Name: non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat
Uploaded: 2014-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
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Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien G0400268 und MR / K018396 / 1 von der Medical Research Council unterstützt und durch Aktions Medizinische Forschung. Weitere Unterstützung wurde von der National Institute for Health Research University College London Hospitals Biomedizinische Forschungszentrum zur Verfügung gestellt.

Alle Tierversuche in dieser Studie durchgeführt entsprach nationalen und europäischen Gesetzgebung und wurden von der Ethikkommission der UCL School of Pharmacy und dem britischen Home Office (HO) genehmigt. Alle Tier Arbeit wurde unter HO-Projekt durchgeführt Lizenzen PPL 80/2243 und PPL 70/7773. 1. Ratte Vorbereitung <ol><li> Führen Sie alle in vivo Experimente mit keimfreien Wistar neugeborenen Ratten. </li><li> Bewahren Sie alle Ratten Würfe (12 Neugeborenen pro Volk) in Einzelkäfigen mit ihren stillende Mütter (9-11 Wochen alte Weibchen), unter optimalen Bedingungen (19-21 ° C, 45 - 55% Luftfeuchtigkeit, 15 bis 20 Luftwechsel / h und 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus). </li></ol> 2. Bakterienzellpräparation <ol><li> Shop E. coli K1 Bestände in 20% (v / v) Glycerin bei -80 ° C. Für jedes Experiment Platte heraus stock Bakterien auf Mueller-Hinton (MH) Agarplatten, und bei 37 ° CO / N. </li><li> Am Tag vor Fütterung, inocuspäten 10 ml MH-Brühe mit einem einzigen E. coli K1 Kolonie und Kultur O / N bei 37 ° C, 200 Upm. Als Kontrolle für mittlere Verunreinigungen, bereiten 10 ml unbeimpften MH-Brühe und bei 37 ° C bei 200 Upm. </li><li> Transfer 100 ul O / N Bakteriensuspension in 9,9 ml MH-Brühe (1: 100 v / v), und bei 37 ° C, 200 rpm, bis zur mittleren exponentiellen Phase erreicht ist, entsprechend einer optischen Dichte von 0,6 bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD 600) gemessen. </li></ol> 3. Fütterung von neugeborenen Ratten mit E. coli K1 <ol><li> Halten Sie das Tier vertikal in einer Hand aus dem Genick, so dass der Mund zu öffnen. Langsam legen Sie die sterile Pipettenspitze in den Mund des Tieres und Pipette 20 ul des Inokulums (~ 37 ° C) in den Mund des Tieres über einen 30 sec Zeitraum. Bringen Sie das Tier zu seiner Mutter sofort nach der Fütterung. </li><li> Überprüfen Sie, dass 4 - 8 x 10 6 Bakterien wurden gefüttert to jeder Welpe durch serielle Verdünnung des Inokulums in PBS und Spek auf MH-Agar-Platten. </li></ol> 4. Bewertung der Kolonisation durch E. coli K1 <ol><li> Halten Sie das Tier mit einer Hand aus dem Genick. Befeuchten Sie ein steriles Wattestäbchen in sterilem PBS, und dann sanft Tupfer Perianalbereich. Bringen Sie das Tier zu seiner Mutter unmittelbar nach Abtupfen. </li><li> Legen Sie die Tupferspitze in ein Röhrchen mit 300 ul sterilem PBS und Lagerung auf Eis. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien durch serielle Verdünnung in PBS und Ausstreichen auf MacConkey-Agar-Platten. </li><li> Bestimmen tragfähige E. coli K1 durch Bakteriophagen Empfindlichkeitsprüfung. Wählen Sie ein Einzelkolonie mit einer sterilen mikrobiologischen Schleife, eingetaucht in 200 ul sterilem PBS, dann unterliegen Wirbelmischung. </li><li> Mit einem sterilen mikrobiologischen Schleife, Subkultur auf MH-Agar in einer geraden Linie. Damit die Platte für 30 Sekunden zu trocknen, und dann Pipette 10 ul bacteriophage K1E (10 9 Plaque bildenden Einheiten / ml (PFU / ml)) auf die Mitte der Linie. Die Platte O / N bei 37 ° C. </li><li> Am nächsten Tag, untersuchen Sie die Platte für Bakteriophagen-vermittelte Lyse. </li></ol> 5. Bewertung der Schwere der Erkrankung <ol><li> Beurteilen Sie den Schweregrad der Erkrankung der einzelnen Tiere 4-5 mal täglich mit der Sieben-Punkte-Bewertungssystem in der Tabelle 1 dargestellt. </li><li> Wenn ein Tier Partituren ≥3 von 7 sofort keulen das Tier so lange leiden muss. Nehmen Sie das Tier wie tot. </li></ol> 6. Euthanasie von neugeborenen Ratten und Blutentnahme <ol><li> Halten Sie das Tier in der einen Hand, Aussetzen der Kopf und Hals. Desinfizieren Sie den Hals des Tieres durch Abwischen mit einem Alkoholtupfer. Desinfizieren Sie eine große Schere mit 70% Ethanol, vor dem Spülen in sterilem PBS, um Spuren Ethanol zu entfernen. </li><li> Halten Sie das Tier direkt über einer Petrischale. Enthaupten Neugeborenen mit scharfen surgical Schere, um sicherzustellen, dass das Blut tropft in der Petrischale. Kontakt mit dem Kopf, um eine Verunreinigung des Blutes mit Hautflora zu verhindern vermeiden. </li><li> Sofort sammeln das Blut mit einem sterilen Pipette zugeben und mischen mit Heparin-Natriumsalz in einer Konzentration von 20 bis 50 Einheiten / ml in einer 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien durch serielle Verdünnung in PBS und Ausstreichen auf MacConkey-Agar-Platten. Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger E. coli K1 durch Testen der Empfindlichkeit von lebensfähigen Bakterien, Bakteriophagen K1E. </li></ol> 7. Dissection <ol><li> Nach Enthauptung des neugeborenen Ratten, verwenden aseptischen Bedingungen verbrauch und sammeln Geweben von Interesse. Waschen Sie alle Instrumente (in Abbildung 1 dargestellt) in 70% Ethanol und sterilem PBS. </li><li> Reinigen Sie die Dissektion Bord und benetzen die Leib vollständig mit 70% Ethanol. Positionieren Sie den Leichnam auf seinem Rücken und zu beheben, um die Dissektion Bord durch (i) Pinning die linke Hinterbein zuDie Betriebstabelle mit einer sterilen Nadel, (ii) Strecken der Leiche und Pinning die rechte Vorderbein auf dem Operationstisch, (iii) die Pinning rechten Hinterbein und das linke Vorderbein auf dem Operationstisch. </li><li> Ziehen Sie die Haut an der linken Seite des Unterleibs mit einer Pinzette, dann entlang der linken Seite der Leiche aus dem Unterbauch bis zum Brustbein mit kleinen Dissektion Schere geschnitten. </li><li> Verlängern Sie die Exzision über dem Brustbein, und dann auf der rechten Seite der Leiche vom Brustbein zu