además, este protocolo también detalla el proceso mediante el cual tiñimos muestras para CyTOF. Este proceso se ha optimizado para mejorar la reproducibilidad y la estandarización. Una ventaja de CyTOF es su capacidad para medir más de 40 marcadores en cada panel, con una superposición mínima de señales, lo que permite a los investigadores capturar la amplitud del repertorio de receptores y ligandos de células NK. El código de barras de paladio también reduce la variación entre muestras, así como el consumo de reactivos, lo que facilita la tinción de muestras con cada panel en paralelo. Las limitaciones de este protocolo incluyen el rendimiento relativamente bajo de CyTOF y la incapacidad de recuperar células después del análisis. Estos paneles fueron diseñados para el análisis de muestras clínicas de pacientes que padecen infecciones virales agudas y crónicas, incluyendo el virus del dengue, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la influenza. Sin embargo, se pueden utilizar en cualquier entorno para investigar el repertorio de ligandos receptores de células NK humanas. Es importante destacar que estos métodos se pueden aplicar ampliamente al diseño y la ejecución de futuros paneles CyTOF.

Las células asesinas naturales (NK) son células inmunitarias innatas cuya función principal es atacar y matar las células malignas, infectadas o estresadas. A través de su secreción de citocinas como IFNγ y TNFα, así como su actividad citotóxica, las células NK también pueden dar forma a la respuesta inmunitaria adaptativa a patógenos y neoplasias malignas. La respuesta NK está mediada en parte por la señalización combinatoria de receptores inhibidores y activadores codificados por la línea germinal, que se unen a una miríada de ligandos expresados en las células diana potenciales. Varios receptores de células NK tienen más de un ligando, y regularmente se identifican nuevos pares receptor-ligando.

Existe un interés particular en el estudio de las células NK en el contexto de las infecciones virales, donde su capacidad para responder rápidamente a las células estresadas puede limitar la propagación viral o promover el desarrollo de estrategias de evasión de células NK. Este interés en la biología de las células NK se extiende al campo de la inmunoterapia contra el cáncer, donde los investigadores están investigando el papel de las células NK en la inmunovigilancia tumoral y en el microambiente^{tumoral 1}. Sin embargo, la capacidad de perfilar las interacciones entre células NK y células diana se complica por el hecho de que las células NK humanas pueden expresar más de 30 receptores que, a su vez, pueden interactuar con más de 30 ligandos^conocidos. Por lo tanto, la detección simultánea de múltiples receptores de células NK y sus ligandos afines es necesaria para capturar la complejidad de las interacciones receptor-ligando que controlan la función de NK. En consecuencia, recurrimos a la citometría de masas (CyTOF), que permite la detección simultánea de más de 40 marcadores a nivel de una sola célula. Nuestro objetivo era crear dos paneles CyTOF para perfilar el repertorio de receptores-ligandos de células NK. También queríamos diseñar un protocolo para el procesamiento y la tinción efectivos de las muestras clínicas. Las muestras clínicas humanas proporcionan una gran cantidad de información sobre cómo responde el cuerpo a la infección viral. Por lo tanto, desarrollamos este protocolo para investigar la expresión de los receptores de células NK y sus ligandos afines en paralelo para una mejor estandarización, una mejor recuperación, un menor consumo de reactivos y efectos de lote limitados.

Anteriormente se han publicado varios paneles de citometría de flujo diseñados para caracterizar el fenotipo de las células NK humanas 3,4,5,6,7,8. La mayoría de estos paneles tienen una capacidad limitada para capturar la amplitud del repertorio receptor-ligando, lo que solo permite la detección de una selección limitada de marcadores. Además, estos paneles están limitados por la superposición de señales entre fluorocromos. CyTOF utiliza anticuerpos conjugados con isótopos metálicos, que se leen mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo, lo que reduce drásticamente el desbordamiento entre canales.

