Name: non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat
Uploaded: 2014-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
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Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação G0400268 e MR / K018396 / 1 do Conselho de Pesquisa Médica, e pela Acção Medical Research. Um apoio adicional foi fornecido pelo Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde da Universidade College London Hospitals Biomedical Research Centre.

Todos os experimentos com animais realizados neste estudo conformados com a legislação nacional e europeia e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Farmácia da UCL e do Reino Unido Home Office (HO). Todo o trabalho animal foi conduzido sob projeto HO licencia PPL 80/2243 e 70/7773 PPL. 1. Rat Preparação <ol><li> Realizar todos os experimentos in vivo utilizando ratos Wistar neonatais isentos de agentes patogénicos. </li><li> Guarde todas as ninhadas de ratos neonatos (12 por colônia) em gaiolas individuais com as mães que amamentam (9 - 11 semanas de idade) do sexo feminino, sob condições ideais (19-21 ° C, 45-55% de umidade, 15-20 trocas de ar / hora e 12 h ciclo claro / escuro). </li></ol> 2. Preparação celular bacteriana <ol><li> Loja E. existências coli K1 em 20% (v / v) de glicerol a -80 ° C. Para cada experiência, as bactérias placa pasta sobre Mueller-Hinton (MH) placas de agar, e incubar a 37 ° CO / N. </li><li> O dia antes da alimentação, inocufinal 10 ml de caldo MH, com um único E. coli K1 colónia e cultura O / N a 37 ° C, 200 rpm. Como um controlo para a contaminação forma, preparar 10 ml de caldo MH não inoculado e incubar a 37 ° C a 200 rpm. </li><li> Transferir 100 uL de suspensão bacteriana S / N em 9,9 ml de caldo MH (1: 100 v / v), e incubar a 37 ° C, 200 rpm, até o meio-exponencial de fase é atingida, o que corresponde a uma densidade óptica de 0,6 medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD 600). </li></ol> 3. A alimentação de ratos recém-nascidos com E. coli K1 <ol><li> Suavemente segurar o animal verticalmente em um lado da nuca do pescoço, permitindo que a boca se abra. Lentamente inserir a ponta de pipeta estéril para dentro da boca do animal, e pipeta de 20 uL do inoculo (~ 37 ° C) para dentro da boca do animal ao longo de um período de tempo de 30 seg. Retorne o animal para sua mãe imediatamente após a alimentação. </li><li> Verificar se 4-8 x 10 6 bactérias foram alimentados to cada filhote por diluição em série do inóculo em PBS e manchas em ágar MH. </li></ol> 4. Avaliação de colonização por E. coli K1 <ol><li> Suavemente segurar o animal em um lado da nuca do pescoço. Umedeça um cotonete estéril em PBS estéril, e, em seguida, esfregue suavemente a área perianal. Retorne o animal para sua mãe imediatamente após o esfregaço. </li><li> Colocar a ponta de mecha para um tubo contendo 300 ul de PBS estéril e armazenar em gelo. </li><li> Determinar o número de bactérias viáveis ​​por diluição em série em PBS e plaqueamento em placas de agar MacConkey. </li><li> Determine viável E. coli K1 por testes de susceptibilidade bacteriófago. Escolha uma colónia individual usando um loop microbiológica estéril, mergulhado em 200 mL de PBS estéril, então sujeitas a agitação no vórtex. </li><li> Usando um loop microbiológica estéril, sub-cultura em ágar MH em uma linha reta. Permitir que a placa secar durante 30 segundos, e, em seguida, pipeta 10 ul de bacK1E teriophage (10 9 unidades formadoras de placas / ml (PFU / ml)) para o centro da linha. Incubar a placa de O / N a 37 ° C. </li><li> No dia seguinte, examinar a placa para a lise mediada por bacteriófago. </li></ol> 5. Avaliação da Gravidade da doença <ol><li> Avaliar a gravidade da doença de cada animal 4 - 5 vezes por dia utilizando o sistema de pontuação de sete pontos descrito na Tabela 1. </li><li> Se uma pontuação animais ≥3 de 7, abater o animal imediatamente para minimizar o sofrimento. Grave o animal morto. </li></ol> 6. eutanásia de ratos recém-nascidos e coleta de sangue <ol><li> Suavemente segurar o animal em um lado, expondo a cabeça e pescoço. Desinfetar o pescoço do animal, limpando com uma compressa com álcool. Desinfetar um grande par de tesouras, usando etanol 70%, antes de enxaguar em PBS estéril para remover o etanol traço. </li><li> Gentilmente segurar o animal diretamente acima de uma placa de Petri. Decapitar o recém-nascido utilizando Surgi afiadatesoura cal, garantindo que o sangue escorre na placa de Petri. Evitar o contacto com a cabeça para evitar a contaminação do sangue com flora da pele. </li><li> Imediatamente recolher o sangue utilizando uma pipeta estéril e misturar com o sal de sódio de heparina a uma concentração de 20-50 unidades / ml num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. </li><li> Determinar o número de bactérias viáveis ​​por diluição em série em PBS e plaqueamento em placas de agar MacConkey. Determinar os números de viável E. coli K1, testando a susceptibilidade das bactérias viáveis ​​para K1E bacteriófago. </li></ol> 