den Unterleib mit einer Pinzette und kleine Dissektion Schere, um sicherzustellen, dass keine der zugrunde liegenden Strukturen sind beschädigt. </li><li> Schließlich ziehen Sie vorsichtig nach unten die Hautlappen vom Brustbein zu den Unterbauch mit Iris gekrümmten Dissektion Pinzette auf das Bauchfell aus. </li><li> Heben vorsichtig das Bauchfell mit einer Pinzette und schneiden vertikal um die inneren Organe freizulegen, um sicherzustellen, dass keiner der Basiswerte Organe werden geschädigt. </li></ol> 8. SammelnGI-Trakt <ol><li> Identifizieren Sie den Magen, Dünndarm, Blinddarm, Dickdarm und mesenterialen lymphatischen Systems. </li><li> Entfernen Sie den Magen durch leichtes Durchtrennung an beiden Seiten und anschließend in einem Bijou mit 1,6 ml steriler PBS mit einer sterilen Pinzette. </li><li> Transekt den Doppelpunkt am Rektum. Ziehen Sie das gesamte Darmmasse von der Leiche mit Dissektion Pinzette und in einer sterilen Petrischale. Sicherzustellen, dass dies leicht getan, damit der Darmstruktur und mesenterialen Lymphknoten Strukturen nicht trennen. </li></ol> 9. Trennung des GI-Trakts und der mesenterialen Lymphsystem (Abbildung 2) <ol><li> Gießen Sie 30 ml steriler PBS in der Petrischale, die Gewährleistung der GI-Trakt vollständig eingetaucht ist. </li><li> Identifizieren Sie die zentrale Masse des mesenterialen lymphatischen Systems, und eine Prise mit feinen Sezierung Pinzette. Identifizieren Sie die meisten proximalen Teil des Dünndarms, und kneifen mit feinen Sezierung Pinzette. </li><li> Ziehen Sie langsam die Central Masse mesenterica Lymphsystem und dem distalen Dünndarm, in entgegengesetzte Richtungen, bis die beiden Gewebe sind vollständig voneinander getrennt. Führen Sie diesen Vorgang mit Sorgfalt, um sicherzustellen, dass der Dünndarm sind nicht gestreckt, da dies verhindert, dass reproduzierbare Sammlung von proximalen, mittleren und distalen Regionen. Platzieren Sie den mesenterialen Lymphsystem in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis. </li></ol> 10. Schnitte des GI-Trakts <ol><li> Schneiden den GI-Trakt in den Blinddarm, den Dünndarm aus dem Dickdarm zu trennen. </li><li> Platzieren Sie den Doppelpunkt in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis. </li><li> Sammeln repräsentative Gewebe von proximalen, mittleren und distalen Bereiche des Dünndarms. Richten Sie den Dünndarm aus dem Mittelpunkt. </li><li> Dann, (i) Sammeln der letzten 2 cm des Gewebes vor dem Blinddarm zum distalen Dünndarm, (ii) Sammeln des Gewebes 5-7 cm über dem mittleren Punkt zum proximalen Dünndarm und(Iii) Sammeln des Gewebes von 3 - 5 cm unterhalb des Mittelpunkts zur Mitte des Dünndarms. </li></ol> 11. Das Sammeln der Leber <ol><li> Identifizieren der drei Keulen der Rattenleber nach dem Entfernen des Magens. </li><li> Ziehen Lappen weg von der Bauchhöhle mit feinen Sezierung Pinzette. </li><li> Entfernen Sie die Leber durch Schneiden keine Befestigung Bänder mit einer feinen Schere. Zeigen Leber in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis. </li></ol> 12. Das Sammeln der Milz <ol><li> Identifizieren Sie die Milz. </li><li> Ziehen Milz vom Magen und verwenden feinen Schere, um die gastro Bänder geschnitten. </li><li> Zeigen Milz in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis. </li></ol> 13. Das Sammeln der Nieren <ol><li> Identifizieren die Nieren, die an der Rückseite der Bauchhöhle nach der Entfernung des Magen-Darm-Trakt und anderen Organen sichtbar wird. </li><li> Cut Harnleiter und alle Befestigungsbänder usingen feinen Sezierung Schere und Nieren zu entfernen mit feinen Pinzetten. Entfernen Nebennieren und jede Fettmaterial (falls noch angebracht) mit feinen Pinzetten und Dissektion Schere. </li><li> Legen Sie beide Nieren in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis. </li></ol> 14. Das Sammeln der Hirn <ol><li> Nach Enthauptung, halten Sie den Kopf in einer aufrechten Position mit einer gebogenen Pinzette. Pinch Haut auf dem Kopf in Längsrichtung mit einem anderen Satz von gebogenen Pinzette und einen Einschnitt mit feinen Sezierung Schere. Schneiden verbleibende Haut nahe Hals, nochmals in Längsrichtung mit feinen Sezierung Schere. </li><li> Ziehen Sie die Haut in einer Richtung nach außen mit feinen Pinzette auf beiden Seiten, um den Schädel zu offenbaren und zu entfernen Hautlappen mit feinen Sezierung Schere. Zeigen feinen Sezierung Schere in Rückenöffnung und einen Einschnitt entlang der Schädel in Richtung der Tribüne. </li><li> Ziehen Sie die beiden Teile der Schädel in einer Richtung nach außen mit feinen Pinzetten. Schnitt auf Schädelsegmente zu entfernen. </li><li&gt; Gehirn entfernen mit breiten Zangen, mit einem nach oben schaufeln Bewegung aus dem Rücken Öffnung gegenüber der Tribüne. Waschen Sie das Gehirn in PBS ausklopfen, um Blut aus Enthauptung Verfahren zu entfernen. </li></ol> 15. Gewebeverarbeitung und Homogenisierung <ol><li> Für Experimente erfordern Lebensfähigkeit zählt oder DNA-Extraktion, Ort Geweben in Röhrchen mit sterilem PBS. Die Zahl der lebensfähigen Bakterien sofort feststellen, durch serielle Verdünnung in PBS und Ausstreichen auf MacConkey-Agar-Platten, oder bei -20 ° C mit 20% Glycerin für kurzfristige. Zur DNA-Extraktion, speichern Gewebe bei -20 ° C. </li><li> Für Experimente RNA-Extraktion, Ort Geweben in geeignete Volumina RNAlater Lösung (10 ul pro 1 mg Gewebe) erfordern, dann sofort bei -20 ° C für kurzfristige oder bei -80 ° C Langzeitlagerung. </li><li> Für Experimente Bildgebung bedürftigen Ort Gewebe in 10 ml Methacarn-Lösung (60% Methanol, 30% Chloroform und 10% Essigsäure), dann speichern Sie eint RT (20 - 25 ° C) für bis zu 3 Wochen. </li><li> Berechnen Gewebegewicht durch Vergleich des Gewichts der Rohre vor und nach Zugabe von Geweben. Homogenisieren Gewebe mit einem Homogenisator. Einmal in 70% Ethanol und wasche zweimal den Homogenisator in sterile PBS dazwischen Homogenisierung jeder Probe. HINWEIS: Methacarn Fixierung ist wünschenswert für die Fixierung von Darmproben, um Mucin bedingte Schleimhautverteidigungsstrukturen