Al igual que nosotros, otros investigadores han recurrido a CyTOF para estudiar las células NK 9,10,11,12,13,14, aunque generalmente con menos marcadores de células NK, lo que reduce la profundidad del fenotipado. Si bien los protocolos generales de tinción utilizados por estos grupos son similares a los nuestros, existen algunas diferencias clave. Otros protocolos no implican el aislamiento de las células NK antes de la tinción, aunque los investigadores solo están interesados en ese subconjunto^13,14. Dado que las células NK solo constituyen el 5-20% de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), la tinción de PBMC completas en lugar de células NK aisladas significa que la mayoría de los eventos recopilados no serán células NK. Esto reduce la cantidad de datos generados en el subconjunto de interés y da como resultado un uso ineficiente del tiempo de la máquina. Además, aunque muchos de estos paneles interrogan la expresión de los receptores de las células NK, como los receptores asesinos similares a Ig (KIR), NKG2A/C/D y los receptores naturales de citotoxicidad (NKp30, NKp44 y NKp46), la expresión de estos marcadores no se sitúa en un contexto más amplio debido a la ausencia de datos sobre la expresión de sus respectivos ligandos. En consecuencia, si bien estos métodos publicados anteriormente para investigar las células NK a través de CyTOF son suficientes para el fenotipado amplio de células NK, utilizados de forma aislada, no pueden proporcionar una imagen completa de la actividad de las células NK. Esto nos lleva a la principal ventaja de los métodos aquí descritos, que es que hasta el momento no hay citometría de flujo publicada ni paneles CyTOF centrados en explorar la expresión de ligandos para los receptores de células NK. Es importante destacar que nuestro panel de ligandos tiene varios canales abiertos para permitir la adición de marcadores para adaptarse a las necesidades únicas de cada experimento.

Teniendo en cuenta que una de las principales limitaciones de CyTOF es la imposibilidad de recuperar la muestra después del análisis, este método puede no ser apropiado para los investigadores que tienen muestras limitadas con las que están interesados en realizar experimentos adicionales. Además, la naturaleza de bajo rendimiento de CyTOF significa que los datos generados serán de mala calidad si el número inicial de celdas es bajo. A excepción de estas dos limitaciones, este método funcionará bien en cualquier entorno para investigar las interacciones receptor-ligando entre las células NK y las células diana.

Las PBMC anónimas de adultos sanos se obtuvieron de cámaras del sistema de leucorreducción compradas al Centro de Sangre de Stanford. Los PBMC de donantes pediátricos sanos no identificados y pacientes pediátricos con dengue agudo se obtuvieron del Instituto Conmemorativo de Estudios en Salud Gorgas en la Ciudad de Panamá, Panamá y hospitales pertenecientes al Ministerio de Salud, el Sistema de Seguro Social en la Ciudad de Panamá y áreas suburbanas. El protocolo del estudio del dengue fue aprobado por el IRB del Hospital del Niño (CBIHN-M-0634), luego aprobado por los comités del ICGES, CSS, Hospital Santo Tomás y Universidad de Stanford. Las PBMC de pacientes infectados por el VIH en tratamiento antirretroviral se obtuvieron del estudio A5321 del ACTG.

