Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca G0400268 e MR / K018396 / 1 dal Medical Research Council, e da Action Medical Research. Ulteriore supporto è stato fornito dal National Institute for Health Research University College London Hospitals Centro di ricerca biomedica.

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati in questo studio erano conformi alla legislazione nazionale ed europea e sono stati approvati dal Comitato Etico della Scuola UCL di Farmacia e il Regno Unito Home Office (HO). Tutti i lavori animale è stata condotta nell&#39;ambito del progetto HO licenze PPL 80/2243 e PPL 70/7773. 1. Rat Preparazione <ol><li> Eseguire tutti gli esperimenti in vivo utilizzando Wistar ratti neonati esenti da organismi patogeni. </li><li> Conservare tutte le cucciolate di ratto (12 neonati per colonia) in gabbie individuali con le loro madri allattano il bambino (9 - 11 settimane di età femmine), in condizioni ottimali (19 - 21 ° C, 45 - 55% di umidità, 15 - 20 ricambi d&#39;aria / ora e 12 h ciclo luce / buio). </li></ol> 2. cellule batteriche Preparazione <ol><li> Negozio E. scorte coli K1 a 20% (v / v) di glicerolo a -80 ° C. Per ogni esperimento, piastra i batteri azionari su Mueller-Hinton (MH) agar piastre e incubare a 37 ° CO / N. </li><li> Il giorno prima di alimentazione, inocutardo 10 ml di brodo di MH con un singolo E. coli K1 colonia e la cultura O / N a 37 ° C, 200 rpm. Come controllo per mezzo di contaminazione, preparare 10 ml di brodo inoculato MH e incubare a 37 ° C a 200 rpm. </li><li> Trasferire 100 ml di O / N sospensione batterica in 9,9 ml di brodo MH (1: 100 v / v), e incubare a 37 ° C, 200 rpm, fino al raggiungimento metà esponenziale fase, corrispondente ad una densità ottica di 0,6 misurata ad una lunghezza d&#39;onda di 600 nm (OD 600). </li></ol> 3. L&#39;alimentazione di ratti neonati con E. coli K1 <ol><li> Tenere delicatamente l&#39;animale verticalmente in una mano dalla collottola, permettendo alla bocca di aprirsi. Lentamente inserire la punta della pipetta sterile nella bocca dell&#39;animale, e pipettare 20 ml di inoculo (~ 37 ° C) nella bocca dell&#39;animale per un periodo di tempo di 30 sec. Rispedire l&#39;animale verso la sua madre subito dopo la poppata. </li><li> Verificare che il 4 - 8 x 10 6 batteri sono stati alimentati to ogni cucciolo per diluizione seriale del inoculo in PBS e spotting su piastre di agar MH. </li></ol> 4. Valutazione della colonizzazione da E. coli K1 <ol><li> Premere delicatamente l&#39;animale in una mano dalla collottola. Inumidire un panno di cotone sterile in PBS sterile, e poi tamponare delicatamente la zona perianale. Rispedire l&#39;animale verso la sua madre subito dopo tampone. </li><li> Posizionare la punta del tampone in una provetta contenente 300 ml di PBS sterile e memorizzare sul ghiaccio. </li><li> Determinare il numero di batteri vitali da diluizioni seriali in PBS e placcatura su piastre di agar MacConkey. </li><li> Determinare valida E. coli K1 per test di sensibilità batteriofago. Scegli una colonia individuo che usa un ciclo microbiologico sterili, immerso in 200 ml PBS sterile, poi oggetto di vortex. </li><li> Utilizzando un sterili ciclo microbiologico, subcultura su MH agar in linea retta. Lasciare che il piatto ad asciugare per 30 secondi, e poi Pipettare 10 ml di bacteriophage K1E (10 9 unità formanti placca / ml (PFU / ml)) sul centro della linea. Incubare la piastra di O / N a 37 ° C. </li><li> Il giorno dopo, esaminare la piastra per lisi batteriofago-mediata. </li></ol> 5. Valutazione della gravità della malattia <ol><li> Valutare la gravità della malattia di ciascun animale 4 - 5 volte al giorno utilizzando il sistema di punteggio sette punti illustrato nella Tabella 1. </li><li> Se un animale punteggio ≥3 su 7, abbattere immediatamente l&#39;animale per ridurre al minimo le sofferenze. Registrare l&#39;animale morto. </li></ol> 6. euthanization di ratti neonati e prelievo di sangue <ol><li> Premere delicatamente l&#39;animale in una mano, esponendo la testa e il collo. Disinfettare il collo dell&#39;animale strofinando con un tampone imbevuto di alcool. Disinfettare un grosso paio di forbici con etanolo al 70%, prima del risciacquo in PBS sterile per rimuovere tracce di etanolo. </li><li> Premere delicatamente l&#39;animale direttamente sopra una piastra di Petri. Decapitare il neonato utilizzando Surgi forteforbici CAL, assicurando che il sangue gocciola nella piastra di Petri. Evitare il contatto con la testa per evitare la contaminazione del sangue con flora cutanea. </li><li> Subito raccogliere il sangue con una pipetta sterile e mescolare con eparina sale di sodio ad una concentrazione di 20 - 50 unità / ml in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga. </li><li> Determinare il numero di batteri vitali da diluizioni seriali in PBS e placcatura su piastre di agar MacConkey. Determinare il numero di vitali E. coli K1 testando la sensibilità dei batteri vitali per K1E batteriofago. </li></ol> 7. Dissection <ol><li> Dopo la decapitazione del ratto neonato, utilizzare condizioni asettiche di asportare e raccogliere i tessuti di interesse. Lavare tutti gli strumenti (mostrati nella Figura 1) in etanolo al 70% e PBS sterile. </li><li> Pulire la tavola di dissezione e bagnare completamente l&#39;addome con il 70% di etanolo. Posizionare il cadavere sulla schiena e fissare alla scheda dissezione (i) appuntare la zampa posteriore sinistratavolo operatorio con un ago sterile, (ii) allungamento cadavere e pinning zampa anteriore destra al tavolo operatorio, (iii) appunta la zampa posteriore destra e zampa anteriore sinistra al tavolo operatorio. </li><li> Tirare la pelle lungo il lato sinistro del basso addome con una pinza, poi tagliare lungo il lato sinistro del corpo dal basso addome allo sterno con piccole forbici dissezione. </li><li> Estendere l&#39;escissione attraverso lo sterno, e poi lungo il lato destro del corpo dallo sterno al basso addome con pinze e piccole forbici dissezione, garantendo che nessuna delle strutture sottostanti sono danneggiati. </li><li> Infine, tirare