zu bewahren; Formalin-Fixierung kann zur systemischen Geweben verwendet werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die hier beschriebene Tiermodell baut auf früheren Arbeiten, die auf die hervorstechenden Merkmale von natürlich vorkommenden Infektionen beim Menschen reproduzieren sollen. Neugeborenen Ratten wurden zunächst eingesetzt, um das Kinder Meningitis aufgrund H. studieren influenzae Typ b als die Art erfüllt die wichtigsten Kriterien für ein robustes Modell der Infektion. Somit sollte der Eintrittspforte des betreffenden Krankheitserregers der des natürlichen menschlichen Infektion reflektieren und reproduzierbar führen zu ähnlichen Pathologie von ausreichender Dauer, um für eine therapeutische Intervention zu ermöglichen. Die Techniken verwendet werden, nicht die Anwendbarkeit des Verfahrens begrenzt und sollte nicht auf den Krankheitsverlauf 20 bei. Das Modell von H. influenzae Meningitis bei Säugling Ratten durch Moxon und Kollegen entwickelten entspricht diesen Kriterien 20; die natürliche Infektion tritt nach der Kolonisierung der Schleimhäute der oberen Atemwege und dieses wichtige Merkmal wurde in Rattenjungen durch nicht-Trauma replizierttic Instillation der Bakterien auf die Membranen der Nasengänge. Wichtig ist, dass die altersabhängige Natur der Infektion im Modell nachgebildet. Die gleiche Gruppe waren auch die ersten, um eine nicht-invasive Modell von E. entwickeln coli K1 NBM in der neonatalen Ratten-22. Pathogen-freie Sprague-Dawley-Jungtiere wurden durch Zuführen 10. AUGUST - 10. Oktober Bakterien durch eine Magensonde oral kolonisiert; Das Inokulum wurde daher erheblich höher als die von uns eingesetzten. Besiedlung mit den drei K1-Stämmen untersucht, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) und LH (O75: K1: H3), trat bei einem relativ hohen Anteil (48-74%) des K1-gefütterten Tieren, aber Fälle von Bakteriämie, Meningitis und Mortalität waren variabel und deutlich niedriger als Raten von Kolonisation. Die klonale Natur E. coli K1 experimentelle Infektion wurde später 23 hergestellt, und es ist nun ersichtlich, dass nur O18: K1 und, in geringerem Maße, O7: K1 sind Serotypen Lagekonsequent verursachen systemische Infektion. Aus diesem Grund wird dieser Untersuchungen der Pathogenese neuropathogenic E. K1-Stamm A192PP: coli K1 wurden auf die Verwendung der Virulenz verstärkte O18 basiert. Ein Vergleich des E. coli K1 Zuführung von neugeborenen Ratten durch eine Magensonde, wie Glode und Kollegen 22 und einer Tröpfchenzufuhrverfahren der Todesfälle mit der früheren Methode, nahezu sicher auf Schäden verwendet werden, wie durch Achtman Gruppe 23 verwendet ergab eine übermäßige Anzahl an Oberflächen von mukosalen Magensonde. Da die Sätze der Kolonisierung sind vergleichbar mit diesen zwei Verfahren ist es empfehlenswert, die weniger invasive Verfahren zum Zuführen der Bakterien mit einer Pipette mit einer sterilen Spitze zu verwenden, wie in dieser Mitteilung beschriebenen. E. coli-Stamm A192PP in unseren Studien verwendete O18: K1. Es ist ein virulenter Derivat der klinischen Stamm E. coli A192, die ursprünglich von einem Patienten mit Septikämie 27 gewonnen wurde </sup&gt;. Die erhöhte Virulenz des Stammes wurde durch serielle Passage durch neugeborenen Ratten 26 erhalten. Der Stamm löst eine altersabhängige Krankheitsschwere, mit 100% Bakteriämie und Mortalität bei bis 2 Tage alten Tieren 28 verabreicht. Im Gegensatz dazu gibt 9 Tage alten Tieren vollständig resistent gegen Krankheiten. K1-spezifische lytische Bakteriophagen verwendet, um E. differenzieren coli K1 aus anderen E. coli-Stämme 29. In dieser Studie sollte die Anfälligkeit der lebensfähigen Bakterien Bakteriophagen K1E um (i) verwendet werden überprüfen die Reinheit des E. coli K1 Suspensionen hergestellt, die den Tieren zugeführt werden, und (ii) unterscheiden, um E. coli K1 aus anderen Coliformen, um die Lebensfähigkeit in perianalen Tupfer, Blut- und Gewebeproben zu berechnen. Wenn die Kolonie E. coli K1, werden sie anfällig für Bakteriophagen K1E Lyse sein und Bakterienwachstum wird an der Stelle des Bakteriophagen Impfung verhindert werden. Wenn die Kolonie nicht E. coli K1, wird be beständig KIE Bakteriophagen Lyse, und es sollte ein Bereich des Bakterienwachstums an der Stelle der Inokulation Bakteriophagen sein. Es sollte bedacht werden, dass Tiermodelle können alle Funktionen des natürlich vorkommenden Krankheit nicht reflektieren. Das aktuelle Modell kann modifiziert werden, um die Virulenz Merkmale anderer als E. neuropathogenic Bakterien untersuchen coli A192PP und Variationen in der Größe der Kolonisierung Inokulum untergebracht werden können. Zukünftige Anwendungen der Technik könnten die Bewertung von dringend benötigten Medikamenten, um den Zustand zu behandeln und um Details der Wirtsantwort auf Kolonisation und Gewebeinvasion aufzudecken. Die hier beschriebene Methode ist einfach, aber effektiv. Einzel Würfe von 10-12 Welpen wurden als Test- oder Kontrollgruppen eingesetzt und dies innerhalb-Wurf Ansatz gewährleistet ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und statistische Gültigkeit. Es ist zwingend notwendig, dass die Welpen in ihre natürliche Mütter so schnell wie möglich nach jeder procedur zurücke und Würfe sollten daher nicht enthalten Tiere unterziehen verschiedene Interventionen. Es ist wichtig, dass die Fed Inokulum erwärmt sonst die Welpen werden die angebotenen Kultur abzulehnen. Die Welpen entwickeln sich schnell eine komplexe Mikrobiota und innerhalb von zwei Tagen nach der Geburt der GI-Trakt ist mit einer breiten Palette von Bakterien aus der als der am häufigsten vorkommenden Mikroben in der Säuglings- und Erwachsenen gut etablierten Stämme besiedelt. Pups, die nicht E. zugeführt haben coli A192PP nicht E. tragen coli K1 im GI-Trakt 17 und damit Bestimmung der Raten der Besiedlung ist relativ einfach. Jedoch basierte die neuS qPCR Verfahren zum Nachweis von E. kolonisierenden coli K1 ist viel empfindlicher, dass die traditionellen Kulturverfahren und wird dringend empfohlen 17.