1. Etiquetado de anticuerpos, preparación del panel y almacenamiento

1. Marcaje de anticuerpos con isótopos metálicos
   NOTA: Para aumentar la estandarización interexperimental de la tinción, se recomienda realizar múltiples conjugaciones para cada anticuerpo y luego combinar los productos en una sola mezcla maestra para el almacenamiento a largo plazo como se describe a continuación.
   1. Determine la concentración de cada anticuerpo midiendo la absorbancia a 280 nm antes de la conjugación. Los anticuerpos utilizados para este protocolo están disponibles comercialmente y se compraron a los proveedores enumerados en la Tabla de materiales.
   2. Etiquete los anticuerpos con isótopos metálicos utilizando los kits de etiquetado de anticuerpos disponibles en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice 100 μg de anticuerpo para cada reacción.
   3. Determine la concentración final del anticuerpo recuperado midiendo la absorbancia a 280 nm. Almacene los anticuerpos a corto plazo a 4 °C.
2. Titulaciones de anticuerpos
   NOTA: La tecnología CyTOF es muy sensible a las posibles señales contaminantes de los metales ambientales. Por lo tanto, todos los tampones/reactivos utilizados deben prepararse con agua ultrapura y almacenarse en recipientes de plástico o vidrio que nunca hayan sido lavados con jabón.
   1. Prepare tubos de centrífuga para cada donante que contengan 9 mL de RPMI tibia y completa (RPMI 1640, 10% FBS, 1% L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina) y 20 μL de benzonasa por vial de PBMC a descongelar. Descongele los PBMC en un baño de agua y agréguelos a los tubos.
      NOTA: La benzonasa disminuye la viscosidad y el fondo del ADN libre de las células lisadas.
   2. Centrifugar a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Vuelva a suspender los PBMC en 5 mL de medios RPMI completos y conte.
   3. Para cada valoración del panel, coloque de 2 a 4 millones de PBMC/pocillo en 6 pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo redondo (un pocillo para cada título y otro para el sin teñir). Centrifugar la placa a 600 x g a temperatura ambiente durante 3 min. Agite la placa para eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender cada pocillo en 200 μL de CyPBS.
   4. Realice la tinción de viabilidad con cisplatino como se describe a continuación.
      NOTA: El cisplatino se utiliza para discriminar las células vivas de las muertas en la citometría de masas.
      1. Vuelva a suspender las células en 100 μL de 25 μM de cisplatino. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min.
      2. Apague la reacción del cisplatino agregando 100 μL de FBS a cada pocillo y mezclando. Centrifuga y golpea el plato.
         NOTA: Realice todos los pasos posteriores de la centrífuga a 4 °C.
      3. Lave las celdas dos veces con 200 μL de CyFACS (1x PBS sin contaminantes de metales pesados en agua ultrapura con 0,1% de BSA, 0,05% de azida de sodio). Centrifuga y agita el plato cada vez.
   5. Valore el panel de anticuerpos de superficie como se describe a continuación.
      NOTA: Se deben hacer mezclas maestras separadas para el panel de superficie NK y el panel de ligandos.
      1. Realice una mezcla maestra de todos los anticuerpos de superficie a una concentración de 10 μg/mL utilizando CyFACS. Aspire a un volumen final de 150 μL. Realice diluciones en serie 1:2 con CyFACS, para obtener las siguientes concentraciones: 10, 5, 2,5, 1,25 y 0,625 μg/mL.
      2. Filtre los cócteles de anticuerpos a través de una unidad de filtro centrífugo (tamaño de poro de 0,1 μm) a 10.600 x g durante 3 minutos antes de la tinción.
      3. Vuelva a suspender las células en placa en 50 μL del cóctel de anticuerpos de superficie en el título respectivo. Vuelva a suspender el pocillo no manchado en CyFACS. Incubar a 4 °C durante 30 min.
      4. Lavar las células con 150 μL de CyFACS. Centrifuga y golpea el plato.
      5. Lavar las células con 200 μL de CyFACS. Centrifuga y golpea el plato.
   6. Realizar la fijación de las células resuspendiendo cada pocillo en 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 2% en CyPBS. Incubar la placa a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 min. Lavar las células con 100 μL de CyFACS. Centrífuga a 700 x g durante 5 min.