delicatamente verso il basso il lembo cutaneo dallo sterno al basso addome con iris pinze dissezione curve per esporre il peritoneo. </li><li> Sollevare delicatamente il peritoneo con una pinza e tagliare verticalmente per esporre gli organi interni, in modo che nessuno degli organi sottostanti sono danneggiati. </li></ol> 8. Raccoltail tratto GI <ol><li> Identificare lo stomaco, intestino tenue, intestino cieco, colon e del sistema linfatico mesenterico. </li><li> Rimuovere lo stomaco da sezionare con delicatezza su entrambi i lati, quindi inserire in un bijou contenente 1,6 ml di PBS sterile con pinza sterile. </li><li> Transetto il colon al retto. Estrarre con cautela l&#39;intera massa intestinale dal cadavere con pinze dissezione e posto in una piastra di Petri sterile. Assicurarsi che questo è fatto delicatamente in modo che la struttura intestinale e strutture linfatici mesenterici non si separano. </li></ol> 9. La separazione del tratto GI e il sistema linfatico mesenterica (Figura 2) <ol><li> Versare 30 ml di PBS sterile nella capsula di Petri, garantendo il tratto gastrointestinale è completamente sommerso. </li><li> Identificare la massa centrale del sistema linfatico mesenterico, e pizzicare con pinza sottile dissezione. Identificare la parte più prossimale del piccolo intestino, e pizzicare con pinza sottile dissezione. </li><li> Tirare lentamente la central massa del sistema linfatico mesenterico e piccolo intestino distale in direzioni opposte fino a due tessuti sono completamente separati gli uni dagli altri. Eseguire questa procedura con attenzione per garantire che l&#39;intestino tenue non sono allungate, come questo impedisce raccolta riproducibile prossimale, medio e regioni distali. Posizionare il sistema linfatico mesenterico in 300-500 ml PBS sterile e disporli sul ghiaccio. </li></ol> 10. Sezione del tratto GI <ol><li> Transect tratto gastrointestinale al cieco per separare tenue dal colon. </li><li> Posizionare i due punti in 300-500 ml PBS sterile e disporli sul ghiaccio. </li><li> Raccogliere tessuti rappresentativi regioni prossimali, medie e distali dell&#39;intestino tenue. Allineare l&#39;intestino tenue dal punto centrale. </li><li> Poi, (i) raccogliere gli ultimi 2 cm di tessuto prima cieco come il piccolo intestino distale, (ii) raccogliere il tessuto 5-7 cm sopra il punto medio come il piccolo intestino prossimale, e(Iii) raccoglie il tessuto dal 3 - 5 cm al di sotto del punto medio come il piccolo intestino medio. </li></ol> 11. Raccolta del Fegato <ol><li> Identificare le tre lobi del fegato di ratto dopo la rimozione dello stomaco. </li><li> Tirare lobi di distanza dalla cavità addominale con pinza sottile dissezione. </li><li> Rimuovere il fegato tagliando eventuali legamenti connessi con le forbici sottili. Mettere il fegato in 300-500 ml PBS sterile e posto sul ghiaccio. </li></ol> 12. Raccogliere la Milza <ol><li> Identificare la milza. </li><li> Tirare milza via dallo stomaco e usare le forbici sottili per tagliare il legamento gastrosplenico. </li><li> Mettere milza in 300-500 ml PBS sterile e posto sul ghiaccio. </li></ol> 13. Raccogliere i Reni <ol><li> Identificare i reni che diventeranno visibili nella parte posteriore della cavità addominale alla rimozione del tratto gastrointestinale e di altri organi. </li><li> Ureteri Cut ed eventuali legamenti connessi ucantare belle forbici dissezione e rimuovere reni con una pinza sottile. Rimuovere ghiandole surrenali e qualsiasi materiale grasso (se ancora attaccato) utilizzando una pinza sottile e forbici dissezione. </li><li> Posizionare entrambi i reni in 300-500 ml PBS sterile e disporli sul ghiaccio. </li></ol> 14. Raccogliere il cervello <ol><li> Dopo la decapitazione, tenere la testa in posizione verticale con pinze curve. Pizzicare la pelle sulla parte superiore della testa in senso longitudinale con un altro set di pinze curve, e fare un&#39;incisione con fini forbici dissezione. Tagliare restante pelle in prossimità del collo, ancora una volta in senso longitudinale con fini forbici dissezione. </li><li> Tirare la pelle in una direzione verso l&#39;esterno con una pinza sottile su entrambi i lati per rivelare il cranio e rimuovere lembi cutanei utilizzando sottili forbici dissezione. Bel posto forbici dissezione in apertura della colonna vertebrale e fare un&#39;incisione lungo il cranio verso la tribuna. </li><li> Tirare entrambe le sezioni del cranio in una direzione verso l&#39;esterno con una pinza sottile. Tagliare per rimuovere i segmenti del cranio. </li><li&gt; Rimuovi cervello con grandi pinze, con un movimento verso l&#39;alto scavare dall&#39;apertura del midollo verso la tribuna. Lavare il cervello in PBS due volte per rimuovere il sangue dalla procedura di decapitazione. </li></ol> 15. Lavorazione tessuti e omogeneizzazione <ol><li> Per gli esperimenti che richiedono i conteggi di fattibilità o l&#39;estrazione del DNA, tessuti posto in provette contenenti PBS sterile. Determinare immediatamente il numero di batteri vitali da diluizioni seriali in PBS e placcatura su piastre di agar MacConkey, o conservare a -20 ° C con il 20% di glicerolo per il breve termine. Per l&#39;estrazione del DNA, negozio di tessuti a -20 ° C. </li><li> Per gli esperimenti che richiedono l&#39;estrazione di RNA, posto in tessuti adeguati volumi di soluzione RNAlater (10 ml per 1 mg di tessuto), quindi memorizzare immediatamente a -20 ° C per breve termine o a -80 ° C conservazione a lungo termine. </li><li> Per gli esperimenti che richiedono l&#39;imaging, luogo tessuti in 10 ml di soluzione Methacarn (60% metanolo, 30% di cloroformio e il 10% di acido acetico), quindi memorizzare unt RT (20 - 25 ° C) per 3 settimane. </li><li> Calcolare il peso del tessuto confrontando peso di tubi prima e dopo l&#39;aggiunta dei tessuti. Omogeneizzare i tessuti utilizzando un omogeneizzatore. Lavare l&#39;omogeneizzatore una volta in etanolo al 70% e due volte in PBS sterile tra omogeneizzazione di ogni campione. NOTA: la fissazione Methacarn è auspicabile per il fissaggio dei campioni intestinali, al fine di preservare le strutture di difesa della mucosa mucina correlata; fissazione in formalina può essere utilizzato per tessuti sistemici. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il modello animale qui descritto si basa sul precedente lavoro che mira a riprodurre le caratteristiche salienti di naturali infezioni negli esseri umani. Ratti neonati sono stati inizialmente utilizzati per studiare la meningite infantile a causa di H. influenzae di tipo b come la specie soddisfaceva i criteri chiave per un modello affidabile di infezione. Così, il portale d&#39;ingresso del patogeno in questione dovrebbe riflettere sul fatto che l&#39;infezione umana naturale e riproducibile dar luogo a simile patologia di durata sufficiente per consentire un intervento terapeutico. Le tecniche utilizzate non devono limitare l&#39;applicabilità della procedura e non dovrebbero contribuire al decorso della malattia 20. Il modello di H. influenzae di meningite in ratti neonati sviluppati da Moxon e colleghi risponde a questi criteri 20; l&#39;infezione naturale si verifica dopo la colonizzazione delle membrane mucose del tratto respiratorio superiore e questa caratteristica importante è stato replicato nei ratti da non-traumainstillazione tic dei batteri sulle membrane dei passaggi nasali. È importante sottolineare che la natura età-dipendente del l&#39;infezione è stata replicata nel modello. Lo stesso gruppo sono stati anche i primi a sviluppare un modello di non-invasiva di E. coli K1 NBM nel ratto neonato 22. Esenti da organismi patogeni Sprague-Dawley cuccioli sono stati colonizzati da alimentazione 8 Ottobre - 10 Ottobre batteri attraverso un sondino gastrico per via orale; l&#39;inoculo era quindi notevolmente superiore a quello impiegato da noi. La colonizzazione con i tre ceppi K1 esaminati, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) e LH (O75: K1: H3), si è verificato in una percentuale relativamente elevata (48-74%) di animali K1-alimentato, ma l&#39;incidenza di batteriemia, meningite e la mortalità era variabile e significativamente più bassi rispetto ai tassi di colonizzazione. La natura clonale di E. infezione sperimentale coli K1 è stata stabilita entro 23 ed è ora evidente che solo O18: K1 e, in misura minore, O7: sierotipi K1 sono in gradodi provocare costantemente infezione sistemica. Per questo motivo, queste indagini di patogenesi di neuropatogeno E. coli K1 si basavano sull&#39;uso della O18 virulenza avanzata: K1 ceppo A192PP. Un confronto di E. coli K1 alimentazione di ratti neonati attraverso un tubo gastrico, come usato da Glode e colleghi 22, e un metodo di alimentazione goccia come impiegata dal gruppo di Achtman 23 ha rivelato un numero eccessivo di morti con il primo metodo, quasi certamente a causa di danni alle superfici mucose da parte del tubo gastrico. Poiché i tassi di colonizzazione sono paragonabili con questi due metodi, si consiglia di utilizzare il metodo meno invasivo di alimentare i batteri con una pipetta con una punta sterile, come descritto nella presente comunicazione. E. coli A192PP ceppo usato nei nostri studi è O18: K1. Si tratta di un derivato più virulento del ceppo clinico E. coli A192 che è stato originariamente recuperato da un paziente con la setticemia 27 </sup&gt;. La maggiore virulenza del ceppo è stata ottenuta mediante passaggio seriale in ratti neonati 26. Il ceppo suscita una gravità della malattia età-dipendente, con il 100% batteriemia e la mortalità quando somministrato a due giorni animali vecchi 28. Al contrario, a 9 giorni di età animali sono completamente resistenti alle malattie. Specifici K1 batteriofago litico può essere utilizzata per differenziare E. coli K1 da altri E. coli ceppi 29. In questo studio, sensibilità di batteri vitali per K1E batteriofago deve essere utilizzato (i) controllare la purezza del E. sospensioni coli K1 pronti ad essere somministrati agli animali, e (ii) per differenziare E. coli K1 dagli altri coliformi per calcolare la redditività in tamponi perianali, sangue e campioni di tessuto. Se la colonia è E. coli K1, sarà suscettibile di batteriofago K1E lisi, e la crescita batterica viene inibita nel sito di inoculazione batteriofago. Se la colonia non è E. coli K1, sarà bresistenti alla lisi KIE batteriofago e, e ci dovrebbe essere un&#39;area di crescita batterica nel sito di inoculazione batteriofago. Va tenuto presente che modelli animali non possono riflettere tutte le caratteristiche della malattia naturale. Il modello attuale può essere modificato per esaminare le caratteristiche di virulenza dei batteri neuropatogeno diversi da E. coli A192PP e variazioni nelle dimensioni dell&#39;inoculo colonizzare possono essere ospitati. Le future applicazioni della tecnica potrebbero includere la valutazione dei farmaci tanto necessari per trattare la condizione e per scoprire i dettagli della risposta dell&#39;ospite alla colonizzazione e l&#39;invasione dei tessuti. Il metodo qui descritto è semplice ma efficace. Cucciolate singole di 10 - 12 cuccioli sono stati impiegati come gruppi di prova o di controllo e questo approccio intra-lettiera garantisce un alto grado di riproducibilità e validità statistica. È indispensabile che i cuccioli vengono restituiti al loro madri naturali appena possibile dopo ogni immissioe cucciolate e non dovrebbero pertanto comprendere gli animali sottoposti a diversi interventi. È importante che l&#39;inoculo alimentato riscaldare altrimenti i cuccioli rifiuterà cultura offerta. I cuccioli sviluppano rapidamente una microflora complessa ed entro due giorni dalla nascita del tratto gastrointestinale è colonizzato con una vasta gamma di batteri dalla phyla stabilito come i microbi più abbondanti nel bambino e l&#39;adulto intestino. Cuccioli che non sono stati alimentati E. coli A192PP non svolge E. coli K1 nel tratto GI 17 e quindi la determinazione dei tassi di colonizzazione è relativamente semplice. Tuttavia, il Neus -based metodo qPCR per il rilevamento di colonizzare E. coli K1 è molto più sensibile che i metodi di coltura tradizionali ed è fortemente consigliato 17.