Systemischen bakteriellen Infektionen sind eine große Bedrohung für das Wohlergehen und das Überleben des Neugeborenen; Frühgeborene sind besonders gefährdet. Neonatalen bakteriellen Meningitis (NBM), häufig mit bakterieller Sepsis, weiterhin eine signifikante Quelle von Mortalität und Morbidität in den ersten Lebenswochen und das Problem wird durch die ständige Weiterentwicklung der Beständigkeit gegen Frontantibakterielle Medikamente 1,2 verstärkt. Ein Fall von NBM ist ein medizinischer Notfall, der eine hohe medizinische, soziale und wirtschaftliche Belastung 3 trägt; Folglich besteht ein dringender Bedarf für neue Therapeutika und insbesondere neuartige prophylaktische Strategien, um die Last der Infektion. Einige Features von NBM sind ungewöhnlich: in der entwickelten Welt, sind Escherichia coli und Streptokokken der Gruppe B für die große Mehrzahl der Fälle und der Fähigkeit dieser Stämme zu NBM entlocken verantwortlich ist fast immer mit der Gegenwart eines Schutz Polysaccharid ca zugeordnetpsule dass der Erreger ermöglicht, Immunerkennung entziehen Prozesse 4. Ein sehr hoher Anteil (80 - 85%) der neuroinvasive E. coli exprimieren das K1-Kapsel 5,6, eine α-2,8-verknüpfte Poly-Sialinsäure-Polymer, das strukturell identisch mit Modulatoren der neuronalen Plastizität 7 Host ist. Die Bewertung neuer Therapeutika und Prophylaxe für NBM und zugehörige Bakteriämie und Sepsis würde klar von einer robusten Tiermodell der Infektion, die die wichtigsten Merkmale der Krankheit im menschlichen Neugeborenen nachahmt, insbesondere die starke Altersabhängigkeit und dem natürlichen Weg der Infektion profitieren . Eine breite Palette von Modellen für Gram-positive und Gram-negative bakterielle Meningitis stehen 8,9 und diese haben unser Wissen über Pathogenese, Pathophysiologie und Behandlungsmöglichkeiten in dieser Infektionen erheblich erweitert. So experimentellen Infektionen bei Ratten, Mäuse, Kaninchen und Affen wurden verwendet, um Meningitis sowohl in der n studiereneonate und die Erwachsenen. Allerdings sind viele dieser Modelle verwenden direkte intracisternal oder subkutane Injektion von Bakterien für die Initiation der Infektion, eine künstliche Pathogenese durch Umgehen natürlichen Prozesse der Verbreitung von der Stelle der Kolonisation. In einigen Fällen sind diese Methoden der Inokulation führte zu signifikanten Veränderungen in der Pathologie; beispielsweise subkutaner Verabreichung von E. coli K1-Stämme hob die Altersabhängigkeit mit der natürlichen Infektion assoziiert, Herstellung Bakteriämie und Invasion des zentralen Nervensystems (ZNS) in beiden Neugeborenen und Erwachsenen 10. Prädisposition für E. coli NBM hängt entscheidend vertikale Übertragung des Erregers von der Mutter auf das Kind bei oder kurz nach der Geburt 11. Maternale E. coli K1 Bakterien besiedeln den Neugeborenen gastrointestinale (GI-Trakt) 11-13, die steril bei der Geburt ist, aber schnell erwirbt einen komplexen Mikrobiota 14. In kolonisierten Neugeborenen, E. coliK1 Bakterien haben die Fähigkeit, aus dem Darmlumen in den Blutkreislauf vor Eintritt in das CNS durch die Blut-Hirn- oder Blut-Liquor-Schranken 9,15 translozieren. Das Design der robusten Modelle der experimentellen Infektion sollte diese Details zu berücksichtigen. Obwohl Mäuse wurden weit verbreitet für die Untersuchung von einigen Formen der bakteriellen Meningitis 8 verwendet werden, sind sie für die Untersuchung der neonatalen Infektionen geeignet, sie werden durch eine systemische Infektion überwältigt und nicht die starken Altersabhängigkeitscharakteristik des menschlichen Säuglingen 16 zeigen. Ferner α-Defensine, Schlüssel Peptide der GI-Trakt Schutz gegen systemische Invasion durch E. coli K1 17 sind stark in Paneth-Zellen und Neutrophile in Menschen und Ratten, aber nicht in Mäusen 18 ausgedrückt. Es ist ein bemerkenswertes Maß an Überschneidungen, Redundanz und Heterogenität in der Maus Defensin und verwandte cryptidin Gene nicht in anderen eine gefundenimals 19. Die neugeborenen Ratten wurde ursprünglich von Moxon 20 verwendet und Mitarbeiter, um die Pathogenese der Haemophilus influenzae Meningitis folgenden intranasale Impfung zu untersuchen, die Replikation der natürlichen Standort der Kolonisation dieser neonatalen Krankheitserreger im menschlichen, und anschließend für altersabhängige E. angepasst coli K1 Bakteriämie und Meningitis. Bortolussi et al. 21 Arbeitnehmer intraperitoneale Injektion des bakteriellen Inokulums auf eine Infektion auszulösen, aber der Schlüsselstudie von Glode und Mitarbeiter 22 verwendete orale Magen Fütterung, um die natürlichen Infektionsweg nach GI Kolonisierung parallel. Da die Magensonde kann Schleimhautoberflächen beschädigen, wurde das Verfahren verfeinert werden, um Zufuhr des Inokulums in den Neugeborenen 23 umfassen. Hier wird das Verfahren zum Gastrointestinaltrakt Kolonisierung und Verfahren zum Verfolgen der Infektion in anfälligen jungen Ratten beschrieben; zusätzlich werden therapeutische und präventive Anwendungen des Modells diskutiert.