      PRECAUCIÓN: Se sospecha que el PFA causa defectos genéticos, así como cáncer. Además, es perjudicial si entra en contacto con los ojos, la piel o se inhala. Manipule adecuadamente asegurando una buena ventilación, abriendo el receptáculo con cuidado y evitando la formación de aerosoles.
      NOTA: Todos los centrifugados posteriores se realizan a 700 x g durante 5 min a 4 °C.
   7. Permeabilizar las células mediante la resuspensión en 200 μL de 1x tampón de permeabilización (tampón permanente) diluido en agua ultrapura. Centrifuga y golpea el plato. Lavar las celdas con 200 μL de tampón permanente. Centrifuga y golpea el plato.
      NOTA: No es necesaria la incubación en el tampón de permanente.
   8. Titulación del panel de anticuerpos intracelulares
      1. Realice una mezcla maestra de todos los anticuerpos intracelulares a una concentración de 10 μg/mL utilizando Perm Buffer. Aspire a un volumen final de 150 μL. Realice diluciones en serie 1:2 con Perm Buffer para obtener las siguientes concentraciones: 10, 5, 2,5, 1,25 y 0,625 μg/mL.
      2. Filtre los cócteles de anticuerpos a través de una unidad de filtro centrífugo (tamaño de poro de 0,1 μm) a 10.600 x g durante 3 minutos antes de la tinción.
      3. Vuelva a suspender las células plateadas en 50 μL del cóctel de anticuerpos intracelulares en el título respectivo. Vuelva a suspender el pocillo sin manchar en Perm Buffer. Incubar a 4 °C durante 45 min.
         NOTA: Si no se va a valorar un panel intracelular, vuelva a suspender los pocillos en 50 μL del tampón de permanente.
      4. Lavar las celdas con 150 μL de tampón permanente. Centrifuga y golpea el plato.
      5. Lavar las celdas con 200 μL de tampón permanente. Centrifuga y golpea el plato.
      6. Lave las células dos veces con 200 μL de CyFACS. Centrifuga y golpea el plato.
   9. Tinción intercaladora de ADN
      NOTA: El intercalador se une al ácido nucleico celular y se utiliza para identificar células nucleadas en citometría de masas.
      1. Resuspender las células en 200 μL de intercalador diluido 1:10.000 en CyPBS y PFA al 2%. Incubar la placa durante la noche a 4 °C.
      2. Guarde los platos, si es necesario, a 4 °C cubiertos con una película de parafina hasta por una semana.
         NOTA: Realice todos los pasos posteriores de la centrífuga a 700 x g durante 5 min a 4 °C.
      3. Antes de ejecutar las muestras en CyTOF, retire la película de parafina de la placa y centrifuga a 700 x g durante 5 min a 4 °C. Golpea el plato. Lave las células una vez con 200 μL de CyFACS. Centrifuga y golpea el plato.
      4. Lave las células tres veces con 200 μL de agua ultrapura. Centrifuga y golpea el plato. Resuspender las células en 200 μL de agua ultrapura. Inmediatamente antes de ejecutar la muestra, ajuste la concentración a aproximadamente 6 x 10⁵ células/mL en perlas de normalización diluidas a una concentración de 1x en agua ultrapura.
   10. Ejecute las muestras en CyTOF.
   11. Analice los datos y elija los títulos adecuados para cada anticuerpo seleccionando el título de anticuerpos más bajo, que da como resultado la intensidad de señal más alta y la mejor separación entre las poblaciones positivas y negativas en función de la evaluación visual.
       NOTA: Las valoraciones para los paneles NK y ligando se muestran en la Figura 1 y la Figura 2 respectivamente. Si no se identifica una distinción clara entre poblaciones positivas y negativas, los títulos se pueden evaluar en múltiples tipos de células o en líneas celulares, para permitir la identificación de poblaciones de células positivas y negativas.
   12. Almacenamiento del panel de anticuerpos
       1. Combine los anticuerpos titulados en una mezcla maestra y filtre a través de una unidad de filtro de jeringa estéril de 0,1 μm. Se deben hacer mezclas maestras separadas para el panel de superficie NK, el panel intracelular NK y el panel de ligandos.
       2. Para el almacenamiento a largo plazo de paneles, siga una de las dos opciones aceptables:
       3. Envíe la mezcla maestra a una empresa externa para su liofilización. Este método se utiliza para el panel NK. Los anticuerpos no conjugados internamente no se pueden liofilizar, debido a la presencia de estabilizador de anticuerpos, que interfiere con el proceso de liofilización. Estos anticuerpos se añaden al panel el día de la tinción.
       4. Utilice una pipeta repetidora para hacer alícuotas de 50 μL de cada mezcla maestra y almacenarlas a -80 °C.