7. Dissecção <ol><li> Após a decapitação do rato neonatal, utilize condições assépticas para extirpar e coletar tecidos de interesse. Lave todos os instrumentos (mostrados na Figura 1) em etanol a 70% e PBS estéril. </li><li> Limpe o tabuleiro de dissecação e molhar as abdômen completamente com etanol 70%. Posicione o cadáver em suas costas e fixar a placa dissecção por (i) fixar a perna esquerda paraa mesa de operação com uma agulha estéril, (ii) que se estende do cadáver e fixando a pata dianteira direita para a mesa de operação, (iii) fixar a perna traseira direita e pata dianteira esquerda para a mesa de operação. </li><li> Retire a pele ao longo do lado esquerdo da parte inferior do abdome, usando uma pinça, em seguida, corte ao longo do lado esquerdo do cadáver do abdômen inferior ao esterno utilizando pequenas tesouras de dissecação. </li><li> Estender a excisão em todo o esterno, e depois para baixo do lado direito do corpo do esterno para o abdome inferior, utilizando uma pinça e uma tesoura pequena de dissecação, garantindo que nenhuma das estruturas subjacentes estão danificados. </li><li> Finalmente, puxe para baixo a aba de pele do esterno para parte inferior do abdome utilizando íris fórceps de dissecação curvas para expor o peritônio. </li><li> Suavemente elevar o peritoneu com uma pinça e cortado verticalmente para expor os órgãos internos, assegurando que nenhum dos órgãos subjacentes sejam danificados. </li></ol> 8. Coletao trato GI <ol><li> Identificar o estômago, intestino delgado, ceco, cólon e do sistema linfático mesentérico. </li><li> Retire o estômago delicadamente transecting em ambos os lados, em seguida, coloque em um bijou contendo 1,6 ml de PBS estéril usando uma pinça estéril. </li><li> Transecto do cólon no reto. Com cuidado, puxe toda a massa intestinal do cadáver usando uma pinça de dissecação e coloque em uma placa de Petri estéril. Certifique-se de que isso seja feito com cuidado para que a estrutura intestinal e estruturas linfáticas mesentérica não se separam. </li></ol> 9. Separação do trato GI e do sistema linfático mesentérica (Figura 2) <ol><li> Verter 30 ml de PBS estéril para a placa de Petri, assegurar o tracto GI está completamente submerso. </li><li> Identificar a massa central do sistema linfático mesentérica, e beliscar usando uma pinça de dissecação multa. Identifique a parte mais proximal do intestino delgado, e beliscar usando uma pinça de dissecação multa. </li><li> Puxe lentamente o Central massa do sistema linfático mesentérico e do intestino delgado distal em sentidos opostos até que os dois tecidos são completamente separadas umas das outras. Realizar esse processo com cuidado para garantir que o intestino delgado não estão esticados, pois isso impede a recolha de reprodutível proximal, médio e distal. Coloque o sistema linfático mesentérica em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo. </li></ol> 10. Seccionamento do trato GI <ol><li> Transect do tracto GI no ceco para separar o intestino delgado a partir do cólon. </li><li> Inserir o cólon em 300-500 ul de PBS estéril e colocar em gelo. </li><li> Recolha de tecidos representativas de regiões proximais, médio e distal do intestino delgado. Alinhe o intestino delgado a partir do ponto médio. </li><li> Então, (i) recolher os últimos 2 cm do tecido antes do ceco como o intestino delgado distal, (ii) recolher o tecido 5-7 cm acima do ponto médio como o intestino delgado proximal, e(Iii) recolher o tecido 3-5 cm abaixo do ponto médio do intestino delgado como do meio. </li></ol> 11. Coleta do Fígado <ol><li> Identificar os três lóbulos do fígado de rato após a remoção do estômago. </li><li> Puxe lobos longe da cavidade abdominal com a pinça de dissecação multa. </li><li> Retire o fígado, cortando qualquer ligamentos inerentes usando uma tesoura fina. Coloque fígado em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo. </li></ol> 12. Coleta o Baço <ol><li> Identificar o baço. </li><li> Puxar baço de distância a partir do estômago e utilize uma tesoura para cortar finas do ligamento gastroesplênico. </li><li> Coloque baço em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo. </li></ol> 13. Recolha os Rins <ol><li> Identificar os rins que se tornarão visíveis na parte de trás da cavidade abdominal após a remoção do tracto gastrointestinal e de outros órgãos. </li><li> Ureteres corte e quaisquer ligamentos associados ucantar tesouras de dissecação multa e retirar rins usando uma pinça fina. Remover glândulas supra-renais e qualquer material gorduroso (se ainda ligado), usando uma pinça fina e tesouras de dissecação. </li><li> Coloque os dois rins em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo. </li></ol> 14. Coleta o Cérebro <ol><li> Após a decapitação, manter a cabeça na posição vertical usando uma pinça curva. Aperte a pele em cima da cabeça longitudinalmente usando um outro conjunto de pinças curvas, e fazer uma incisão com uma tesoura de dissecção finas. Corte pele restante perto do pescoço, mais uma vez longitudinalmente com