<table><tbody><tr><td>Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)</td><td><a href="http://www.harlan.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Harlan, UK</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli K1 A192PP</td><td><a href="http://www.ucl.ac.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Taylor lab</a></td><td></td><td>Mushtaq &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2004</td></tr><tr><td>Bacteriophage K1E</td><td><a href="http://www.ucl.ac.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Taylor lab</a></td><td></td><td>Mushtaq &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2004</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton Agar</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Oxoid, UK</a></td><td>CM0037</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton Broth</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Oxoid, UK</a></td><td>CM0405</td><td></td></tr><tr><td>MacConkey Agar</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Oxoid, UK</a></td><td>CM0007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Salt</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>84020</td><td>Prepare 20 - 50 units/ml</td></tr><tr><td>RNAlater Solution</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>R0901</td><td>10 &amp;mu;l/mg tissue</td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped swabs</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>11542483</td><td></td></tr><tr><td>Alcotip Swabs</td><td><a href="http://www.scientificlabs.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Scientific Laboratory Supplies, UK</a></td><td>SWA1000</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>P5856</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Universal Tube</td><td><a href="http://www.alphalabs.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> AlphaLaboratories, UK</a></td><td>CW3890</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml microcentrifuge tubes</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>I1405-1500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &amp;mu;l calibrated loops</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>E1412-0112</td><td></td></tr><tr><td>L-shaped spreaders</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>E1412-1005</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>10594175</td><td></td></tr><tr><td>Forceps straight with fine points</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12780036</td><td></td></tr><tr><td>Forceps straight with blunt tips</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12391369</td><td></td></tr><tr><td>Forceps watchmaker&#039;s curved with very fine points</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12740926</td><td></td></tr><tr><td>Scissors straight with very fine points</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12972055</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Scissors</td><td><a href="http://www.vwr.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> VWR, UK</a></td><td>USBE4251</td><td></td></tr><tr><td>25 G Syringe Needles</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Greiner Bio-One Ltd</a></td><td>N2525</td><td></td></tr><tr><td>LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers</td><td><a href="http://www.perkinelmer.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> PerkinElmer, UK</a></td><td>L60000BB</td><td></td></tr><tr><td>Unitemp Incubator</td><td>B&amp;amp;T, UK</td><td>OP958</td><td></td></tr><tr><td>Multitron shaking incubator</td><td><a href="http://www.infors-ht.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> INFORS HT, UK</a></td><td>AJ118</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Turrax T-10 homogenizer</td><td><a href="http://www.ika.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> IKA Werke</a></td><td>0003737000</td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Wirtstier und bakterielle Erreger ist nur dann sinnvoll, wenn die Infektionsmodell verwendet repliziert die wesentlichen Merkmale des natürlichen Infektion. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die Festlegung und Bewertung der systemischen Infektion aufgrund neuropathogenic Escherichia coli K1 in der neonatalen Ratten. Colonization des Gastrointestinaltraktes eine Verbreitung des Erregers entlang der gut-Lymph-Blut-Hirn-Verlauf der Infektion und das Modell zeigt starke Altersabhängigkeit. Ein Stamm von E. coli O18: K1 mit erhöhter Virulenz für den neugeborenen Ratten produziert außergewöhnlich hohen Raten der Kolonisation, Translokation in den Blutabteil und Invasion der Hirnhäute folgenden, durch das Adergeflecht. Wie in dem menschlichen Wirt, wird das Eindringen des zentralen Nervensystems durch lokale Entzündung und einer fest Letalausgang begleitet. Das Modell ist aus bewährten Werkzeug für Studien des Mechanismusder Pathogenese, für die Bewertung der therapeutischen Interventionen und für die Beurteilung der bakteriellen Virulenz.

Die E. coli K1 hier beschriebenen systemischen Infektion Modell gibt viele der Funktionen des natürlichen Infektion beim Menschen. Die Bakterien werden eingenommen, besiedeln den GI-Trakt, translozieren in den Blutraum über die mesenterialen Lymphknoten vor der Gründung organspezifische Erkrankung zugeordnet Entzündung des Gehirns 24. Wichtig ist, zeigt das Modell starke Altersabhängigkeit; wie in Figur 3 gezeigt, sind zwei Tage alten (P2) Rattenjungen sehr anfällig für invasive Krankheit, sondern über einen Zeitraum von sieben Tagen werden die Tiere zunehmend resistent gegen eine Infektion, aber nicht Wege Kolonisierung 17 GI. Nach dem Transport von dem Ort der GI Kolonisierung an den Blutabteil, die Bakterien in Blutproben durch Fluoreszenzmikroskopie (4) vor Eintritt in das ZNS vorwiegend im Plexus choroideus 25 visualisiert werden. Bei einigen Tieren gibt es umfangreiche Invasion anderer wichtiger Organe wieLunge, Milz und Niere 25. Bakterienzahlen im Gewebe im wesentlichen zwischen den einzelnen Welpen 25, jedoch variieren, wenn die Keimbelastung ist entweder vorhanden oder nicht vorhanden ist, gibt es eine hohe Reproduzierbarkeit bei der Organ Invasion erzielt. Mit einem Wurf von 12 Welpen als Einzeltest Kohorte, Stromrechnungen mit G * Power Software ermittelt, dass dieses Stichprobengröße entspricht einer 98,6% Wahrscheinlichkeit, ein Effekt auf das Überleben mit sechs Tieren aus der Kohorte und&gt; 99% Wahrscheinlichkeit, wenn alle zwölf berücksichtigt. Das Modell ist deshalb geeignet zur Beurteilung von neuen Substanzen, die speziell für die Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Neugeborenen zugeschnitten und wurde in dem Verfahren verwendet worden, um das therapeutische Potential der Kapsel Depolymerase EndoE die selektiv entfernt die K1-Kapsel von der Bakterienoberfläche 24-26 zu bewerten. Es kann auch verwendet werden, um Host-Bakterien-Interaktionen zu untersuchen, dass die Auswirkungen auf die pat werdenhogenesis von E. coli neuropathogens; In diesem Zusammenhang ist es für die Untersuchung verwendet wurden E. coli A192PP Kolonisierung und Verbreitung. Es hat sich gezeigt, dass E. coli A192PP Zellen bestehen im GI-Trakt von P2, P5 und P9 Welpen in großer Zahl; zeitliche Aspekte der Besiedlung in diesen drei Gruppen sehr ähnlich waren (Figur 5) und spiegelt die Fähigkeit der Bakterien zu replizieren und zu halten Bevölkerungsdichte im Darm. Die Virulenz des klinischen Isolat A192 wurde durch serielle Passage in neugeborenen Ratten, um wenig oder keine Redundanz der Tiernutzung sicherzustellen verbessert. E. coli besiedelt A192 P2 neonatalen Ratten mit 100% Effizienz, ausgelöst Bakteriämie bei 35% der Tiere und produzierte eine letale Wirkung in 25% 27. Die agiert derivative A192PP kolonisiert den GI-Trakt produziert Bakteriämie und verursacht Letalität in allen P2 Welpen. Somit kann das Modell verwendet, um die Virulenz zu untersuchen different K1-Stämme in Bezug auf ihre Fähigkeit, das ZNS und andere Organsysteme von der Website der Kolonisation einzudringen. In diesem Zusammenhang Pluschke und Mitarbeiter 23 verwendet einen neugeborenen Ratten Infektionsmodell, um die Kapazität 95 zu bestimmen E. coli K1-Stämme menschlichen Ursprungs zu Bakteriämie nach Darmbesiedlung zu verursachen; sie beobachtet große Unterschiede in der Effizienz der beiden Kolonisierung und invasive Fähigkeit, auf denen die klonalen Natur E. coli K1 neuropathogens. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Materialien für die Gewebesammlung: (A) Waage, (B) vorgewogen Röhrchen notwendigen Medien, (C) OP-Tisch, Lineal und Nadeln zu fassen das Tier, (D) 70% (v / v) Ethanol und PBS zu sterilisieren die Gewebesammelgeräte, <sTrong&gt; (E) Gewebesammel Kit mit einem großen Schere für Enthauptung und Schere und Pinzette und Klingen verschiedener Größe und Formen, (F) Eis, um das Gewebe zu erhalten, (G) 70% (v / v) Ethanol zum Sterilisieren dem Operationstisch und umgibt. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" /> Figur 2. Trennung des GI-Trakts und der mesenterischen Lymphsystems. (A) Grip die zentrale Masse des mesenterialen Lymphsystem mit feinen Sezierung Pinzette. (B) Grip der proximale Teil des Dünndarms, und ziehen in entgegengesetzte Richtungen. (C) Das GI-Trakt und mesenterialen Lymphsystem vollständig separate. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Überleben der Neugeborenen Rattenjungen zwei Tage (P2) bis neun Tage (P9) im Alter nach oraler Verabreichung von E. coli A192PP, veranschaulicht die starke Altersabhängigkeit der systemischen Infektion. Jede Gruppe stellt 24 Neugeborenen. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" /> Abbildung 4. Fluoreszenzaufnahmen von E. coli A192PP Zellen in einem Blutausstrich von einer P2-pup Infizierten nach oraler Verabreichung von Bakterien. Das Lipopolysaccharid O-Antigen an der Bakterienoberfläche war stmit Kaninchen-Anti-O18 polyklonalen Antikörper und Alexa546-konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-Zweitantikörper ained. Die K1-Kapsel wurde mit EndoE-GFP Reagenz visualisiert. Praktisch alle in Blutproben nachgewiesen Bakterien angezeigt die Schutz K1-Kapsel. Die Bilder wurden von Dr. Andrea Zelmer gefangen genommen. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. E. coli A192PP Darmbesiedlung nach der Verabreichung des bakteriellen Inokulums. DNA wurde aus Gesamtdarm und E. extrahierten coli K1-Kolonie-bildenden Einheiten / g (KBE / g) durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) bestimmt gezielt den Polysialyl (neuS Gen) Gewebe wie an anderer Stelle beschrieben 17 </sup&gt;. LOD: Nachweisgrenze. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Feature </td><td> Gesund </td><td> Ungesund </td></tr><tr><td> Farbe der Haut </td><td> Rosa </td><td> Pale / Gelb </td></tr><tr><td> Agility (Aufrichtungsreflexes) </td><td> Pup kehrt sofort auf rückwärts Platzierung </td><td> Schwierigkeit bei der Umkehr rückwärts Platzierung (&gt; 3 s) oder nicht erreichen können </td></tr><tr><td> Sanfter Druck auf den Unterleib </td><td> Kein Ton </td><td> Sound of Agitation </td></tr><tr><td> Magen / Milchleitung </td><td> Sichtbare und weiß </td><td> Nicht sichtbar </td></tr><tr><td> Temperatur </td><td> Warm </td><td> Relativ kalt * </td></tr><tr><td> Gewicht </td><td> Gewinn von 1,5-2 g pro Tag </td><td> Keine Gewichtszunahme oder Gewichtsverlust </td></tr><tr><td> Verhalten, wenn im Käfig </td><td> Schritte in Richtung Mutter und beginnt feeding </td><td> Kann nicht zur Mutter zu bewegen und zeigt Schwierigkeiten Fütterung </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Sieben-Punkte-Bewertungssystem: Die ersten drei aufgeführten Partituren sind in der Regel die beobachteten Anzeichen. * Neugeborenen mit systemischen Infektion Erfahrung erhöhte Körpertemperatur (&gt; 2 ° C). Aufgrund des Mangels an Agilität der Tiere, um ihre Mutter zu erreichen, um die Körpertemperatur zu halten, kann ungesunden Tieren abgetrennten aus dem Wurf geworden und fühlen sich kalt an der bloßen Hand.