2. Protocolo de tinción

1. Descongele las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como se describe en los pasos 1.2.1 y 1.2.2. Reserve al menos 1 millón de PBMC para la tinción del panel de ligandos en un tubo de centrífuga de 15 mL. Mantenga estos PBMC en hielo durante el aislamiento de la celda NK.
2. Aislamiento de células NK
   NOTA: Los siguientes pasos de aislamiento de celdas NK son una versión modificada del protocolo de un proveedor específico. Sin embargo, cualquier kit o protocolo que realice una selección negativa de células NK basada en el magnetismo sería una alternativa adecuada. Además, este paso es opcional, ya que este protocolo también es adecuado para el fenotipado de células NK a partir de PBMC completas.
   1. Gire los PBMC restantes a 450 x g durante 5 minutos. Resuspenda el pellet de celda en 40 μL de tampón MACS (PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) por cada 10⁷ células totales.
   2. Agregue 10 μL de cóctel de biotina-anticuerpo de células NK por cada 10⁷ células en total. Mezclar bien e incubar durante 5 min en hielo.
   3. Agregue 30 μL de tampón MACS por cada 10⁷ celdas totales y 20 μL de MicroBead Cocktail de celdas NK por cada 10⁷ celdas totales. Mezclar bien e incubar durante 10 min en hielo.
   4. Prepare las columnas de elución enjuagando con 500 μL de tampón MACS. Agregue 2 mL de RPMI completo frío a los tubos de recolección de 15 mL.
   5. Añada tampón MACS a los tubos que contengan células para aumentar el volumen hasta 500 μL. Pipetee todo el volumen de 500 μL en la columna de elución preparada. Enjuague el tubo con otros 500 μL de tampón MACS y transfiéralo a la columna.
   6. Una vez que se haya detenido el flujo, enjuague la columna de elución con 500 μL de tampón MACS dos veces. Una vez que se haya detenido el flujo, cuente las células NK.
3. Placas y celdas de lavado.
   1. Centrifugar celdas NK aisladas y PBMC a 300 x g a temperatura ambiente durante 10 min. Resuspender las células a una concentración de 5 millones de células/mL en CyPBS (1x PBS sin contaminantes de metales pesados en agua ultrapura). Celdas de placa en una placa de 96 pocillos con fondo en U.
      NOTA: Cada alícuota del panel de células NK puede teñir hasta 3 millones de células. Si se codifican seis muestras individuales de células NK y se agrupan antes de la tinción, el número total combinado de células NK no debe exceder los 3 millones. El panel de ligandos puede teñir hasta 6 millones de PBMC por muestra. Si se codifican seis muestras individuales con códigos de barras y se agrupan antes de la tinción, el número total combinado de PBMC no debe exceder los 6 millones.
   2. Placa centrífuga a 600 x g a temperatura ambiente durante 3 min. Agite la placa para eliminar el sobrenadante.
      NOTA: Realice todos los giros posteriores de la centrífuga a 600 x g durante 3 minutos hasta el paso 2.7.
   3. Resuspender las células en 200 μL de CyPBS. Centrifuga y golpea el plato.
4. Realice la tinción de viabilidad con cisplatino como se describe en el paso 1.2.4.
5. Tinción de códigos de barras
   NOTA: Estos paneles se utilizan junto con un método de código de barras modificado a base de paladio dos de cuatro en celdas vivas no fijadas para minimizar los efectos de lote y maximizar la recuperación de celdas¹⁵. Sin embargo, este paso es opcional, ya que el código de barras no es necesario para obtener datos de calidad.
   1. Vuelva a suspender cada pocillo en 50 μL del código de barras premezclado respectivo e incube a 4 °C durante 30 min. Lavar las células con 150 μL de CyFACS. Centrifuga y golpea el plato.
   2. Lave las células dos veces con 200 μL de CyFACS. Centrifuga y golpea el plato. Vuelva a suspender todos los pocillos en 30 μL de CyFACS. Combine hasta seis pocillos de células teñidas con códigos de barras únicos en un pocillo y realice la centrifugación y el movimiento de la placa.
6. Tinción superficial
   1. Disuelva la superficie de la liosfera del panel NK en 50 μL de CyFACS con anticuerpos de superficie adicionales enriquecidos (anti-CD16, anti-HLA-DR, anti-LILRB1). Descongele el panel de ligandos almacenado a -80 °C y centrifuga el tubo descendente con una minicentrífuga. Pico en marcadores de superficie de panel de ligandos adicionales (anti-CD16, anti-CD19).
      NOTA: Cualquier cóctel de anticuerpos que no haya sido filtrado previamente (es decir, antes de la liofilización o congelación) debe filtrarse a través de una unidad de filtro centrífugo (tamaño de poro de 0,1 μm) a 10.600 x g durante 3 minutos antes de la tinción.
   2. Vuelva a suspender cada pocillo en 50 μL del panel respectivo. Incubar a 4 °C durante 30 min. Lavar las células con 150 μL de CyFACS. Centrifuga y golpea el plato. Lavar las células de nuevo con 200 μL de CyFACS. Centrifuga y golpea el plato.
7. Fije las celdas como se describe en el paso 1.2.6.
   NOTA: Realice todos los centrifugados posteriores a 700 x g durante 5 min a 4 °C.
8. Permeabilice las células como se describe en el paso 1.2.7.
9. Tinción intracelular
   1. Disuelva la liosfera del panel NK intracelular en 50 μL de tampón de Perm. Prepare un cóctel de anticuerpos intracelulares para muestras de PBMC si así lo desea.
      NOTA: Cualquier cóctel de anticuerpos que no haya sido filtrado previamente (es decir, antes de la liofilización o congelación) debe filtrarse a través de una unidad de filtro centrífugo (tamaño de poro de 0,1 μm) a 10.600 x g durante 3 minutos antes de la tinción.
   2. Resuspender los pocillos en 50 μL de los respectivos paneles intracelulares. Si no se utiliza un panel intracelular junto con el panel de superficie del ligando, vuelva a suspender los pocillos de PBMC en 50 μL del tampón de Perm. Incubar a 4 °C durante 45 min.
   3. Lavar las celdas con 150 μL de tampón permanente. Centrífuga y placa de golpeo. Lavar las celdas con 200 μL de tampón permanente. Centrifuga y golpea el plato.
   4. Lave las células dos veces con 200 μL de CyFACS. Centrifuga y golpea el plato.
10. Tinción intercaladora de ADN. Realice la tinción del intercalador de ADN como se describe en el paso 1.2.9.1. Incubar la placa durante la noche a 4 °C.
    NOTA: El intercalador se une al ácido nucleico celular y se utiliza para identificar células nucleadas en citometría de masas. Las placas se pueden almacenar cubiertas con film de parafina hasta una semana a 4 °C.
11. Antes de ejecutar las muestras en CyTOF, lave las células como se describe en los pasos 1.2.9.3 y 1.2.9.4.
12. Ejecute muestras en CyTOF.