tesouras de dissecação multa. </li><li> Retire a pele em uma direção para fora usando uma pinça fina em ambos os lados para revelar o crânio e remover retalhos de pele usando tesouras de dissecação multa. Coloque tesouras de dissecação multa na abertura da coluna vertebral e fazer uma incisão ao longo do crânio em direção à tribuna. </li><li> Puxe as duas seções do crânio em uma direção para fora usando uma pinça fina. Corta para remover segmentos do crânio. </li><li&gt; Retirar cérebro usando uma pinça largos, usando um movimento para cima escavando a partir da abertura da coluna vertebral para a tribuna. Lavar o cérebro em PBS duas vezes para remover todo o sangue do procedimento de decapitação. </li></ol> 15. Processamento de Tecidos e homogeneização <ol><li> Para experiências que requerem a contagem de viabilidade ou de extração de DNA, tecidos lugar em tubos contendo PBS estéril. Imediatamente determinar o número de bactérias viáveis ​​por diluição em série em PBS e plaqueamento em placas de agar MacConkey, ou armazenar a -20 ° C com 20% de glicerol para a curto prazo. Para a extração de DNA, armazenar tecidos a -20 ° C. </li><li> Para as experiências que requerem a extracção de RNA, local tecidos em volumes apropriados da solução RNAlater (10 ul por cada 1 mg de tecido), em seguida, imediatamente armazenar a -20 ° C durante a curto prazo ou a -80 ° C armazenamento a longo prazo. </li><li> Para as experiências de imagiologia, os tecidos que requerem lugar em 10 ml Methacarn (60% de metanol, 30% de clorofórmio e de ácido acético a 10%), em seguida, armazenar umt RT (20 - 25 ° C) durante até 3 semanas. </li><li> Calcule o peso do tecido por comparação do peso dos tubos antes e depois da adição de tecidos. Homogeneizar tecidos utilizando um homogeneizador. Lavar o homogeneizador uma vez em etanol a 70% e duas vezes em PBS estéril entre a homogeneização de cada amostra. NOTA: Methacarn fixação é desejável para a fixação das amostras intestinais, a fim de preservar as estruturas de defesa da mucosa relacionada com mucina; fixação em formalina pode ser utilizado para tecidos sistémicos. </li></ol>

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	<li>Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+meningitis+in+the+newborn:+a+prospective+study+of+mortality+and+morbidity.">Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity.</a> 23 (5), 218-225 (1999).</li><li>Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+diagnosis,+and+antimicrobial+treatment+of+acute+bacterial+meningitis.">Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).</li><li>Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queir&#243;s, F., Nova, C. V., Lucena, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+newborn+bacterial+meningitis+and+sepsis+during+the+pregnancy+period+for+public+health+care+system+participants+in+Salvador,+Bahia,+Brazil.">Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil.</a> J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).</li><li>Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+of+the+newborn:+basic+mechanisms+and+clinical+correlates.">Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).</li><li>Robbins, J. B., et al., Med, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K1+capsular+polysaccharide+associated+with+neonatal+meningitis.">Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis.</a> N. Eng. J. 290 (22), 1216-1220 (1974).</li><li>Korhonen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hemolysin+production,+and+receptor+recognition+of+Escherichia+coli+strains+associated+with+neonatal+sepsis+and+meningitis.">hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis.</a> Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).</li><li>Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysialic+acid+in+the+plasticity+of+the+developing+and+adult+vertebrate+nervous+system.">Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).</li><li>Koedel, U., Pfister, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+experimental+bacterial+meningitis.">Models of experimental bacterial meningitis.</a> Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).</li><li>Tunkel, A. R., Scheld, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+pathophysiology+of+bacterial+meningiits.">Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits.</a> Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+K1+capsule+is+the+critical+determinant+in+the+development+of+Escherichia+coli+meningitis+in+the+rat.">The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat.</a> J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).</li><li>Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+Escherichia+coli+share+common+virulence+factor+profiles,+serotypes+and+phylogeny+with+other+extraintestinal+E.+coli.">Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli.</a> Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).</li><li>Sarff, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Escherichia+coli+K1+in+healthy+and+diseased+newborns.">Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns.</a> Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).</li><li>Schiffer, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+relation+between+invasiveness+and+the+K1+capsular+polysaccharide+of+Escherichia+coli.">A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli.</a> Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).</li><li>Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+infant+intestinal+microbiota.">Development of the human infant intestinal microbiota.</a> PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).</li><li>Nassif, X., Bourdoulous, S., Eug&#232;ne, E., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+extracellular+pathogens+cross+the+blood-brain+barrier.">How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier.</a> Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).</li><li>Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infant+rat+as+a+model+of+bacterial+meningitis.">The infant rat as a model of bacterial meningitis.</a> J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).</li><li>Birchenough, G. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+innate+defenses+in+the+neonatal+gastrointestinal+tract+in+response+to+colonization+by+neuropathogenic+Escherichia+coli.">Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).</li><li>Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensins:+antimicrobial+peptides+of+innate+immunity.">Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).</li><li>Bevins, C. L., Salzman, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells,+antimicrobial+peptides+and+maintenance+of+intestinal+homeostasis.">Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).</li><li>Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+meningitis+in+infant+rats+after+intranasal+inoculation.">Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation.</a> J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).</li><li>Bortolussi, R., Ferrieri, P., Bj&#246;rkst&#233;n, B., Quie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+K1+polysaccharide+of+Escherichia+coli:+relationship+to+virulence+in+newborn+rats+and+resistance+to+phagocytosis.">Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis.</a> Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).</li><li>Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+neonatal+Escherichia+coli+meningitis:+induction+of+bacteremia+and+meningitis+in+infant+rats+fed+E.+coli+K1.">Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1.</a> Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).</li><li>Pluschke, G., Mercer, A., Kuse&#263;ek, B., Pohl, A., Achtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+bacteremia+in+newborn+rats+by+Escherichia+coli+K1+is+correlated+with+only+certain+O+(lipopolysaccharide)+antigen+types.">Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types.</a> Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+capsule-selective+endosialidase+E+minimizes+changes+in+organ+gene+expression+induced+by+experimental+systemic+infection+with+Escherichia+coli+K1.">Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1.</a> Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+polysialyl+capsule+during+blood-to-brain+transit+of+neuropathogenic+Escherichia+coli+K1.">Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1.</a> Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).</li><li>Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+cure+of+systemic+Escherichia+coli+K1+infection+by+modification+of+the+bacterial+phenotype.">Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).</li><li>Achtman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+widespread+bacterial+clones+among+Escherichia+coli+K1+isolates.">Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates.</a> Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).</li><li>Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+Escherichia+coli.+infection+with+recombinant+bacteriophage-derived+capsule+depolymerase.">Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).</li><li>Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+bacteriophages+specific+for+the+K1+polysaccharide+antigen+of+Escherichia+coli.">Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O modelo animal aqui descrito baseia-se em trabalho anterior que teve como objetivo reproduzir as principais características de infecções que ocorrem naturalmente no organismo humano. Ratos recém-nascidos foram inicialmente utilizados para estudar a meningite infantil por H. influenzae tipo b, como a espécie satisfeito os critérios-chave para um modelo robusto de infecção. Assim, o portal de entrada do agente patogénico deve reflectir a da infecção humana natural e de forma reprodutível dar origem a patologia semelhante a duração suficiente para permitir a intervenção terapêutica. As técnicas utilizadas não deve limitar a aplicabilidade do procedimento e não deve contribuir para a evolução da doença 20. O modelo de H. influenzae