L’objectif principal de la biologie du développement est de comprendre le rôle spécifique au contexte d’un gène. Et cela peut être difficile à réaliser par les mutants ko conventionnels ou par des lignes constitutives de surexpression. Nous avons utilisé le système modulaire de clonage de portes vertes pour générer une ressource pour l’expression cyto-spécifique inductible dans les trois ménismes principaux de la plante modèle Arabidopsis thaliana.
En utilisant la même stratégie modulaire de clonage, cette méthode peut être appliquée à d’autres espèces végétales immuables à la transformation. La démonstration visuelle de cette procédure est valable parce que l’analyse de l’effet de la trans-activation dans les ménistes de la tige et de l’apex court exige la dissection avant la formation image, qui peut être tout à fait provocante. Pour commencer, stérilisez les graines telles qu’décrites dans le protocole textuel.
Ensuite, préparez murashige et skoog mi-résistance à pH 5,8 et ajoutez un pour cent de saccharose et 0,9% d’agar. Après autoclaving, ajouter Dex dissous dans DMSO aux plaques d’induction à une concentration finale entre 10 et 30 micromolaires. Ajouter une quantité égale de DMSO aux plaques de commande.
Mettez les graines pour l’imagerie des racines dans des assiettes et stratifiez-les pendant 48 heures dans l’obscurité et à quatre degrés Celsius. Mettez les plaques en position verticale dans un incubateur de plantes et cultivez-les pendant cinq jours. Cinq jours après la germination, utilisez la microscopie confocale à balayage laser pour imager les semis.
Pour commencer, préparer et cultiver les graines telles que décrites dans le protocole texte. Six à sept jours après la germination, transférer chaque semis au sol dans une casserole séparée. Si vous induisez les plantes par arrosage, utilisez une solution DEX de 25 micromolaires dans l’eau, préparée à partir d’un stock de DEX de 25 millimolaires dissous dans de l’éthanol.
Arrosez tous les deux à trois jours jusqu’au moment désiré de l’induction. Si vous induisez en trempant, préparez un bécher d’un litre avec 750 millilitres d’eau contenant 0,02%Silwet L77 et DEX à 25 micromolaires de concentration finale ou une quantité équivalente de DMSO pour le DEX et le traitement simulé. Trempez une seule plante dans la solution d’induction ou de maquette pendant 30 secondes.
Répétez tous les deux à trois jours, jusqu’au moment désiré de l’imagerie. Pour commencer, préparer et cultiver les graines telles que décrites dans le protocole texte. Six à sept jours après la germination, transférer chaque semis au sol dans une casserole séparée.
Lorsque la tige fait environ un centimètre de long, vaporisez le SAM influorescent avec entre 10 et 50 micromolaires de solution DEX dans l’eau. Pour l’induction et l’imagerie à des stades ultérieurs de développement, induire des MS de tiges plus longues ou des pousses latérales. 24 à 48 heures après l’induction, disséquer les SAM et passer à l’imagerie.
Tout d’abord, transférer les semis de la plaque à une solution de 10 microgrammes par millileter de propidium iodure et les contre-détenir pendant cinq minutes. Placez les racines dans une chambre d’imagerie au microscope et imagez-les à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal avec un objectif d’immersion d’eau 63x. Pour visualiser la fluorescence de l’iodure propidium, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et recueillez les émissions entre 590 et 660 nanomètres.
Pour la fluorescence mTurquoise2, utilisez 458 nanomètres d’excitation et collectez les émissions entre 460 et 615 nanomètres à l’aide d’un balayage séquentiel. Tout d’abord, fixer une tige avec un doigt sur le côté opposé de la section désirée. À l’aide d’une lame de rasoir, couper un segment d’environ trois centimètres et effectuer plusieurs coupes fines.