Infezioni batteriche sistemiche sono una grave minaccia per il benessere e la sopravvivenza del neonato; bambini prematuri sono particolarmente vulnerabili. Meningite batterica neonatale (NBM), spesso associata a sepsi batterica, continua ad essere una fonte significativa di mortalità e morbilità nel corso delle prime settimane di vita e il problema è aggravato dalla continua evoluzione della resistenza ai farmaci antibatterici in prima linea 1,2. Un caso di NBM è un&#39;emergenza medica che porta un medico, sociale ed economico di alta pressione 3; di conseguenza, vi è un urgente bisogno di nuove terapie e, in particolare, nuove strategie di profilassi per ridurre l&#39;onere di infezione. Alcune caratteristiche di NBM sono inusuali: nel mondo industrializzato, Escherichia coli e streptococchi di gruppo B sono responsabili della maggior parte dei casi e la capacità di questi ceppi di suscitare NBM è quasi sempre associata alla presenza di un polisaccaride protettiva capsule che permette al patogeno di eludere il riconoscimento immunitario elabora 4. Una percentuale molto elevata (80 - 85%) di neuroinvasive E. coli esprimere la capsula K1 5,6, un polimero di acido α-2,8 polysialic-collegato che è strutturalmente identico a ospitare modulatori di plasticità neuronale 7. La valutazione di nuove terapie e profilassi per NBM e batteriemia e sepsi associati trarrebbe beneficio chiaramente da un modello animale robusto di infezione che imita le caratteristiche principali della malattia nel neonato umano, in particolare il forte all&#39;età di dipendenza e il percorso naturale di infezione . Una vasta gamma di modelli per la meningite batterica Gram-positivi e Gram-negativi sono disponibili 8,9 e questi hanno notevolmente ampliato la nostra conoscenza della patogenesi, fisiopatologia e trattamento opzioni in queste infezioni. Così, infezioni sperimentali su ratti, topi, conigli e scimmie sono stati utilizzati per studiare la meningite sia nel neonate e l&#39;adulto. Tuttavia, molti di questi modelli impiegano iniezione diretta intracisternale o sottocutanea di batteri per apertura di infezione, creando una patogenesi artificiale bypassando processi naturali di diffusione dal sito di colonizzazione. In alcuni casi questi metodi di inoculazione portato a cambiamenti significativi nella patologia; per esempio, la somministrazione sottocutanea di E. ceppi coli K1 abrogati l&#39;età dipendenza associata con l&#39;infezione naturale, la produzione di batteriemia e l&#39;invasione del sistema nervoso centrale (SNC) in entrambi i neonati e gli adulti 10. Predisposizione per E. coli NBM è criticamente dipendente dalla trasmissione verticale l&#39;agente responsabile dell&#39;infezione dalla madre al neonato al momento o subito dopo la nascita 11. Materna di derivazione E. batteri coli K1 colonizzano il tratto gastrointestinale neonatale (GI) 11-13, che è sterile alla nascita, ma rapidamente acquista un microbiota complesso 14. Nei neonati colonizzati, E. coliK1 batteri hanno la capacità di traslocare dal lume intestinale nella circolazione sistemica prima di entrare nel SNC di tutti i ematoencefalica sangue o fluido cerebrospinale barriere 9,15. La progettazione di modelli robusti di infezione sperimentale dovrebbe prendere queste informazioni in considerazione. Anche se i topi sono stati ampiamente utilizzati per lo studio di alcune forme di meningite batterica 8, essi non sono adatti per gli studi di infezione neonatale: sono sopraffatti da infezione sistemica e non mostrano la forte caratteristica di dipendenza dei neonati umani 16. Inoltre, α-defensine, peptidi chiave del tratto gastrointestinale che fornisce una protezione contro l&#39;invasione sistemica da E. coli K1 17, sono altamente espresso nelle cellule Paneth e neutrofili negli esseri umani e ratti, ma non nei topi 18. Vi è un notevole grado di duplicazioni, la ridondanza e l&#39;eterogeneità nel topo defensine e relativi geni cryptidin non si trovano in altri unimals 19. Il ratto neonatale è stato inizialmente utilizzato da Moxon e collaboratori 20 per studiare la patogenesi della meningite da Haemophilus influenzae dopo l&#39;inoculazione intranasale, replicando il sito naturale di colonizzazione di questo patogeno neonatale nell&#39;essere umano, e successivamente adattato per età-dipendente E. coli K1 batteriemia e la meningite. Bortolussi et al. 21 iniezione intraperitoneale occupati della inoculo batterico per avviare l&#39;infezione, ma lo studio chiave di Glode e collaboratori 22 alimentazione gastrica orale per il parallelo la via naturale d&#39;infezione dopo la colonizzazione GI. Poiché il tubo gastrico può danneggiare le superfici mucose, la procedura è stata affinata per includere l&#39;alimentazione dell&#39;inoculo ai neonati 23. Qui, il metodo per la colonizzazione e le procedure per il monitoraggio dell&#39;infezione nei ratti neonati sono sensibili descritte tratto gastrointestinale; Inoltre, sono discusse applicazioni terapeutiche e preventive del modello.

<table><tbody><tr><td>Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)</td><td><a href="http://www.harlan.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Harlan, UK</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli K1 A192PP</td><td><a href="http://www.ucl.ac.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Taylor lab</a></td><td></td><td>Mushtaq &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2004</td></tr><tr><td>Bacteriophage K1E</td><td><a href="http://www.ucl.ac.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Taylor lab</a></td><td></td><td>Mushtaq &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2004</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton Agar</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Oxoid, UK</a></td><td>CM0037</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton Broth</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Oxoid, UK</a></td><td>CM0405</td><td></td></tr><tr><td>MacConkey Agar</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Oxoid, UK</a></td><td>CM0007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Salt</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>84020</td><td>Prepare 20 - 50 units/ml</td></tr><tr><td>RNAlater Solution</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>R0901</td><td>10 &amp;mu;l/mg tissue</td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped swabs</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>11542483</td><td></td></tr><tr><td>Alcotip Swabs</td><td><a href="http://www.scientificlabs.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Scientific Laboratory Supplies, UK</a></td><td>SWA1000</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>P5856</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Universal Tube</td><td><a href="http://www.alphalabs.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> AlphaLaboratories, UK</a></td><td>CW3890</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml microcentrifuge tubes</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>I1405-1500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &amp;mu;l calibrated loops</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>E1412-0112</td><td></td></tr><tr><td>L-shaped spreaders</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>E1412-1005</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>10594175</td><td></td></tr><tr><td>Forceps straight with fine points</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12780036</td><td></td></tr><tr><td>Forceps straight with blunt tips</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12391369</td><td></td></tr><tr><td>Forceps watchmaker&#039;s curved with very fine points</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12740926</td><td></td></tr><tr><td>Scissors straight with very fine points</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12972055</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Scissors</td><td><a href="http://www.vwr.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> VWR, UK</a></td><td>USBE4251</td><td></td></tr><tr><td>25 G Syringe Needles</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Greiner Bio-One Ltd</a></td><td>N2525</td><td></td></tr><tr><td>LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers</td><td><a href="http://www.perkinelmer.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> PerkinElmer, UK</a></td><td>L60000BB</td><td></td></tr><tr><td>Unitemp Incubator</td><td>B&amp;amp;T, UK</td><td>OP958</td><td></td></tr><tr><td>Multitron shaking incubator</td><td><a href="http://www.infors-ht.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> INFORS HT, UK</a></td><td>AJ118</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Turrax T-10 homogenizer</td><td><a href="http://www.ika.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> IKA Werke</a></td><td>0003737000</td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat

Studio delle interazioni tra ospite e batterio patogeno animale ha senso solo se il modello di infezione utilizzato replica le caratteristiche principali di infezione naturale. Questo protocollo descrive le procedure per la creazione e la valutazione di infezioni sistemiche a causa di neuropatogeno K1 Escherichia coli nel ratto neonato. La colonizzazione del tratto gastrointestinale porta alla diffusione del patogeno lungo il corso budello linfatico-ematoencefalica dell&#39;infezione e il modello mostra forte dipendenza dell&#39;età. Un ceppo di E. coli O18: K1 con una maggiore virulenza del ratto neonato produce eccezionalmente elevati tassi di colonizzazione, traslocazione al vano di sangue e l&#39;invasione delle meningi seguendo il transito attraverso il plesso coroideo. Come nell&#39;ospite umano, la penetrazione del sistema nervoso centrale è accompagnata da infiammazione locale e un risultato invariabilmente letale. Il modello è di provata utilità per gli studi del meccanismodi patogenesi, per la valutazione degli interventi terapeutici e per valutare la virulenza batterica.

Il E. coli K1 modello di infezione sistemica qui descritto replica molte delle caratteristiche della infezione naturale nell&#39;uomo. I batteri sono ingeriti, colonizzare il tratto gastrointestinale, traslocare nel compartimento sanguigno attraverso i linfonodi mesenterici prima di stabilire la malattia organo-specifica, con infiammazione associata del cervello 24. È importante sottolineare che il modello mostra una forte dipendenza degli anziani; come mostrato in Figura 3, due giorni di età (P2) ratti sono altamente suscettibili alla malattia invasiva ma per un periodo di sette giorni gli animali diventano progressivamente più refrattari alle infezioni, ma non Gi colonizzazione del tratto 17. Dopo transito dal sito di colonizzazione GI al comparto sangue, i batteri possono essere visualizzati in campioni di sangue mediante microscopia a fluorescenza (Figura 4) prima di entrare nel SNC prevalentemente nel plesso coroide 25. In alcuni animali, vi è ampia invasione di altri organi importanti comepolmone, milza e reni 25. Numeri batterica in tessuti possono variare notevolmente tra i singoli cuccioli 25, ma quando la carica batterica è segnato come presente o assente vi è un alto grado di riproducibilità in materia di invasione di organi. Con una cucciolata di 12 cuccioli come una singola coorte di prova, calcoli di potenza utilizzando G * software Alimentazione determinato che questa dimensione del campione equivale a una probabilità del 98,6% di trovare un effetto basato sulla sopravvivenza con sei animali della coorte e&gt; probabilità del 99% se tutti dodici sono presi in considerazione. Il modello è quindi adatto alla valutazione di nuovi agenti appositamente per il trattamento di infezioni batteriche neonatali ed è stato utilizzato nella procedura per valutare il potenziale terapeutico della capsula depolymerase EndoE che rimuove selettivamente la capsula K1 dalla superficie batterica 24-26. Può anche essere usato per studiare interazioni ospite-batteri che impatto sul pathogenesis di E. coli neuropathogens; in questo contesto è stato impiegato per studi di E. colonizzazione coli A192PP e la diffusione. È stato dimostrato che E. cellule coli A192PP persistono nel tratto gastrointestinale di P2, P5 e P9 cuccioli in gran numero; aspetti temporali della colonizzazione in questi tre gruppi erano molto simili (Figura 5) e riflette la capacità dei batteri di replicare e mantenere la densità di popolazione all&#39;interno dell&#39;intestino. La virulenza del A192 isolato clinico è stata potenziata mediante passaggio seriale in ratti neonati per garantire poca o nessuna ridondanza di uso animale. E. coli A192 colonizzato P2 ratti neonati con il 100% di efficienza, ha suscitato batteriemia nel 35% degli animali e ha prodotto un effetto letale nel 25% 27. Il A192PP derivata diversi passaggi colonizza il tratto gastro-intestinale, produce batteriemia e causa letalità in tutti i cuccioli P2. Pertanto, il modello può essere impiegato per studiare la virulenza different K1 ceppi rispetto alla loro capacità di invadere il SNC e altri organi dal sito di colonizzazione. In questo contesto, Pluschke e collaboratori 23 hanno utilizzato un modello di infezione ratto neonato per determinare la capacità di 95 E. coli K1 ceppi di origine umana per provocare batteriemia dopo la colonizzazione dell&#39;intestino; hanno osservato notevoli differenze in termini di efficienza sia di colonizzazione e la capacità invasiva, alla base della natura clonale di E. coli K1 neuropathogens. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Materiali per la raccolta dei tessuti: (A) bilancia, (b) i tubi pre-pesato contenenti supporti necessari, (C) Funzionamento tavolo, righello e aghi da definire l&#39;animale, (D) il 70% (v / v) etanolo e PBS per sterilizzare le attrezzature di raccolta dei tessuti, <sTrong&gt; (E) kit di raccolta del tessuto compreso un grosso paio di forbici per decapitazione e forbici e pinzette e lame di varie dimensioni e forme, (F) ghiaccio per preservare i tessuti, (G) 70% (v / v) di etanolo per la sterilizzazione il tavolo operatorio e circonda. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Separazione del tratto gastrointestinale e il sistema linfatico mesenterico. (A) Afferrare la massa centrale del sistema linfatico mesenterico con pinza sottile dissezione. (B) Afferrare la parte prossimale del piccolo intestino, e tirare in direzioni opposte. (C) Il tratto gastrointestinale e del sistema linfatico mesenterico sarà completamente separate. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. La sopravvivenza dei cuccioli di ratto neonatale di età compresa tra due giorni (P2) a nove giorni (P9) a seguito della somministrazione orale di E. coli A192PP, che illustra la forte dipendenza degli anziani di infezione sistemica. Ogni gruppo rappresenta 24 neonati. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. immagini di fluorescenza di E. cellule coli A192PP in uno striscio di sangue da un cucciolo P2 infetta dopo somministrazione orale di batteri. L&#39;antigene lipopolisaccaride O sulla superficie batterica era stained con coniglio anti-O18 anticorpo policlonale e secondo anticorpo Alexa546 coniugato capra anti-coniglio. La capsula K1 è stato visualizzato con il reagente EndoE-GFP. Praticamente tutti i batteri rilevati nei campioni di sangue visualizzata la K1 capsula protettiva. Le immagini sono state catturate dal dottor Andrea Zelmer. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. E. coli A192PP colonizzazione intestinale dopo somministrazione dell&#39;inoculo batterico. Il DNA è stato estratto da tutta dell&#39;intestino ed E. coli K1 unità formanti colonia / g (CFU / g) dei tessuti determinato per reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) mira il gene polysialyltransferasi (Neus) come descritto altrove 17 </sup&gt;. LOD: limite di rilevazione. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Caratteristica </td><td> Sano </td><td> Malsano </td></tr><tr><td> Colore della pelle </td><td> Rosa </td><td> Pallido / giallo </td></tr><tr><td> Agility (riflesso di raddrizzamento) </td><td> Pup inverte immediatamente sul collocamento indietro </td><td> Difficoltà a invertire il posizionamento all&#39;indietro (&gt; 3 sec) o non possono raggiungere </td></tr><tr><td> Leggera pressione sull&#39;addome </td><td> Nessun suono </td><td> Suono di agitazione </td></tr><tr><td> Stomaco / Linea latte </td><td> Visibile e nero </td><td> Non visibile </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> Caldo </td><td> Relativamente freddo * </td></tr><tr><td> Peso </td><td> Guadagno di 1,5-2 g al giorno </td><td> Nessun aumento di peso o perdita di peso </td></tr><tr><td> Comportamento quando messo in gabbia </td><td> Si muove verso la madre e inizia flimentazione </td><td> Non può muoversi verso la madre e mostra la difficoltà di alimentazione </td></tr></tbody></table> Tabella 1. sette punti sistema di punteggio: I primi tre punteggi riportati sono di solito i primi segnali osservati. * I neonati con infezione sistemica esperienza temperatura corporea elevata (&gt; 2 ° C). Tuttavia, a causa della mancanza di agilità degli animali per raggiungere la loro madre per mantenere la temperatura corporea, animali insalubri possono separarsi da lettiera e sentire freddo alla mano nuda.

