発生生物学の主な目標は、遺伝子の文脈固有の役割を理解することです。そして、これは従来のノックアウト突然変異体によって、または構成的な過剰発現線によって達成することは困難であり得る。モジュラーグリーンゲートクローニングシステムを用いて、モデル植物シロイヌナズナの3つの主要なメリステムに誘導可能な細胞特異的発現のためのリソースを生成しました。
同じモジュラークローニング戦略を使用して、この方法は、変換に不変である他の植物種に適用することができます。この手順の視覚的なデモンストレーションは、ステムと短い頂点のメリステムにおけるトランス活性化の効果を分析するには、イメージング前に解剖が必要であり、非常に困難であるため、貴重です。まず、テキストプロトコルで概説されているように種子を殺菌します。
次に、pH 5.8で半強度のムラシゲとスクーグ培地を準備し、1%のスクロースと0.9%寒天を加えます。オートクレーブ処理後、DMSOに溶解したDexを誘導プレートに10~30マイクロモルの最終濃度で加えます。コントロールプレートに同量のDMSOを追加します。
皿の上に根イメージングのための種子を置き、暗闇の中で48時間、摂氏4度でそれらを層化します。プレートを植物のインキュベーターの垂直位置に入れ、5日間成長させます。発芽の5日後、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して苗を画像化します。
まず、テキスト プロトコルで説明されているようにシードを準備し、拡大します。発芽後6~7日後、各苗を別々の鍋に移します。水を入れ、植物を誘導する場合は、25ミクロモルDEX溶液を水中に使用し、エタノールに溶解した25ミリモルDEXのストックから調製した。
2~3日ごとに水が誘導の所望の時間まで。浸漬によって誘導する場合は、25マイクロモル最終濃度またはDEXと模擬処理のためのDMSOの同等量で0.02%シルウェットL77とDEXを含む水の750ミリリットルで1リットルビーカーを調製します。1つの植物を誘導または模擬溶液に30秒間浸します。
2~3日ごとに、望ましい撮影時間まで繰り返します。まず、テキスト プロトコルで説明されているようにシードを準備し、拡大します。発芽後6~7日後、各苗を別々の鍋に移します。
茎の長さ約1センチメートルの場合、水中に10〜50マイクロモルDEX溶液を使用して蛍光SAMをスプレーします。開発の後期段階での誘導およびイメージングのために、より長い茎または側面の芽のSAMを誘導する。誘導後24~48時間、SAMを解剖し、イメージングに進みます。
まず、ウオジジウムプロピジウムのミリレター溶液あたり10マイクログラムにプレートから苗を移し、それらを5分間対抗します。根を顕微鏡イメージングチャンバーに入れ、63倍の水浸し目的を持つ共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して画像化します。ヨウ化プロピジウム蛍光を可視化するには、励起波長488ナノメートルを使用し、590~660ナノメートルの発光を収集します。
mTurquoise2蛍光の場合は、458ナノメートルの励起を使用し、順次スキャンを使用して460〜615ナノメートルの間の放出を収集します。まず、目的のセクションの反対側に指でステムを固定します。カミソリの刃を使用して、約3センチメートルのセグメントをカットし、いくつかの細かいカットを実行します。
水道水を含むペトリ皿にカミソリの刃をすすいで、茎のセクションを収集します。セクションを汚すか、顕微鏡スライドに直接取り付けます。染色のために、反応管にヨウ化プロピジウムの1ミリリットル溶液あたり250マイクログラムの1ミリリットルを調製する。
ペトリ皿から水道水をピペットで取り出し、ヨウ化プロピジウム溶液と5分間汚れに置き換えます。次にヨウ化プロピジウム溶液を取り出し、水ですすいでください。細かい鉗子か細かい絵筆を使用して、顕微鏡のスライドに染色された切片を移す。
25x浸漬レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して、サンプルを画像化します。561ナノメートルのレーザー光を使用して、ヨウ化プロピジウム蛍光を励起し、570〜620ナノメートルの発光を収集します。405ナノメートルのレーザー光を使用して、ドライバーライン構築物でコードされたmTurquoise2フルオロフォアエフェクターを励起し、425〜475ナノメートルの放出を収集します。
まず、鉗子を使用して、シュートチップの2センチメートル下の茎を切断します。片手で茎を保持し、花の芽と大きなプリモディアを除去するために細かい鉗子を使用しています。若いプリモリアを取り除くために、3%のアガロースを含むペトリ皿の直立した位置にSAMを固定します。
次に、双眼鏡と鉗子を使用して、SAMに近い若いプリモディアを取り除く。解剖したSAMをヨウ化プロピジウムの1ミリリットル溶液あたり250マイクログラムを含むチューブに移す。染色手順中にサンプルが完全に水没していることを確認しながら、サンプルを5〜10分間染色します。
染色したSAMを3%のアガロース培地を含む小さなペトリ皿に入れます。SAMを二重蒸留水で覆います。25x浸漬レンズを搭載した共焦点レーザー顕微鏡を使用して、解剖されたSAMを画像化します。
561ナノメートルのレーザー光を使用して、ヨウ化プロピジウム蛍光を励起し、570〜620ナノメートルの排出量を収集します。405ナノメートルのレーザー光を使用して、mTurquoise2フルオロフォアを励起し、425〜475ナノメートルの発光を収集します。Z方向に50マイクロメートルに及ぶ画像スタックを、0.5マイクロメートルのステップサイズで記録します。
DEXによる誘導は、細胞型特異的mTurquoise2発現を、葉膜前駆体およびカンビウムの根内皮および、そして、シュートの中の幹細胞に由来する。トランスアクチベートの試験事例として、V16活性化ドメインに融合した第二細胞壁マスター転写因子VND7をコードするエフェクターラインが生成される。DEXまたはDMSOの15マイクロリットルで5日間の単一処理の後、ステム切片は開始シースにおける異所性批准の視覚化のために調製される。
誘導サンプル中の開始シース細胞は、ヨウ化プロピジウムチャネルに対する強いシグナルを示し、いくつかの細胞は、キシレム細胞における細胞壁の典型的な網状肥厚を示す。このビデオを見た後、あなたは異なる組織で遺伝子発現を誘導する方法とイメージングのためにあなたのサンプルを準備する方法を明確に理解する必要があります。この手順に従って、確立されたドライバラインは、研究の関心に応じて他のユーザーによって生成された多種多様なエフェクター構造で使用することができます。
このショートカットは、植物研究者が細胞型特異的発現または関心遺伝子のノックダウンの効果を時間予約された方法で迅速に評価するのに役立つはずです。この細胞型特異的誘導系は、コルチコステロイドデキサメタゾンの使用を必要とする。直接接触は避けるべきなので、治療中は手袋とフェイスマスクを着用することが重要です。
