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Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Le glioblastome est une forme dévastatrice de cancer primitif du cerveau, et la thérapie thermique interstitielle au laser apparaît comme une alternative prometteuse à la résection chirurgicale conventionnelle pour le glioblastome inopérable. Ce protocole décrit un modèle murin préclinique optimisé qui peut être utilisé pour étudier les effets du traitement ou les traitements adjuvants et combinatoires.
Le glioblastome (GB), la forme la plus agressive de cancer primitif du cerveau, représente environ la moitié de toutes les tumeurs cérébrales primaires de haut grade chez les adultes et n’a pas de remède. La thérapie thermique interstitielle au laser (LITT) est un traitement approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) pour l’GB et est utilisée chez les patients qui peuvent ne pas être candidats à une résection chirurgicale conventionnelle. Bien que l’efficacité clinique de la LITT ait été établie, la recherche au-delà des études de cas cliniques et des séries de cas est limitée et entravée par l’absence d’un modèle animal établi. Ce protocole utilise des souris C57BL/6 et une lignée cellulaire de gliome syncgénique CT2A pour récapituler étroitement la GB humaine tout en utilisant également un laser à grenat d’yttrium et d’aluminium dopé au néodyme (Nd :YAG) de 1064 nm, tel qu’il est utilisé dans l’un des deux systèmes LITT approuvés par la FDA, offrant une excellente pertinence préclinique. La mise en place réussie de ce modèle murin LITT fournira une plate-forme précieuse pour étudier les caractéristiques uniques de l’ablation LITT et ses effets sur le microenvironnement tumoral, conduisant potentiellement à de meilleures stratégies thérapeutiques.
Le cancer est la principale cause de décès au Canada. Le glioblastome (GB), la forme la plus courante de tumeur cérébrale agressive, représente 48 % à 60 % de toutes les tumeurs cérébrales primaires de haut grade chez les adultes1. Le pronostic de l’GB est particulièrement sombre avec une survie nette à 5 ans de 4,8 % avec les traitements conventionnels, y compris la résection chirurgicale, la chimiothérapie et la radiothérapie 1,2.
La thérapie thermique interstitielle au laser (LITT) est une procédure approuvée par la FDA utilisant un laser pour l’ablation hyperthermique in situ des tumeurs chez les patients atteints de tumeurs cérébrales inopérables et offre une alternative thérapeutique attrayante à la résection chirurgicale conventionnelle3. Cependant, il n’existe pas de modèle murin détaillé et bien caractérisé pour le traitement par LITT de l’GB et entrave la recherche préclinique.
Ce protocole vise à présenter un modèle murin préclinique optimisé pour le traitement de la GB par LITT. Nous avons choisi d’utiliser des souris C57BL/6 et la lignée cellulaire de gliome syngénique CT2A pour ce modèle, principalement parce que CT2A récapitule étroitement les GB humains de haut grade avec des caractéristiques histologiques similaires, un caractère invasif, une chimiorésistance et une radiorésistance, et des caractéristiques semblables à celles d’une tige avec auto-renouvellement et rétablissement des tumeurs4. Ces caractéristiques constituent une excellente plate-forme pour une variété d’études impliquant des réponses immunitaires ou de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus, les aspects techniques de ce protocole LITT sont également facilement adaptables à d’autres modèles murins d’allo- et xénogreffes 4,5,6, qui seront discutés plus en détail.
Les avantages de ce protocole comprennent des résultats cohérents avec un paradigme de traitement LITT simple mais efficace. Le laser Yttrium Aluminium Garnet (Nd :YAG) dopé au néodyme de 1064 nm utilisé est le même que celui utilisé cliniquement dans l’un des deux systèmes actuellement approuvés par la FDA, permettant des expériences qui sont étroitement parallèles à l’application clinique de la LITT pour le traitement du gliome de haut grade. Le principal inconvénient de ce protocole est le soin extrême qui doit être apporté à la fois lors de l’implantation de cellules tumorales et du traitement LITT pour obtenir des résultats reproductibles. De plus, en raison de la nature agressive de la lignée cellulaire CT2A, le protocole est très sensible au temps. La plupart des expériences devront être terminées dans un délai maximum de 20 jours, ce qui peut limiter les recherches sur certaines réponses immunitaires adaptatives ou d’autres mécanismes cellulaires et moléculaires se produisant sur une plus longue période.
L’éthique animale de ce protocole a été approuvée par le Comité de protection des animaux de l’Université du Manitoba, conformément aux lignes directrices éthiques établies par le Conseil canadien de protection des animaux (CCPA). Ce protocole a utilisé des souris immunocompétentes C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines et la lignée cellulaire de gliome syngénique CT2A pour un modèle préclinique avec un large éventail d’applications, y compris des expériences axées sur l’analyse histologique, les changements immunologiques ou les interventions thérapeutiques combinatoires. Le protocole peut être facilement adapté à d’autres espèces de souris ou lignées cellulaires en fonction des exigences expérimentales.
Figure 1 : Schéma graphique de la conception expérimentale de base. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1. La préparation cellulaire en bref (Jour 0)
REMARQUE : Si une machine de comptage de cellules automatisée n’est pas disponible, un comptage manuel peut être effectué à l’aide d’un hémocytomètre.
2. Implantation orthotopique (Jour 0)
Figure 2 : Illustration graphique d’un crâne de souris et de repères anatomiques importants pour la chirurgie stéréotaxique. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Illustration graphique indiquant l’emplacement des trous de bavure et de l’appareil laser. Illustration montrant les positions relatives du point de repère Bregma, (A) le trou de bavure initial pour la fibre laser (A') et (B) le deuxième trou de bavure ou le trou de bavure étendu, pour la sonde de thermocouple (B'). Une représentation découpée des sondes laser à fibre et à thermocouple est illustrée à droite, illustrant comment les sondes sont stabilisées dans un pied d’extrémité stéréotaxique avec des trous pré-percés à la taille et à l’espacement souhaités. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Surveillance de la charge tumorale avant la LITT (jour 9)
4. Chirurgie LITT (Jour 10)
5. Évaluation post-LITT (jour 11)
6. Fin de l’étude (Jour 11/Jour 15/Jour 20)
7. Analyse
L’implantation réussie de la tumeur CT2A et les traitements LITT peuvent être caractérisés à l’aide de l’IRM pondérée T2, comme le montrent les figures 4, 5 et 6. Des images IRM ont été obtenues à l’aide d’un aimant supraconducteur sans cryogène 7T avec un alésage de 17 cm et une bobine de tête de souris en quadrature en utilisant les paramètres de séquence ...
Il existe une littérature en expansion rapide concernant le LITT ; Cependant, elle est principalement limitée aux études de cas cliniques humaines ou aux séries de cas. En effet, plusieurs avantages potentiels de la LITT ont été démontrés, notamment des taux de complications postopératoires et des coûts plus faibles tout en conférant une survie sans progression comparable 7,8,9,10,11....
Nous sommes reconnaissants du soutien de Monteris Medical, y compris le don en nature d’équipement laser.
Les sources de financement de ce projet comprennent l’Alliance du Conseil de recherches en sciences naturelles et de génie du Canada (CRSNG), Mitacs-Accélération, Research Manitoba-IPOC, la BESC-M des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et la bourse d’études supérieures de l’Université du Manitoba. Lignée cellulaire de gliome CT2A généreusement offerte par le Dr Peter Fecci de l’Université Duke, Durham, Caroline du Nord. Nous tenons également à remercier le Laboratoire du service d’histologie et la plateforme d’imagerie des petits animaux et des matériaux de l’Université du Manitoba pour leur excellente aide technique dans le cadre de ce projet.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Absorbion Spears | FST | 18105-01 | Hemostatic sponges. |
Adson tissue forceps | FST | 11006-12 | |
C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | Strain #000664 | 6 to 12 week old male and female |
Cotton Tipped Applicators (6") | Electron Microscopy Sciences | 72308 | |
CT2A glioma cell line | Generously donated from Dr. Peter Fecci, Duke University. | ||
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Biotechne, R&D systems | 3433-010-01 | |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
Dual-chamber slides | BIO-RAD | 1450003 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22363352 | |
Ethyl Alcohol Anhydrous | Greenfield Global | P016EAAN | Dilute to 70% with ddH2O |
Fetal Bovine Serum, qualified, Canada | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12483020 | |
Glad Press-n-Seal plastic wrap | Amazon.ca | 12587704417 | |
High speed drill | Kopf Instruments | Model 1474 | |
K & J Thermocouple temerpature meter | Omega | HH509R | |
Metacam (meloxicam) | WDDC | 114424 | |
Microinjection syringe pump | WPI | UMP3T-1 | |
Microliter syringe (700 Series) | Hamilton | 87908 | Custom needles are available. A steep needle bevel helps with precise delivery, and a shorter needle length helps with stability. |
Needle driver/Needle Holder | FST | 12500-12 | A fine tip is most suitable due to the confined working space, but many styles are suitable based on handle preference. |
Opixcare Plus opthalmic ointment | WDDC | 135941 | |
Phosphate Buffered Saline (10x) | Fisher bioreagents | BP399-4 | Dilute to 1x with ddH2O |
Povidone-iodine | ThermoFisher Scientific | 3955-16 | Aliquat into into smaller tubes for use with cotton tipped applicators. |
Saline (normal) | WDDC | 126588 | |
Scalpel, single use (#15 Blade) | Feather | Feather NO15 | |
Scissors, fine surgical | FST | 91460-11 | Fine student scissors, Iris, or Bonn are all suitable. |
Stereotactic frame | Kopf Instruments | Model 940 | With digital display console and mouse nose-cone and ear-bars. |
Stereotactic syringe holder | Kopf Instruments | Model 1772-F | If not using an injection pump. |
Sutures (5-0 monofilament) | Ethicon | MCP463G | Monocryl violet monofilament with reverse cutting tip |
Syringe, 28 G (0.5 mL) | BD | BD 329461 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes |
TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | |
Thermocouple probe, fine diameter (Type K) | Omega | TJM-CA316-IM025G-150 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco, ThermoFisher Scientific | 25200072 | |
Vetbond by 3M, veterinary tissue glue | WDDC | 126125 | |
Wahl Peanut Clippers | WDDC/Wahl | 100963 | Also available directly from manufacturer. |
Warming pad | Bensen Medical | 70308/121873 | Any similar item can be used. |
Webcol Alcohol preps | Electron Microscopy Sciences | 71005-20 | Alcohol prep wipe, 2-ply, medium size. |
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