Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Глиобластома является разрушительной формой первичного рака головного мозга, и лазерная интерстициальная тепловая терапия становится многообещающей альтернативой традиционной хирургической резекции при неоперабельной глиобластоме. Этот протокол описывает оптимизированную доклиническую мышиную модель, которая может быть использована для изучения эффектов лечения или адъювантного и комбинаторного лечения.
Глиобластома (ГБ), наиболее агрессивная форма первичного рака головного мозга, составляет примерно половину всех первичных опухолей головного мозга высокой степени злокачественности у взрослых и не имеет лечения. Лазерная интерстициальная термическая терапия (ЛИТТ) является одобренным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) методом лечения ГБ и используется у пациентов, которые не могут быть кандидатами на обычную хирургическую резекцию. Несмотря на то, что клиническая эффективность ЛИТТ была установлена, исследования, выходящие за рамки клинических исследований и серий случаев, ограничены и затруднены из-за отсутствия установленной модели на животных. В этом протоколе используются мыши C57BL/6 и сингенная клеточная линия CT2A глиомы рака для точного повторения человеческого GB, а также используется легированный неодимом лазер на иттрий-алюминиевом гранате (Nd:YAG) с длиной волны 1064 нм, который используется в одной из двух одобренных FDA систем LITT, что обеспечивает превосходную доклиническую значимость. Успешное создание этой мышиной модели LITT обеспечит ценную платформу для исследования уникальных особенностей абляции LITT и ее влияния на микроокружение опухоли, что потенциально может привести к улучшению терапевтических стратегий.
Рак является основной причиной смерти номер один в Канаде. Глиобластома (ГБ), наиболее распространенная форма агрессивной опухоли головного мозга, составляет от 48% до 60% всех первичных опухолей головного мозга высокой степени злокачественностиу взрослых. Прогноз для ГБ особенно мрачный: 5-летняя чистая выживаемость составляет 4,8% при традиционном лечении, включая хирургическую резекцию, химио- и лучевую терапию.
Лазерная интерстициальная термическая терапия (LITT) является одобренной FDA процедурой с использованием лазера для гипертермической абляции опухолей in-situ у пациентов с неоперабельными опухолями головного мозга и представляет собой привлекательную терапевтическую альтернативу традиционной хирургической резекции3. Тем не менее, подробная и хорошо охарактеризованная мышиная модель лечения ЛИТТ при ГБ отсутствует, что препятствует доклиническим исследованиям.
Этот протокол направлен на демонстрацию оптимизированной доклинической мышиной модели для лечения ГБ с помощью ЛИТТ. Для этой модели мы решили использовать мышей C57BL/6 и линию сингенных клеток глиомы CT2A в первую очередь потому, что CT2A близко повторяет ГБ человека высокой степени злокачественности с аналогичными гистологическими особенностями, инвазивностью, химио- и радиорезистентностью, а также стволовыми особенностями с самообновлением и восстановлением опухолей4. Эти характеристики обеспечивают отличную платформу для различных исследований, связанных с иммунными реакциями или новыми терапевтическими стратегиями. Кроме того, технические аспекты этого протокола LITT также легко адаптируются для других моделей мышей алло- и ксенотрансплантатов 4,5,6, которые будут обсуждаться далее.
Преимущества этого протокола включают в себя стабильные результаты с простой, но эффективной парадигмой лечения ЛИТТ. Используемый лазер на основе иттрий-алюминиевого граната (Nd:YAG) с длиной волны волны 1064 нм аналогичен тому, который используется в клинической практике в одной из двух систем, одобренных FDA, что позволяет проводить эксперименты, которые тесно связаны с клиническим применением LITT для лечения глиомы высокой степени злокачественности. Основным недостатком этого протокола является чрезвычайная осторожность, которую необходимо проявлять как во время имплантации опухолевых клеток, так и при лечении ЛИТТ для достижения воспроизводимых результатов. Кроме того, из-за агрессивной природы клеточной линии CT2A протокол очень чувствителен ко времени. Большинство экспериментов должно быть завершено максимум за 20 дней, что может ограничить исследования некоторых адаптивных иммунных реакций или других клеточных и молекулярных механизмов, происходящих в течение более длительного периода времени.
Этика животных для этого протокола была одобрена Комитетом по уходу за животными Университета Манитобы в соответствии с этическими принципами, установленными Канадским советом по уходу за животными (CCAC). В этом протоколе использовались 8-12-недельные иммунокомпетентные мыши C57BL/6 и сингенная клеточная линия глиомы CT2A для доклинической модели с широким спектром применений, включая эксперименты, направленные на гистологический анализ, иммунологические изменения или комбинаторные терапевтические вмешательства. Протокол может быть легко адаптирован к другим видам мышей или клеточным линиям в зависимости от требований эксперимента.
Рисунок 1: Графическая схема базового плана эксперимента. Создано с BioRender.com Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.
1. Коротко о подготовке клеток (День 0)
ПРИМЕЧАНИЕ: Если автоматическая машина для подсчета клеток недоступна, ручной подсчет может быть выполнен с помощью гемоцитометра.