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Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Hier wird ein Verfahren für die Festlegung der systemischen Infektion in der neonatalen Ratten mit Kulturen von Escherichia coli K1 beschrieben. Diese nichtinvasive Vorgehensweise erlaubt Besiedlung des Magen-Darm-Trakt, die Translokation des Erregers in den systemischen Kreislauf, und das Eindringen des zentralen Nervensystems in den Plexus choroideus.

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion in der neonatalen Ratten

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

non-invasive-model-neuropathogenic-escherichia-coli-infection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

10.9K Aufrufe.  University College London.  Hier wird ein Verfahren für die Festlegung der systemischen Infektion in der neonatalen Ratten mit Kulturen von Escherichia coli K1 beschrieben. Diese nichtinvasive Vorgehensweise erlaubt Besiedlung des Magen-Darm-Trakt, die Translokation des Erregers in den systemischen Kreislauf, und das Eindringen des zentralen Nervensystems in den Plexus choroideus. 

Serie: Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe and permanent neuropsychological sequelae, including mental retardation, cerebral palsy, and epilepsy. The outcomes of HIE are devastating and permanent, making it critical to identify and develop therapeutic strategies to reduce brain injury in newborns with HIE. To that end, the neonatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury has been developed to model this human condition. The HIE model was first validated by Vannucci et al 1 and has since been extensively used to identify mechanisms of brain injury resulting from perinatal hypoxia-ischemia 2 and to test potential therapeutic interventions 3,4. The HIE model is a two step process and involves the ligation of the left common carotid artery followed by exposure to a hypoxic environment. Cerebral blood flow (CBF) in the hemisphere ipsilateral to the ligated carotid artery does not decrease because of the collateral blood flow via the circle of Willis; however with lower oxygen tension, the CBF in the ipsilateral hemisphere decreases significantly and results in unilateral ischemic injury. The use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to stain and identify ischemic brain tissue was originally developed for adult models of rodent cerebral ischemia 5, and is used to evaluate the extent of cerebral infarctin at early time points up to 72 hours after the ischemic event 6. In this video, we demonstrate the hypoxic-ischemic injury model in postnatal rat brain and the evaluation of the infarct size using TTC staining.

The postnatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury is a well-established model of human neonatal hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). In this article, we describe the model of HIE in post-natal rat pups.

Die hypoxische ischämischen Enzephalopathie Model of Perinatal Ischämie

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe ...

Forschung

Biologie

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

Die<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Immunologie und Infektion

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Modellierung Enzephalopathie praematurorum Mit Prenatal Hypoxie-Ischämie mit Intra-Frucht Lipopolysaccharide bei Ratten

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

Medizin

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Intrarenale Injektion von<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In einem Rattenmodell der Pyelonephritis

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal ...

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human intestinal epithelium, leading to increased intestinal permeability, impaired restitution, and increased cell death. Although there are numerous animal models of NEC, response to injury and therapeutic interventions may be highly variable between species. Furthermore, it is ethically challenging to study disease pathophysiology or novel therapeutic agents directly in human subjects, especially children. Therefore, it is highly desirable to develop a novel model of NEC using human tissue. Enteroids are 3-dimensional organoids derived from intestinal epithelial cells. They are ideal for the study of complex physiologic interactions, cell signaling, and host-pathogen defense. In this manuscript we describe a protocol that cultures human enteroids after isolating intestinal stem cells from patients undergoing bowel resection. The crypt cells are cultured in media containing growth factors that encourage differentiation into the various cell types native of the human intestinal epithelium. These cells are grown in a synthetic, collagenous mix of proteins that serve as a scaffold, mimicking the extra-cellular basement membrane. As a result, enteroids develop apical-basolateral polarity. Co-administration of lipopolysaccharide (LPS) in media causes an inflammatory response in the enteroids, leading to histologic, genetic, and protein expression alterations similar to those seen in human NEC. An experimental model of NEC using human tissue may provide a more accurate platform for drug and treatment testing prior to human trials, as we strive to identify a cure for this disease.