Rincer la lame de rasoir dans une boîte de Pétri contenant de l’eau du robinet et recueillir les sections de tige. Soit tacher les sections ou les monter directement sur des diapositives de microscope. Pour la coloration, préparer un millilitre d’une solution millilitre de 250 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium dans un tube de réaction.
Retirer l’eau du robinet de la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette et la remplacer par la solution d’iodure de propidium et la tache pendant cinq minutes. Ensuite, retirez la solution d’iodure de propidium et rincez à l’eau. À l’aide de forceps fins ou d’un pinceau fin, transférez les sections tachées aux toboggans au microscope.
Utilisez un microscope à balayage laser confocal avec une lentille d’immersion d’eau plongeante 25x pour l’image des échantillons. Utilisez une lumière laser de 561 nanomètres pour exciter la fluorescence de l’iodure de propidium et recueillir des émissions de 570 à 620 nanomètres. Utilisez une lumière laser de 405 nanomètres pour exciter l’effecteur fluorophore mTurquoise2 codé par la ligne pilote construit et recueillir des émissions de 425 à 475 nanomètres.
Tout d’abord, utilisez des forceps pour couper la tige deux centimètres au-dessous de la pointe de la pousse. Tenez la tige dans une main et utilisez des forceps fins pour enlever les boutons floraux et les grandes primordies. Pour enlever la jeune primordie, fixez le SAM en position verticale dans une boîte de Pétri contenant trois pour cent d’agarose.
Ensuite, utilisez une jumelle et des forceps pour enlever toute jeune primordie à proximité du SAM. Transférer le SAM disséqué dans un tube contenant une solution de 250 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium. Laissez l’échantillon tacher pendant cinq à dix minutes tout en vous assurant que l’échantillon reste complètement immergé pendant la procédure de coloration.
Placez le SAM taché dans une petite boîte de Pétri contenant trois pour cent de milieu d’agarose. Couvrir le SAM d’eau distillée double. Utilisez un microscope à balayage laser confocal équipé d’une lentille d’immersion d’eau plongeante 25x pour imager les SAM disséqués.
Utilisez une lumière laser de 561 nanomètres pour exciter la fluorescence de l’iodure de propidium et recueillir des émissions de 570 à 620 nanomètres. Utilisez une lumière laser de 405 nanomètres pour exciter le fluorophore mTurquoise2 et recueillir des émissions de 425 à 475 nanomètres. Enregistrez des piles d’images couvrant 50 micromètres dans la direction Z avec une taille d’étape de 0,5 micromètre.
L’induction avec DEX conduit à l’expression spécifique de type cellulaire mTurquoise2 dans l’endodème de racine les précurseurs de phloème et le cambium, et les cellules souches dans le meristem apical de pousse. Comme cas d’essai pour la transactivation, une ligne effectrice codant le facteur de transcription principal de la paroi cellulaire secondaire VND7 fusionnée au domaine d’activation V16, est générée. Après cinq jours de traitement unique avec 15 microlitres de DEX ou DMSO, les sections de tige sont préparées pour la visualisation de la lignification ectopique dans la gaine de début.
Les cellules de gaine de démarrage dans les échantillons induits montrent un signal fort pour le canal iodure de propidium et certaines cellules montrent l’épaississement réticule typique de la paroi cellulaire dans les cellules xylèmes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la façon d’induire l’expression des gènes dans différents tissus et comment préparer vos échantillons pour l’imagerie. Suivant cette procédure, les lignes de conducteur établies peuvent être utilisées avec une grande variété de constructions effectrices générées par d’autres utilisateurs en fonction de leurs intérêts de recherche.
Ce raccourci devrait aider les chercheurs en plantes à évaluer rapidement l’effet de l’expression spécifique de type cellulaire ou du renversement d’un gène d’intérêt d’une manière réservée dans le temps. Ce système d’induction spécifique de type cellulaire nécessite l’utilisation de la dexaméthasone corticostéroïde. Le contact direct doit être évité, il est donc important de porter des gants et un masque pendant le traitement.
