El objetivo clave en la biología del desarrollo es comprender el papel específico del contexto de un gen. Y esto puede ser difícil de lograr por mutantes nocaut convencionales o por líneas de sobreexpresión constitutivas. Utilizamos el sistema modular de clonación de puertas verdes para generar un recurso para la expresión citoespecífiada inducible en los tres meristemas principales de la planta modelo Arabidopsis thaliana.
Utilizando la misma estrategia de clonación modular, este método se puede aplicar a otras especies vegetales que son inmutables a la transformación. La demostración visual de este procedimiento es valiosa porque analizar el efecto de la trans-activación en los meristems del tallo y el ápice corto requiere disección antes de la toma de imágenes, lo que puede ser bastante difícil. Para empezar, esterilizar las semillas como se describe en el protocolo de texto.
A continuación, prepara el medio Murashige y Skoog de media fuerza a pH 5.8 y añade una sacarosa del uno por ciento y un 0,9%. Después del autoclave, añadir Dex disuelto en DMSO a las placas de inducción a una concentración final entre 10 y 30 micromolares. Agregue una cantidad igual de DMSO a las placas de control.
Ponga las semillas para imágenes de raíz en las placas y estratifique durante 48 horas en la oscuridad y a cuatro grados centígrados. Coloque las placas en posición vertical en una incubadora de plantas y córtelas durante cinco días. Cinco días después de la germinación, utilice la microscopía de escaneo láser confocal para tomar imágenes de las plántulas.
Para comenzar, preparar y cultivar las semillas como se describe en el protocolo de texto. De seis a siete días después de la germinación, transfiera cada plántula al suelo en una olla separada. Si induce las plantas por riego, utilice una solución de 25 micromolares DEX en agua, preparada a partir de un stock de 25 dex mililitrorios disuelto en etanol.
Agua cada dos o tres días hasta el momento deseado de inducción. Si se induce sumergiendo, prepare un vaso de precipitados de un litro con 750 mililitros de agua que contengan 0,02%Silwet L77 y DEX a 25 micromolares de concentración final o una cantidad equivalente de DMSO para el DEX y el tratamiento simulado. Sumerja una sola planta en la solución de inducción o simulacro durante 30 segundos.
Repita cada dos o tres días, hasta el momento deseado de la toma de imágenes. Para comenzar, preparar y cultivar las semillas como se describe en el protocolo de texto. De seis a siete días después de la germinación, transfiera cada plántula al suelo en una olla separada.
Cuando el tallo mida alrededor de un centímetro de largo, rocíe el SAM influorescente con entre 10 y 50 micromolares de solución DEX en agua. Para la inducción y la toma de imágenes en etapas posteriores del desarrollo, induzca a los SAM de tallos más largos o brotes laterales. 24 a 48 horas después de la inducción, disecciona los SAM y proceder a la toma de imágenes.
En primer lugar, transfiera las plántulas de la placa a una solución de 10 microgramos por mililitro de yoduro propidium y contraténlas durante cinco minutos. Coloque las raíces en una cámara de imágenes del microscopio e újelas con un microscopio de escaneo láser confocal con un objetivo de inmersión en agua de 63x. Para visualizar la fluorescencia de yoduro de propídico, utilice una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y recopile emisiones entre 590 y 660 nanómetros.
Para la fluorescencia mTurquoise2, utilice la excitación de 458 nanómetros y recopile la emisión entre 460 y 615 nanómetros mediante escaneo secuencial. Primero, fija un tallo con un dedo en el lado opuesto de la sección deseada. Con una cuchilla de afeitar, corte un segmento de aproximadamente tres centímetros y realice varios cortes finos.
Enjuague la cuchilla de afeitar en un plato de Petri que contenga agua del grifo y recoja las secciones del tallo. Puede manchar las secciones o montarlas directamente en las diapositivas del microscopio. Para la tinción, prepare un mililitro de una solución de 250 microgramos por mililitro de yoduro propidium en un tubo de reacción.
Retire el agua del grifo del plato Petri con una pipeta y reemplácela con la solución de yoduro propidium y manche durante cinco minutos. A continuación, retire la solución de yoduro propidium y enjuague con agua. Con fórceps finos o un pincel fino, transfiera las secciones teñidas a las diapositivas del microscopio.
Utilice un microscopio de escaneo láser confocal con una lente de inmersión de agua de inmersión de 25x para tomar imágenes de las muestras. Utilice una luz láser de 561 nanómetros para excitar la fluorescencia de yoduro propidium y recoger la emisión de 570 a 620 nanómetros. Utilice una luz láser de 405 nanómetros para excitar el efector de fluoróforo mTurquoise2 codificado por las construcciones de la línea del controlador y recoger las emisiones de 425 a 475 nanómetros.
Primero, usa fórceps para cortar el tallo dos centímetros por debajo de la punta del brote. Sostenga el tallo en una mano y use fórceps finos para eliminar los brotes de flores y la primordia grande. Para eliminar la primordia joven, fije el SAM en posición vertical en un plato de Petri que contenga un tres por ciento de agarosa.
A continuación, utilice un binocular y fórceps para eliminar cualquier primordia joven cerca del SAM. Transfiera el SAM diseccionado a un tubo que contenga una solución de 250 microgramos por mililitro de yoduro propidium. Deje que la muestra se manche durante cinco a 10 minutos mientras se asegura de que la muestra permanezca completamente sumergida durante el procedimiento de tinción.
Coloque el SAM manchado en un plato pequeño de Petri que contenga un medio de agarosa del tres por ciento. Cubra el SAM con agua destilada doble. Utilice un microscopio de escaneo láser confocal equipado con una lente de inmersión de agua de inmersión de 25x para crear imágenes de los SAM diseccionados.
Utilice una luz láser de 561 nanómetros para excitar la fluorescencia de yoduro propidium y recoger emisiones de 570 a 620 nanómetros. Utilice una luz láser de 405 nanómetros para excitar el fluoróforo mTurquoise2 y recoger la emisión de 425 a 475 nanómetros. Grabe pilas de imágenes que abarcan 50 micrómetros en la dirección Z con un tamaño de paso de 0,5 micrómetros.
La inducción con DEX conduce a la expresión mTurquoise2 específica de tipo celular en la raíz endodermis los precursores de phloem y cambium, y las células madre en el meristem apical de brote. Como caso de prueba para la transactivación, se genera una línea de efector que codifica el factor de transcripción maestra de muro de celda secundario VND7 fusionado con el dominio de activación V16. Después de cinco días de tratamiento único con 15 microlitros de DEX o DMSO, las secciones del tallo se preparan para la visualización de la lignificación ectópica en la vaina inicial.
Las células de vaina inicial en muestras inducidas muestran una señal fuerte para el canal de yoduro de propidio y algunas células muestran el típico engrosamiento reticulado de la pared celular en las células del xilem. Después de ver este video, usted debe tener una comprensión clara de cómo inducir la expresión génica en diferentes tejidos y cómo preparar sus muestras para la toma de imágenes. Siguiendo este procedimiento, las líneas de conductor establecidas se pueden utilizar con una amplia variedad de construcciones de efectores generadas por otros usuarios de acuerdo con sus intereses de investigación.
Este atajo debe ayudar a los investigadores de plantas a evaluar rápidamente el efecto de la expresión específica de tipo celular o la eliminación de un gen de interés de una manera reservada en el tiempo. Este sistema de inducción específico de tipo celular requiere el uso de la dexametasona corticosteroide. Se debe evitar el contacto directo, por lo que es importante usar guantes y una mascarilla facial durante el tratamiento.
