Lhgra 介导的反激活在拟南芥诱导、细胞类型特异性表达中的表达

发育生物学的主要目标是了解基因的上下文特定作用。这可以通过传统的敲除突变体或构成过度表达线来实现。我们使用模块化的绿色门克隆系统，在模型植物阿拉伯藻扎利亚纳的三个主要元素中生成可致细胞特异性表达的资源。

使用相同的模块化克隆策略，此方法可以应用于其他无法转化的植物物种。这个程序的视觉演示是有价值的，因为分析在茎和短顶点中的转活的效果需要解剖之前成像，这可能是相当具有挑战性的。首先，对文本协议中概述的种子进行消毒。

接下来，在pH 5.8下准备半强度的Murashige和Skoog介质，并加入1%蔗糖和0.9%的加糖。高压灭式后，将2000溶于DMSO，最终浓度在10至30微摩尔之间。向控制板添加等量的 DMSO。

将根部成像的种子放在盘子上，在黑暗和摄氏4度下分层48小时。将板放在植物培养箱的垂直位置，并种植五天。发芽五天后，使用共声激光扫描显微镜对幼苗进行成像。

首先，准备和种植文本协议中概述的种子。发芽后六至七天，将每只幼苗转移到单独的盆栽土壤中。如果通过浇水诱导植物，在水中使用25微摩尔DEX溶液，由溶解在乙醇中的25毫摩尔DEX库存中准备。

每两到三天浇水一次，直到达到所需的感应时间。如果通过浸渍诱导，准备一升烧杯，含有 750 毫升水，含 0.02% Silwet L77 和 DEX，最终浓度为 25 微摩尔，或相当于 DEX 和模拟处理的 DMSO 量。将单个工厂浸入感应或模拟溶液中 30 秒。

每两到三天重复一次，直到所需的成像时间。首先，准备和种植文本协议中概述的种子。发芽后六至七天，将每只幼苗转移到单独的盆栽土壤中。

当茎大约一厘米长时，在水中喷洒10至50微摩尔DEX溶液的荧光SAM。对于后期发育阶段的感应和成像，诱导较长茎或侧芽的萨姆。上岗后 24 至 48 小时，解剖 SAM 并继续成像。

首先，将幼苗从盘子转移到每千克10微克的碘化丙烯溶液中，并对抗5分钟。将根部放入显微镜成像室中，并使用具有 63 倍水浸目标的共声激光扫描显微镜对根部进行成像。要可视化碘化荧光的丙光，请使用 488 纳米的激发波长，并收集 590 到 660 纳米之间的发射。

对于 mTurquoise2 荧光，使用 458 纳米的激发，并使用顺序扫描收集 460 到 615 纳米之间的排放。首先，将手指固定到所需部分的对面。使用剃须刀刀片，切割大约三厘米的段，并执行几个精细的切割。

在含有自来水的培养皿中冲洗剃须刀刀片，并收集茎部分。染色部分或直接安装到显微镜幻灯片上。对于染色，在反应管中准备每毫升250微克的碘化丙胺溶液中的一毫升。

用移液器从培养皿中去除自来水，用碘化溶液和污渍代替五分钟。然后，取出碘化溶液，并用水冲洗。使用精细钳子或精细画笔，将染色部分转移到显微镜幻灯片中。

使用共和激光扫描显微镜与 25 倍浸水浸入镜头成像样品。使用 561 纳米激光激发碘化荧光，并收集 570 到 620 纳米的辐射。使用 405 纳米激光激发由驱动线构造编码的 mTurquoise2 荧光效果器，并收集 425 到 475 纳米的发射。

首先，用钳子将茎切到拍摄尖端以下两厘米处。一只手握住茎，用细钳去除花蕾和大香。要去除年轻的原体，请将 SAM 固定在含有 3% 阿加罗斯的培养皿中。

接下来，使用双筒望远镜和钳子去除靠近 SAM 的任何年轻原体。将解剖的SAM转移到含有每毫升碘化二丙烯溶液250微克的管子中。让样品染色 5 到 10 分钟，同时确保样品在染色过程中保持完全浸渍。

将染色的 SAM 放入含有 3% 的阿加罗斯介质的小培养皿中。用双蒸馏水盖住 SAM。使用配备 25 倍浸水浸入镜头的共声激光扫描显微镜对解剖的 SAAm 进行成像。

使用 561 纳米激光激发碘化荧光，并收集 570 到 620 纳米的排放。使用 405 纳米激光激发 mTurquoise2 荧光团，并收集 425 到 475 纳米的发射。在 Z 方向上记录跨越 50 微米的图像堆栈，步长为 0.5 微米。

诱导与DEX导致细胞类型特定的mTurquoise2表达在根内皮的phloem前体和凸轮，以及干细胞在拍摄中脂肪。作为转活的测试用例，生成编码辅助细胞壁主转录因子VND7的效应器线，并融合到V16激活域。经过五天的单次治疗，15微升的DEX或DMSO，茎部分准备在开始护套的异位细胞化可视化。

诱导样本中的启动护套细胞显示碘化杆道的强烈信号，一些细胞显示木耳细胞中细胞壁的典型电镀增厚。看完这段视频后，您应该清楚地了解如何在不同组织中诱导基因表达，以及如何准备成像样本。按照此过程，已建立的驱动器线可以与其他用户根据其研究兴趣生成的各种效应器结构一起使用。

这种捷径应该有助于植物研究人员以保留的时间的方式快速评估细胞类型特异性表达或敲击感兴趣的基因的效果。这种细胞型特异性诱导系统需要使用皮质类固醇二甲苯甲酮。应避免直接接触，因此在治疗过程中佩戴手套和面罩非常重要。