Enteroids are emerging as a novel model in the study of human disease. The protocol describes how to simulate an enteroid model of human necrotizing enterocolitis using lipopolysaccharide (LPS) treatment of enteroids generated from neonatal tissue. Collected enteroids demonstrate inflammatory changes akin to those seen in human necrotizing enterocolitis.

Neuartige menschlichen epitheliale Enteroid Modellcharakter für die nekrotisierende Enterokolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a protocol for studying the pathogenesis of E. coli O1:K1:H7, a serotype responsible for high mortality rates in neonates. Our method utilizes intravital imaging of neonatal pups at different time points during the progression of infection. This imaging, paralleled by measurement of bacteria in the blood, inflammatory profiling, and tissue histopathology, signifies a rigorous approach to understanding infection dynamics during sepsis. In the current report, we model two infectious inoculums for comparison of bacterial burdens and severity of disease. We find that subscapular infection leads to disseminated infection by 10 h post-infection. By 24 h, infection of luminescent E. coli was abundant in the blood, lungs, and other peripheral tissues. Expression of inflammatory cytokines in the lungs is significant at 24 h, and this is followed by cellular infiltration and evidence of tissue damage that increases with infectious dose. Intravital imaging does have some limitations. This includes a luminescent signal threshold and some complications that can arise with neonates during anesthesia. Despite some limitations, we find that our infection model offers an insight for understanding longitudinal infection dynamics during neonatal murine sepsis, that has not been thoroughly examined to date. We expect this model can also be adapted to study other critical bacterial infections during early life.

Infection of neonatal mice with bioluminescent E. coli O1:K1:H7 results in a septic infection with significant pulmonary inflammation and lung pathology. Here, we describe procedures to model and further study neonatal sepsis using longitudinal intravital imaging in parallel with enumeration of systemic bacterial burdens, inflammatory profiling, and lung histopathology.

Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Assessment of Intestinal Transcytosis of Neonatal Escherichia coli Bacteremia Isolates

Newborns ingest maternal E. coli strains that colonize their intestinal tract around the time of delivery. E. coli strains with the ability to translocate across the gut invade the newborn's bloodstream, causing life-threatening bacteremia. The methodology presented here utilizes polarized intestinal epithelial cells grown on semipermeable inserts to assess the transcytosis of neonatal E. coli bacteremia isolates in vitro. This method uses the established T84 intestinal cell line that has the ability to grow to confluence and form tight junctions and desmosomes. After reaching confluence, mature T84 monolayers develop transepithelial resistance (TEER), which can be quantified using a voltmeter. The TEER values are inversely correlated with the paracellular permeability of extracellular components, including bacteria, across the intestinal monolayer. The transcellular passage of bacteria (transcytosis), on the other hand, does not necessarily alter the TEER measurements. In this model, bacterial passage across the intestinal monolayer is quantified for up to 6 h post-infection, and repeated measurements of TEER are made to monitor the paracellular permeability. In addition, this method facilitates the use of techniques such as immunostaining to study the structural changes in tight junctions and other cell-to-cell adhesion proteins during bacterial transcytosis across the polarized epithelium. The use of this model contributes to the characterization of the mechanisms by which neonatal E. coli transcytose across the intestinal epithelium to produce bacteremia.

Assessment of Intestinal Transcytosis of Neonatal Escherichia coli Bacteremia Isolates

Escherichia coli&#160;causes sepsis in neonates who ingest the bacteria around the time of birth. The process involved in&#160;E. coli&#8217;s&#160;ability to travel from the enteric tract to the bloodstream is poorly understood. This&#160;in vitro&#160;model assesses the ability of&#160;E. coli&#160;strains to travel through the intestinal epithelial cells.

Beurteilung der intestinalen Transzytose von neonatalen Escherichia coli Bacteremia-Isolaten

Newborns ingest maternal E. coli strains that colonize their intestinal tract around the time of delivery. E. coli strains with the ability to translocate ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Ein neonatales BALB/c-Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...

Early Pathological and Magnetic Resonance Detection of Cerebral Injury Using a Rat Model of Neonatal Hypoxic Ischemic Encephalopathy

Perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is an acute disease that may afflict newborns, resulting in variable long- and short-term neurodevelopmental outcomes. Early diagnosis is critical to identifying infants who may benefit from intervention; however, early diagnosis relies heavily on clinical criteria. No molecular or radiological tests have shown promise in detecting early cerebral injury. Studies have shown that magnetic resonance imaging (MRI) can show changes in both blood flow/ischemia and metabolic disruption. However, they have all been used to evaluate the secondary phase of the disease (&gt;12 h) after the onset of the injury. Early diagnosis is critical to rapidly starting therapeutic hypothermia in eligible infants, which is currently recommended to be initiated within 6 h of birth. The rat model of hypoxic-ischemic injury was developed in 1981 and has been validated and used extensively to study changes in brain perfusion, cerebral injury markers, and morphology. However, it has primarily been used as a "late model", evaluating injury several days after the initial ischemic insult. The model has been known to have poor sensitivity in evaluating reliable and reproducible early cerebral changes. The objective of this study was to develop a reliable model to study early gross morphological and radiological markers of HIE using pathological staining and cerebral magnetic resonance imaging/magnetic resonance spectroscopy.

The present protocol describes a rodent model of newborn hypoxic-ischemic injury for identifying early changes in cerebral tissue by gross morphology and magnetic resonance imaging. This has benefits over existing models, which can be used to study late injury but do not allow the evaluation of reproducible early changes.

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic

Zusammenfassung

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