Los anticuerpos se conjugaron con isótopos metálicos utilizando kits de etiquetado disponibles en el mercado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los clones de anticuerpos se validaron mediante citometría de flujo y citometría de masas antes de su uso en este panel. Se seleccionó una lista inicial de clones basada en la revisión de la literatura y la disponibilidad de anticuerpos. Los niveles de expresión de algunos ligandos para los r...

Aquí describimos el diseño y la aplicación de dos paneles CyTOF complementarios destinados a perfilar el repertorio de receptores-ligandos de células NK. Este protocolo incluye varios pasos que son críticos para obtener datos de calidad. CyTOF utiliza iones de metales pesados, en lugar de fluorocromos, como sondas de marcaje para anticuerpos¹⁹. Por lo tanto, esta tecnología está sujeta a posibles señales contaminantes de los metales ambientales

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores desean agradecer a todos los miembros actuales y anteriores del Laboratorio Blish que contribuyeron a este panel. Gracias al Grupo de Ensayos Clínicos sobre el SIDA y al equipo de ACTG A5321, así como a la Dra. Sandra López-Vergès y Davis Beltrán del Gorgas Memorial Institute for Health Studies por la selección de muestras. Finalmente, gracias a Michael Leipold, Holden Maecker y el Centro de Monitoreo Inmunológico Humano de Stanford por el uso de sus máquinas Helios. Este trabajo fue apoyado por NIH U19AI057229, NIH R21 AI135287, NIH R21 AI130532, NIH DP1 DA046089 y Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Infectious Diseases # 1016687 a CB, NIH Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award T32 AI007502, TL1 TR001084 y NIH/NIAID K08 AI138640 a EV, National Science Foundation Graduate Research Fellowship DGE-1656518 a JM y NIH Training Grant T32-AI-007290 (PI Olivia Martinez). El estudio ACTG recibió subvenciones de AI-68634 (Centro de Gestión Estadística y de Datos), UM1-A1-26617, AI-131798 y AI-68636 (ACTG). CB es becario de la facultad Tashia y John Morgridge en Medicina Traslacional Pediátrica del Instituto de Investigación de Salud Materno-Infantil de Stanford e investigador del Chan Zuckerberg Biohub.