الهدف الرئيسي في علم الأحياء التنموي هو فهم الدور المحدد للسياق للجين. وهذا يمكن أن يكون من الصعب تحقيق من قبل المسوخ خروج المغلوب التقليدية أو عن طريق خطوط overexpression التأسيسية. استخدمنا نظام استنساخ البوابة الخضراء وحدات لتوليد مورد للتعبير غير قابل للاختزالية cyto محددة في meristems الرئيسية الثلاثة من نموذج مصنع Arabidopsis thaliana.
وباستخدام نفس استراتيجية الاستنساخ المعيارية، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأنواع النباتية الأخرى التي لا يمكن تغييرها في التحول. المرئية مظاهرة من هذا الإجراء هو قيمة لأن تحليل تأثير عبر التنشيط في meristems من الجذعية و القمة قصيرة يتطلب تشريح قبل التصوير، والتي يمكن أن تكون صعبة للغاية. للبدء، تعقيم البذور كما هو موضح في بروتوكول النص.
المقبل, إعداد نصف قوة Murashige و Skoog المتوسطة في درجة اله PH 5.8 وإضافة واحد في المئة السكروز و 0.9٪ أجار. بعد الوتكلاف، أضف ديكس المذاب في DMSO إلى لوحات الحث بتركيز نهائي بين 10 و 30 ميكرومولار. أضف كمية مساوية من DMSO إلى لوحات التحكم.
وضع البذور لتصوير الجذر على لوحات وطبقتها لمدة 48 ساعة في الظلام وعند أربع درجات مئوية. وضع لوحات في وضع عمودي في حاضنة النباتات وتنمو لمدة خمسة أيام. بعد خمسة أيام من الإنبات، استخدم المجهر المسح الضوئي بالليزر confocal لتصوير الشتلات.
للبدء ، وإعداد وتنمو البذور على النحو المبين في بروتوكول النص. بعد ستة إلى سبعة أيام من الإنبات، نقل كل شتلة إلى التربة في وعاء منفصل. إذا كان الحث على النباتات عن طريق سقي، واستخدام 25 محلول DEX micromolar في الماء، أعدت من مخزون من 25 ميليمولار DEX حل في الإيثانول.
الماء كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى الوقت المطلوب من التعريفي. إذا كان الحث عن طريق غمس, إعداد كأس لتر واحد مع 750 ملليلتر من الماء التي تحتوي على 0.02٪ سيلويت L77 و DEX في 25 تركيز نهائي ميكروموللار أو كمية مكافئة من DMSO لDEX والمعالجة وهمية. تراجع مصنع واحد في الحل التعريفي أو وهمية لمدة 30 ثانية.
كرر كل يومين أو ثلاثة أيام، حتى الوقت المطلوب من التصوير. للبدء ، وإعداد وتنمو البذور على النحو المبين في بروتوكول النص. بعد ستة إلى سبعة أيام من الإنبات، نقل كل شتلة إلى التربة في وعاء منفصل.
عندما يكون طول الجذع حوالي سنتيمتر واحد ، رش سام المفلورة مع ما بين 10 و 50 ميكرومولار DEX الحل في الماء. للحصول على الحث والتصوير في مراحل لاحقة من التنمية، والحث على SAMs من سيقان أطول أو يطلق النار على الجانب. بعد 24 إلى 48 ساعة من الحث، تشريح SAMs والمضي قدما في التصوير.
أولاً، نقل الشتلات من اللوحة إلى محلول 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من يوديد البروديوم ومضادة لهم لمدة خمس دقائق. ضع الجذور في غرفة تصوير المجهر وصورها باستخدام مجهر مسح ليزري مشترك مع هدف غمر الماء 63x. لتصور الفلوريسيد البروديوم، استخدم الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر وجمع الانبعاثات بين 590 و 660 نانومتر.
بالنسبة لـ mTurquoise2 fluorescence، استخدم 458 نانومتر وتجمّع الانبعاثات بين 460 و615 نانومتر باستخدام المسح التسلسلي. أولاً، قم بإصلاح جذع بإصبع على الجانب الآخر من القسم المطلوب. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع قطعة من حوالي ثلاثة سنتيمترات وإجراء عدة تخفيضات غرامة.
شطف شفرة الحلاقة في طبق بيتري التي تحتوي على مياه الصنبور وجمع أقسام الجذعية. إما وصمة عار الأقسام أو تركيبها مباشرة على شرائح المجهر. للتلوين ، قم بإعداد ملليلتر واحد من محلول 250 ميكروغرام لكل ملليلتر من يوديد البرودينيوم في أنبوب رد فعل.