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Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Qui, una procedura è descritta per la creazione di infezione sistemica nel ratto neonatale con colture di Escherichia coli K1. Questa procedura non invasiva consente colonizzazione del tratto gastrointestinale, traslocazione del patogeno alla circolazione sistemica, e l&#39;invasione del sistema nervoso centrale al plesso coroide.

Non invasiva Modello di neuropatogeno<em&gt; Escherichia coli</em&gt; L&#39;infezione neonatale nel ratto

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

non-invasive-model-neuropathogenic-escherichia-coli-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

10.9K Views.  University College London.  Qui, una procedura è descritta per la creazione di infezione sistemica nel ratto neonatale con colture di Escherichia coli K1. Questa procedura non invasiva consente colonizzazione del tratto gastrointestinale, traslocazione del patogeno alla circolazione sistemica, e l'invasione del sistema nervoso centrale al plesso coroide. 

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Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Modellazione Encefalopatia di prematurità Utilizzando prenatale ipossia-ischemia con Lipopolisaccaride intra-amniotico in ratti

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

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Medicina

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un neonatale mouse Spinal Cord Injury compressione Modello

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Iniezione intrarenale di<emEscherichia coli</em&gt; In un modello di ratto di pielonefriti

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Un modello di Mouse controllata per sepsi polimicrobica neonatale

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Immunologia e infezioni

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a protocol for studying the pathogenesis of E. coli O1:K1:H7, a serotype responsible for high mortality rates in neonates. Our method utilizes intravital imaging of neonatal pups at different time points during the progression of infection. This imaging, paralleled by measurement of bacteria in the blood, inflammatory profiling, and tissue histopathology, signifies a rigorous approach to understanding infection dynamics during sepsis. In the current report, we model two infectious inoculums for comparison of bacterial burdens and severity of disease. We find that subscapular infection leads to disseminated infection by 10 h post-infection. By 24 h, infection of luminescent E. coli was abundant in the blood, lungs, and other peripheral tissues. Expression of inflammatory cytokines in the lungs is significant at 24 h, and this is followed by cellular infiltration and evidence of tissue damage that increases with infectious dose. Intravital imaging does have some limitations. This includes a luminescent signal threshold and some complications that can arise with neonates during anesthesia. Despite some limitations, we find that our infection model offers an insight for understanding longitudinal infection dynamics during neonatal murine sepsis, that has not been thoroughly examined to date. We expect this model can also be adapted to study other critical bacterial infections during early life.

Infection of neonatal mice with bioluminescent E. coli O1:K1:H7 results in a septic infection with significant pulmonary inflammation and lung pathology. Here, we describe procedures to model and further study neonatal sepsis using longitudinal intravital imaging in parallel with enumeration of systemic bacterial burdens, inflammatory profiling, and lung histopathology.