2. Ортотопическая имплантация (день 0)
Рисунок 2: Графическая иллюстрация черепа мыши и важные анатомические ориентиры для стереотаксической хирургии. Создано с BioRender.com Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.
Рисунок 3: Графическая иллюстрация с указанием мест расположения заусенцев и лазерной аппаратуры. Иллюстрация, показывающая взаимное расположение ориентира в Брегме, (A) начальное отверстие для лазерного волокна (A') и (B) второе, или расширенное, отверстие для зонда термопары (B'). Справа показано вырезное изображение датчиков лазерного волокна и термопары, иллюстрирующее, как преобразователи стабилизируются в стереотаксической торцевой ножке с предварительно просверленными отверстиями нужного размера и расстояния. Создано с BioRender.com Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.
3. Мониторинг опухолевой нагрузки до ЛИТТ (день 9)
4. Операция LITT (день 10)
5. Оценка после LITT (День 11)
6. Окончание обучения (День 11/День 15/День 20)
7. Анализ
Успешную имплантацию опухоли CT2A и лечение ЛИТТ можно охарактеризовать с помощью Т2-взвешенной МРТ, как показано на рисунках 4, 5 и 6. МР-изображения были получены с помощью сверхпроводящего магнита без криогена 7 ...
Существует быстро растущий объем литературы о LITT; Однако в основном он ограничен клиническими исследованиями на людях или сериями случаев. Действительно, было продемонстрировано несколько потенциальных преимуществ для ЛИТТ, включая более низкую частоту послеопера?...
Мы благодарны за поддержку со стороны Monteris Medical, в том числе за безвозмездную передачу лазерного оборудования.
Источниками финансирования этого проекта являются Совет по естественным наукам и инженерии Канады (NSERC)-Alliance, Mitacs-Accelerate, Research Manitoba-IPOC, Канадские институты исследований в области здравоохранения (CIHR) CGS-M и Стипендия для выпускников Университета Манитобы. Клеточная линия глиомы CT2A щедро пожертвована доктором Питером Феччи из Университета Дьюка, Дарем, Северная Каролина. Мы также хотели бы поблагодарить Лабораторию гистологической службы и Центр визуализации мелких животных и материалов Университета Манитобы за их прекрасную техническую помощь в этом проекте.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Absorbion Spears | FST | 18105-01 | Hemostatic sponges. |
Adson tissue forceps | FST | 11006-12 | |
C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | Strain #000664 | 6 to 12 week old male and female |
Cotton Tipped Applicators (6") | Electron Microscopy Sciences | 72308 | |
CT2A glioma cell line | Generously donated from Dr. Peter Fecci, Duke University. | ||
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Biotechne, R&D systems | 3433-010-01 | |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
Dual-chamber slides | BIO-RAD | 1450003 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22363352 | |
Ethyl Alcohol Anhydrous | Greenfield Global | P016EAAN | Dilute to 70% with ddH2O |
Fetal Bovine Serum, qualified, Canada | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12483020 | |
Glad Press-n-Seal plastic wrap | Amazon.ca | 12587704417 | |
High speed drill | Kopf Instruments | Model 1474 | |
K & J Thermocouple temerpature meter | Omega | HH509R | |
Metacam (meloxicam) | WDDC | 114424 | |
Microinjection syringe pump | WPI | UMP3T-1 | |
Microliter syringe (700 Series) | Hamilton | 87908 | Custom needles are available. A steep needle bevel helps with precise delivery, and a shorter needle length helps with stability. |
Needle driver/Needle Holder | FST | 12500-12 | A fine tip is most suitable due to the confined working space, but many styles are suitable based on handle preference. |
Opixcare Plus opthalmic ointment | WDDC | 135941 | |
Phosphate Buffered Saline (10x) | Fisher bioreagents | BP399-4 | Dilute to 1x with ddH2O |
Povidone-iodine | ThermoFisher Scientific | 3955-16 | Aliquat into into smaller tubes for use with cotton tipped applicators. |
Saline (normal) | WDDC | 126588 | |
Scalpel, single use (#15 Blade) | Feather | Feather NO15 | |
Scissors, fine surgical | FST | 91460-11 | Fine student scissors, Iris, or Bonn are all suitable. |
Stereotactic frame | Kopf Instruments | Model 940 | With digital display console and mouse nose-cone and ear-bars. |
Stereotactic syringe holder | Kopf Instruments | Model 1772-F | If not using an injection pump. |
Sutures (5-0 monofilament) | Ethicon | MCP463G | Monocryl violet monofilament with reverse cutting tip |
Syringe, 28 G (0.5 mL) | BD | BD 329461 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes |
TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | |
Thermocouple probe, fine diameter (Type K) | Omega | TJM-CA316-IM025G-150 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco, ThermoFisher Scientific | 25200072 | |
Vetbond by 3M, veterinary tissue glue | WDDC | 126125 | |
Wahl Peanut Clippers | WDDC/Wahl | 100963 | Also available directly from manufacturer. |
Warming pad | Bensen Medical | 70308/121873 | Any similar item can be used. |
Webcol Alcohol preps | Electron Microscopy Sciences | 71005-20 | Alcohol prep wipe, 2-ply, medium size. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены