O objetivo principal na biologia do desenvolvimento é entender o papel específico do contexto de um gene. E isso pode ser difícil de conseguir por mutantes convencionais ou por linhas de superexpressão constitutivas. Utilizamos o sistema modular de clonagem de portão verde para gerar um recurso para expressão indutível de cito nos três principais meristamos da planta modelo Arabidopsis thaliana.
Usando a mesma estratégia de clonagem modular, este método pode ser aplicado a outras espécies vegetais que são imutáveis à transformação. A demonstração visual deste procedimento é valiosa porque analisar o efeito da transativação nos meristems do caule e o ápice curto requer dissecção antes da imagem, o que pode ser bastante desafiador. Para começar, esterilize as sementes conforme descrito no protocolo de texto.
Em seguida, prepare mísrico Murashige e Skoog médio em pH 5.8 e adicione uma por cento de sacarose e 0,9% de ágar. Após a autoclavagem, adicione Dex dissolvido em DMSO às placas de indução em uma concentração final entre 10 e 30 micromolar. Adicione uma quantidade igual de DMSO às placas de controle.
Coloque as sementes para imagens de raízes em placas e estratifique-as por 48 horas na escuridão e a quatro graus Celsius. Coloque as placas em posição vertical em uma incubadora de plantas e plante-as por cinco dias. Cinco dias após a germinação, use microscopia de varredura a laser confocal para imagem das mudas.
Para começar, prepare e plante as sementes conforme descrito no protocolo de texto. Seis a sete dias após a germinação, transfira cada muda para o solo em um pote separado. Se induzir as usinas por rega, utilize uma solução DEX de 25 micromolar em água, preparada a partir de um estoque de 25 milmolarES DEX dissolvido em etanol.
Água a cada dois ou três dias até o tempo desejado de indução. Se induzir mergulhando, prepare um béquer de um litro com 750 mililitros de água contendo 0,02% Silwet L77 e DEX a 25 de concentração final de micromolar ou uma quantidade equivalente de DMSO para o DEX e tratamento simulado. Mergulhe uma única planta na solução de indução ou simulação por 30 segundos.
Repita a cada dois ou três dias, até o tempo desejado de imagem. Para começar, prepare e plante as sementes conforme descrito no protocolo de texto. Seis a sete dias após a germinação, transfira cada muda para o solo em um pote separado.
Quando a haste tiver cerca de um centímetro de comprimento, pulverize o SAM influorescente com entre 10 e 50 micromolares de solução DEX em água. Para indução e imagem em estágios posteriores de desenvolvimento, induza SAMs de hastes mais longas ou brotos laterais. 24 a 48 horas após a indução, disseque os SAMs e prossiga para a imagem.
Primeiro, transfira as mudas da placa para uma solução de 10 microgramas por milileter de iodeto de propídio e contraten-las por cinco minutos. Coloque as raízes em uma câmara de imagem de microscópio e imagem-as usando um microscópio de varredura a laser confocal com um objetivo de imersão de água de 63x. Para visualizar a fluorescência de iodida propidato, use um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros e colete emissão entre 590 e 660 nanômetros.
Para fluorescência mTurquoise2, use 458 nanômetros de excitação e colete emissões entre 460 e 615 nanômetros usando varredura sequencial. Primeiro, fixar uma haste com um dedo no lado oposto da seção desejada. Usando uma lâmina de barbear, corte um segmento de aproximadamente três centímetros e realize vários cortes finos.
Enxágüe a lâmina de barbear em uma placa de Petri contendo água da torneira e colete as seções de haste. Ou colore as seções ou monte-as diretamente em slides de microscópio. Para coloração, prepare um mililitro de uma solução de 250 microgramas por mililitro de iodeto de propídio em um tubo de reação.
Retire a água da torneira da placa de Petri com uma pipeta e substitua-a pela solução de iodeto de propídio e manche por cinco minutos. Em seguida, remova a solução de iodeto de propídio e enxágue com água. Usando fórceps finos ou um pincel fino, transfira as seções manchadas para slides de microscópio.
Use um microscópio de varredura a laser confocal com uma lente de imersão de água mergulhando 25x para a imagem das amostras. Use uma luz laser de 561 nanômetros para excitar a fluorescência de iodeto propidium e coletar emissões de 570 a 620 nanômetros. Use uma luz laser de 405 nanômetros para excitar o efeito fluorforeiro mTurquoise2 codificado pelas construções da linha do motorista e coletar emissões de 425 a 475 nanômetros.
Primeiro, use fórceps para cortar a haste dois centímetros abaixo da ponta de tiro. Segure a haste em uma mão e use fórceps finos para remover os botões de flores e primordia grande. Para remover a primordia jovem, fixe o SAM em uma posição vertical em uma placa de Petri contendo 3% de agarose.
Em seguida, use um binóculo e fórceps para remover qualquer primordia jovem perto do SAM. Transfira o SAM dissecado para um tubo contendo uma solução de 250 microgramas por mililitro de iodeto de propídio. Deixe a amostra manchar por cinco a 10 minutos, certificando-se de que a amostra permaneça totalmente submersa durante o procedimento de coloração.
Coloque o SAM manchado em uma pequena placa de Petri contendo 3% de meio de agarose. Cubra o SAM com água dupla destilada. Use um microscópio de varredura a laser confocal equipado com uma lente de imersão de água mergulhando 25x para imagem dos SAMs dissecados.
Use uma luz laser de 561 nanômetros para excitar a fluorescência de iodeto de propidium e coletar emissões de 570 a 620 nanômetros. Use uma luz laser de 405 nanômetros para excitar o fluoróforo mTurquoise2 e coletar emissões de 425 a 475 nanômetros. Registo pilhas de imagens que abrangem 50 micrômetros na direção Z com um tamanho de passo de 0,5 micrômetros.
A indução com DEX leva à expressão mTurquoise2 específica do tipo celular na endoderme raiz os precursores de phloem e cambium, e as células-tronco no meristem apical shoot. Como um caso de teste para transativação, uma linha de efeitos codificando o fator de transcrição mestre de parede de células secundárias VND7 fundido ao domínio de ativação V16, é gerada. Após cinco dias de tratamento único com 15 microlitadores de DEX ou DMSO, as seções de haste são preparadas para a visualização da lignificação ectópica na bainha inicial.
As células induzidas em amostras induzidas mostram um forte sinal para o canal de iodeto de propídio e algumas células mostram o típico espessamento reticulado da parede celular em células xilema. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão clara de como induzir a expressão genética em diferentes tecidos e como preparar suas amostras para imagens. Após este procedimento, as linhas de driver estabelecidas podem ser usadas com uma grande variedade de construções de efeitos gerados por outros usuários de acordo com seus interesses de pesquisa.
Este atalho deve ajudar os pesquisadores da planta a avaliar rapidamente o efeito da expressão específica do tipo celular ou a derrubada de um gene de interesse de uma maneira reservada de tempo. Este sistema de indução específico do tipo celular requer o uso da dexametasona corticosteroide. O contato direto deve ser evitado, por isso é importante usar luvas e uma máscara facial durante o tratamento.