Un modello di imaging neonatale di sepsi batterica gram-negativa

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Assessment of Intestinal Transcytosis of Neonatal Escherichia coli Bacteremia Isolates

Newborns ingest maternal E. coli strains that colonize their intestinal tract around the time of delivery. E. coli strains with the ability to translocate across the gut invade the newborn's bloodstream, causing life-threatening bacteremia. The methodology presented here utilizes polarized intestinal epithelial cells grown on semipermeable inserts to assess the transcytosis of neonatal E. coli bacteremia isolates in vitro. This method uses the established T84 intestinal cell line that has the ability to grow to confluence and form tight junctions and desmosomes. After reaching confluence, mature T84 monolayers develop transepithelial resistance (TEER), which can be quantified using a voltmeter. The TEER values are inversely correlated with the paracellular permeability of extracellular components, including bacteria, across the intestinal monolayer. The transcellular passage of bacteria (transcytosis), on the other hand, does not necessarily alter the TEER measurements. In this model, bacterial passage across the intestinal monolayer is quantified for up to 6 h post-infection, and repeated measurements of TEER are made to monitor the paracellular permeability. In addition, this method facilitates the use of techniques such as immunostaining to study the structural changes in tight junctions and other cell-to-cell adhesion proteins during bacterial transcytosis across the polarized epithelium. The use of this model contributes to the characterization of the mechanisms by which neonatal E. coli transcytose across the intestinal epithelium to produce bacteremia.

Assessment of Intestinal Transcytosis of Neonatal Escherichia coli Bacteremia Isolates

Escherichia coli&#160;causes sepsis in neonates who ingest the bacteria around the time of birth. The process involved in&#160;E. coli&#8217;s&#160;ability to travel from the enteric tract to the bloodstream is poorly understood. This&#160;in vitro&#160;model assesses the ability of&#160;E. coli&#160;strains to travel through the intestinal epithelial cells.

Valutazione della transcitosi intestinale degli isolati neonatali di batteriemia di Escherichia coli

Newborns ingest maternal E. coli strains that colonize their intestinal tract around the time of delivery. E. coli strains with the ability to translocate ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Un modello murino BALB/c neonatale di enterocolite necrotizzante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...

Early Pathological and Magnetic Resonance Detection of Cerebral Injury Using a Rat Model of Neonatal Hypoxic Ischemic Encephalopathy

Perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is an acute disease that may afflict newborns, resulting in variable long- and short-term neurodevelopmental outcomes. Early diagnosis is critical to identifying infants who may benefit from intervention; however, early diagnosis relies heavily on clinical criteria. No molecular or radiological tests have shown promise in detecting early cerebral injury. Studies have shown that magnetic resonance imaging (MRI) can show changes in both blood flow/ischemia and metabolic disruption. However, they have all been used to evaluate the secondary phase of the disease (&gt;12 h) after the onset of the injury. Early diagnosis is critical to rapidly starting therapeutic hypothermia in eligible infants, which is currently recommended to be initiated within 6 h of birth. The rat model of hypoxic-ischemic injury was developed in 1981 and has been validated and used extensively to study changes in brain perfusion, cerebral injury markers, and morphology. However, it has primarily been used as a "late model", evaluating injury several days after the initial ischemic insult. The model has been known to have poor sensitivity in evaluating reliable and reproducible early cerebral changes. The objective of this study was to develop a reliable model to study early gross morphological and radiological markers of HIE using pathological staining and cerebral magnetic resonance imaging/magnetic resonance spectroscopy.

The present protocol describes a rodent model of newborn hypoxic-ischemic injury for identifying early changes in cerebral tissue by gross morphology and magnetic resonance imaging. This has benefits over existing models, which can be used to study late injury but do not allow the evaluation of reproducible early changes.

Perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is an acute disease that may afflict newborns, resulting in variable long- and short-term ...

Un modello di enterocolite necrotizzante per studi meccanicistici e scoperta di farmaci

Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe and potentially fatal intestinal disease that has been difficult to study due to its complex pathogenesis, which remains incompletely understood. The pathophysiology of NEC includes disruption of intestinal tight junctions, increased gut barrier permeability, epithelial cell death, microbial dysbiosis, and dysregulated inflammation. Traditional tools to study NEC include animal models, cell lines, and human or mouse intestinal organoids. While studies using those model systems have improved the field&#39;s understanding of disease pathophysiology, their ability to recapitulate the complexity of human NEC is limited. An improved in vitro model of NEC using microfluidic technology, named NEC-on-a-chip, has now been developed. The NEC-on-a-chip model consists of a microfluidic device seeded with intestinal enteroids derived from a preterm neonate, co-cultured with human endothelial cells and the microbiome from an infant with severe NEC. This model is a valuable tool for mechanistic studies into the pathophysiology of NEC and a new resource for drug discovery testing for neonatal intestinal diseases. In this manuscript, a detailed description of the NEC-on-a-chip model will be provided.

Autore in primo piano: Migliorare la comprensione e le strategie di trattamento con il modello NEC-on-a-Chip 

This protocol describes an in vitro model of necrotizing enterocolitis (NEC), which can be used for mechanistic studies into disease pathogenesis. It features a microfluidic chip seeded with intestinal enteroids derived from the human neonatal intestine, endothelial cells, and the intestinal microbiome of a neonate with severe NEC.

Modello microfluidico di enterocolite necrotizzante che incorpora enteroidi intestinali neonatali umani e un microbioma disbiotico

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe and potentially fatal intestinal disease that has been difficult to study due to its complex pathogenesis, ...

Non invasiva Modello di neuropatogeno

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