إزالة ماء الصنبور من طبق بيتري مع ماصة واستبدالها مع محلول يوديد بروبديسيوم وصمة عار لمدة خمس دقائق. ثم، إزالة محلول يوديد بروبديسيوم وشطف بالماء. باستخدام إما ملقط غرامة أو فرشاة الطلاء غرامة، ونقل المقاطع الملطخة إلى شرائح المجهر.
استخدم مجهر مسح ليزر مدمج مع عدسة غمر الماء 25x للتصوير صورًا للعينات. استخدم ضوء ليزر 561 نانومتر لإثارة الفلوريسيدات البروديويدية وجمع الانبعاثات من 570 إلى 620 نانومتر. استخدام ضوء الليزر نانومتر 405 لإثارة تأثير الفلوروبور 2 mTurquoise المشفرة من قبل خط سائق يبني وجمع الانبعاثات من 425 إلى 475 نانومتر.
أولاً، استخدم ملقط لقطع الساق سنتيمترين تحت طرف التصوير. عقد الجذعية في يد واحدة واستخدام ملقط غرامة لإزالة براعم زهرة وprimordia كبيرة. لإزالة البدائية الشباب، إصلاح SAM في وضع مستقيم في طبق بيتري تحتوي على ثلاثة في المئة agarose.
بعد ذلك، استخدم منظار وملباب لإزالة أي primordia الشباب قريبة من SAM. نقل سام تشريح إلى أنبوب يحتوي على 250 ميكروغرام في ملليلتر حل من يوديد بروبديسيوم. اترك العينة لمدة خمس إلى عشر دقائق مع التأكد من بقاء العينة مغمورة بالكامل أثناء إجراء التلطيخ.
ضع سام الملون في طبق بيتري صغير يحتوي على ثلاثة في المئة من الاغاروز المتوسطة. غطي سام بالماء المقطر المزدوج. استخدم مجهر مسح ليزر مدمج مجهز بعدسة غمر الماء 25x لغمسها لتصوير SAMs المتشَقَف.
استخدم ضوء ليزر 561 نانومتر لإثارة الفلوريسيدات البروديويدية وجمع الانبعاثات من 570 إلى 620 نانومتر. استخدم ضوء ليزر 405 نانومتر لإثارة الفلوروفهور mTurquoise2 وجمع الانبعاثات من 425 إلى 475 نانومتر. سجل مكدسات الصور التي تمتد 50 ميكرومتر في اتجاه Z مع حجم خطوة من 0.5 ميكرومتر.
تحريض مع DEX يؤدي إلى نوع الخلية تعبير mTurquoise2 محددة في endodermis الجذر السلائف الفلوم والكامبيوم، والخلايا الجذعية في تبادل لاطلاق النار meristem apical. كحالة اختبار للتنشيط، يتم إنشاء خط effector ترميز عامل النسخ الرئيسي جدار الخلية الثانوية VND7 تنصهر إلى المجال التنشيط V16. بعد خمسة أيام من العلاج الواحد مع إما 15 ميكرولترات من DEX أو DMSO ، يتم إعداد أقسام الجذعية للتصور من lignificationopic في بدن.
تظهر خلايا الغمد الأولى في العينات المستحثة إشارة قوية لقناة يوديد البروديوم وتظهر بعض الخلايا سماكة التشنج النمطية لرائط الخلية في خلايا xylem. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم واضح لكيفية الحث على التعبير الجيني في الأنسجة المختلفة وكيفية إعداد العينات الخاصة بك للتصوير. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام خطوط برنامج التشغيل المنشأة مع مجموعة متنوعة واسعة من الثوابت effector التي تم إنشاؤها من قبل المستخدمين الآخرين وفقا لمصالح البحوث الخاصة بهم.
وينبغي أن يساعد هذا الاختصار الباحثين النباتية لتقييم تأثير التعبير النوع الخلية محددة بسرعة أو ضربة قاضية من جينة ذات أهمية بطريقة الوقت المحجوزة. يتطلب هذا النوع من الخلايا نظام التعريفي محددة استخدام ديكساميثازون الكورتيكوستيرويد. يجب تجنب الاتصال المباشر ، لذلك من المهم ارتداء القفازات وقناع الوجه أثناء العلاج.
