TRAPを使用すると、細胞分解能での発達処理を調査することができます。細胞型特異的プロモーターを使用してタグ付きリボソームサブユニットを駆動し、そこからポリソームRNAを分離することができます。このプロトコルは高品質のRNAを生成しますが、非常に限られた量で、したがって、高品質のRNAライブラリを確実に生成するために超低入力に特化した方法が必要です。
TRAPは、多くの発達プロセスが細胞壁関連および機械的シグナル伝達経路に依存しているため、植物研究に理想的なツールです。TRAPを用い、横根形成における細胞細胞通信を研究する。良質のRNAを得ることが予想ほど単純ではないことが判明したので、このステップバイステップのビデオ命令がTRAPの適用性を高め、この強力な技術を促進するのに役立つことを願っています。
伝播されたホモ接合ラインを殺菌するために、12で12センチメートルの平方ペトリ皿に種子の300マイクロリットル未満を均等に広げ、60リットルの乾燥剤に皿を積み重ねる。一晩のガス滅菌後、種子を50ミリリットルの貯蔵チューブに集める前にガスを蒸発させます。めっきする前に、殺菌した種子を0.1%寒天で希釈し、1皿当たりのインビベッドシードミックスを1ミリリットル得る。
シードミックスをプレートするには、正方形のペトリ皿の蓋を使用して、プレートごとに3列の種子を植えるラミネートテンプレートホルダーを作成し、空の寒天プレートをテンプレートホルダーに入れます。3列のプレートに1ミリリットルの種子を均等に分配します。そして、種子が乾燥するまで、層流の積み重ねに加工されたプレートを置きます。
種子が寒天の表面にくっついてきたら、蓋を閉め、マイクロポアテープで各プレートを密封します。関心のある薬剤を用いたシロイヌナズナの根の外因性治療のために、1.5〜2センチメートル幅、長さ10センチメートルのティッシュペーパーを調製する。10マイクロモルNAAにティッシュペーパーを浸し、ピンセットを使用して根の各列にティッシュペーパーを塗布します。
その後、気泡を軽く押し出し、余分な液体をプレートから空にしてから、プレートに時間でラベルを付けます。適切な実験エンドポイントで、鉗子を使用して根を取り外すことなく各プレートからティッシュペーパーストリップを慎重に取り除き、外科用ブレードを使用してシュートルート接合部に沿って1行につき1回、1回のストロークで切断します。ピンセットを使用して各行のルートに沿ってスワイプし、3つのバンドルでルートを収集します。
そして、スナップ凍結のために、液体窒素で満たされた50ミリリットルのチューブに根を空にします。処理ごとにすべての根試料が採取されたら、チューブ蓋を使用して余分な液体窒素をデカントし、根がこぼれるのを防ぎます。そして、80°Cの貯蔵のために、Doer容器にチューブを置きます。
組織研削および均質化の場合は、標準的なラボグローブの下に綿手袋を着用し、ポリソーム抽出バッファにPMSFを追加します。液体窒素を含むモルタルに組織サンプルを空にし、冷却された害虫を使用して、すべての材料が白い粉末として現れるまで慎重に組織を粉砕します。すべての組織が粉砕されたら、サンプルにポリソーム抽出バッファーの5ミリリットルを追加し、すぐにバッファーが凍結する前に粉末と凍結組織断片を混合します。
混合物が移すことができるとすぐに、氷の上のガラスホモジナイザーにスラリーを空にし、モルタルと害虫をすすぐポリソーム抽出バッファーの追加の2ミリリットルを使用します。抽出物が均質になるまでスラリーを手動で粉砕します。次に、粗根エキスを氷上の50ミリリットル遠心分離管に注ぎ、次のサンプルを実例通りに処理します。
RNAの総回収のために、各粗サンプルの200マイクロリットルのアリコートを、個々のクリーンで、事前に冷却された、標識されたマイクロ遠心分離管に移します。細胞壁、破片、大きなオルガネラを除去するには、サンプルを遠心分離し、上澄み物を新鮮で冷却済みの円錐形チューブにデカントして2番目の遠心分離を行います。チューブが回転している間、サンプルあたりの磁気GFPビーズのアリコート60マイクロリットルは、1.5ミリリットルのチューブに。
そして、上清除去を容易にするために、磁気スタンドにチューブを置きます。次いで、1回の洗浄液1ミリリットルでビーズを2回洗浄し、サンプル当たり60マイクロリットルの洗浄バッファーでビーズを再懸濁します。遠心分離の直後に、クリアした上清をラベル付き15ミリリットルチューブにデカントし、各サンプルに60マイクロリットルの洗浄ビーズを加える。
次に、すべてのサンプルを氷のバケツに水平に置き、揺れで2時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、氷上の磁気スタンドにビーズを集め、残りのポリソーム抽出バッファーにPMSFを加えます。上清を捨て、サンプルに約5ミリリットルのポリソーム抽出バッファーを加え、サンプル内のビーズを緩やかな傾きで再中断します。
サンプルを氷の上のシェーカーで15分間揺らし、続いて磁石に新鮮な洗浄バッファーを入れた2回の洗浄を行います。最後の洗浄後、1ミリリットルの洗浄バッファーでサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。そして、磁気スタンドにビーズをもう一度集めて、上清のすべてを取り除きます。
次に、すべてのサンプルが処理されるまでチューブを氷の上に置きます。ラボ用品の再調整については、まず、すべての機器を化学廃棄物にリンスします。乳鉢、害虫、ホモジナイザーを石鹸で手洗いしてから、各器具を十分に洗い流します。
次に、装置を熱安全容器に入れ、220°C以上で材料を一晩焼きます。リムとヒュームフード付きのオートクレーブトレイにチューブを置く前に、外気剤ですべての遠心管を洗剤できれいに磨きます。液体ジエチルパイロカーボネート1ミリリットルと脱イオン水溶液1リットルを3〜18時間チューブに注ぎます。
次に、オートクレーブ内のチューブのトレイを殺菌する前に溶液を集めます。ここでは、GFP信号を有する代表的な植物を示す。ヨウ化プロピジウムでの逆染色は、細胞壁の輪郭を示す。
線は、内皮の局在パターン、およびxylem極ペリサイクルに対応しています。ポリソームRNAから得られたこれらの代表的な測定では、ほとんどのサンプルは分解をほとんど示さなかったが、RNAの完全性の数は9から10までである。これらのグラフでは、正常に準備されたライブラリの痕跡を観察することができ、スケールダウンされた反応量にもかかわらず、手順の堅牢性を強調することができます。
ゲノムスパンデータセットが作成される前に、パイロット実験からTRAP RNAを定量的なRTPCRでプローブし、治療の成功および/または実験条件、ならびに組織特異性を検証することができます。この分析では、3つのオーキシン応答性遺伝子の試験は、治療の2時間後に成功したホルモン誘導を確認した。シーケンシングデータから取り出した組織特異的マーカー遺伝子プロファイルは、細胞型特異性を確認した。
RNAを扱うときは、良い練習のアドバイスに従ってください。滅菌ベンチで作業し、RNA除去溶液で機器を洗浄し、手袋を着用し、汚染されたらすぐに交換してください。手順中に使用されたすべての有毒化学物質およびガス、特にフェノール-DEPC塩素ガスおよび液体窒素を適切に処理し、廃棄してください。
オミック研究のポートフォリオでは、TRAPは重要なニッチを占めており、特に発生生物学において、多くの生物学的質問に答えるためにすでに使用されており、TRAPは大きな可能性を秘めています。