meningite em ratos infantis desenvolvidos por Moxon e seus colegas satisfaz estes critérios 20; a infecção natural ocorre após a colonização das membranas mucosas do tracto respiratório superior e esta característica importante foi replicado nas crias de rato por não-traumainstilação tic das bactérias sobre as membranas das passagens nasais. É importante ressaltar que a natureza dependente da idade da infecção foi replicada no modelo. O mesmo grupo também foram os primeiros a desenvolver um modelo não-invasivo de E. coli K1 NBM no rato neonatal 22. Isentos de agentes patogénicos filhotes Sprague-Dawley foram colonizados pela alimentação 10 agosto - 10 outubro bactérias através de um tubo gástrico oral; o inoculo era, portanto, consideravelmente maior do que a empregue por nós. Colonização com as três cepas K1 examinados, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) e LH (O75: K1: H3), ocorreu em uma proporção relativamente alta (48-74%) de animais K1-alimentados, mas a incidência de bacteremia, meningite e mortalidade foram variáveis ​​e significativamente menor do que as taxas de colonização. A natureza clonal da E. coli K1 infecção experimental foi estabelecido posteriormente 23 e é agora evidente que somente O18: K1 e, em menor grau, O7: K1 serotipos são capazespara causar consistentemente infecção sistémica. Por esta razão, estas investigações da patogênese da neuropatogénico E. coli K1 foram baseados na utilização do O18-enhanced virulência: K1 estirpe A192PP. Uma comparação dos E. coli K1 alimentação de ratos recém-nascidos por meio de uma sonda gástrica, usada por Glode e colegas 22, e um método de alimentação de gotículas como empregada pelo grupo de Achtman 23 reveladas número excessivo de mortes utilizando o método antigo, quase certamente devido aos danos a superfícies mucosas pelo tubo gástrico. Como as taxas de colonização são comparáveis ​​com estes dois métodos, recomenda-se usar o método menos invasivo de alimentar as bactérias usando uma pipeta esterilizada com uma ponta, tal como descrito na presente comunicação. E. coli A192PP utilizado em nossos estudos é O18: K1. É um derivado mais virulenta da estirpe de E. clínica coli A192 que foi originalmente recuperados a partir de um paciente com septicemia 27 </sup&gt;. O aumento da virulência da cepa foi obtida pela passagem de série através de ratos recém-nascidos 26. A tensão provoca uma severidade da doença idade-dependente, com 100% de bacteremia e mortalidade quando administrado a dois dias de idade os animais 28. Em contraste, 9 dias de idade os animais são completamente resistentes à doença. -K1 específica de bacteriófago lítico pode ser utilizado para diferenciar E. coli K1 de E. outra coli 29. Neste estudo, a sensibilidade das bactérias viáveis ​​para K1E bacteriófago deve ser utilizado para (i) verificar a pureza da E. As suspensões coli K1 preparado para ser alimentado para os animais, e (ii) para diferenciar E. coli K1 de outros coliformes, a fim de calcular a viabilidade em esfregaços perianais, sangue e amostras de tecidos. Se a colônia é E. coli K1, será susceptível a lise bacteriófago K1E, e crescimento bacteriano será inibida no local da inoculação bacteriófago. Se a colônia não é E. coli K1, que vai bresistentes à lise KIE bacteriófago e, e não deve haver uma área de crescimento de bactérias no local da inoculação bacteriófago. Deve-se ter em mente que os modelos animais não pode refletir todas as características da doença que ocorre naturalmente. O modelo actual pode ser modificado para examinar as características de virulência de outras bactérias do que E. neuropatogênicos coli A192PP e variações no tamanho do inoculo colonizar podem ser acomodados. Futuras aplicações da técnica poderia incluir a avaliação de medicamentos tão necessários para tratar a doença e para descobrir detalhes da resposta do hospedeiro à colonização e invasão dos tecidos. O método descrito aqui é simples, mas eficaz. Ninhadas individuais de 10 - 12 crias foram empregados como grupos de teste ou de controlo e esta abordagem dentro-maca garante um elevado grau de reprodutibilidade e validade estatística. É imperativo que os filhotes são devolvidos às suas mães naturais o mais rapidamente possível após qualquer procedure ninhadas e não deve, portanto, compreendem animais submetidos a diferentes intervenções. É importante que o inoculo alimentados ser aquecida de outro modo os filhotes irão rejeitar a cultura oferecido. Os filhotes rapidamente desenvolver uma microbiota complexa e dentro de dois dias após o nascimento do trato gastrointestinal é colonizado com uma vasta gama de bactérias do filo estabelecido como os micróbios mais abundantes no intestino infantil e adulto. Os filhotes que não foram alimentados com E. coli A192PP não carregam E. coli K1 no tracto GI 17 e assim a determinação das taxas de colonização é relativamente simples. No entanto, o método NEUS baseados qPCR para a detecção de colonizar E. coli K1 é muito mais sensível que os métodos tradicionais de cultivo e é fortemente recomendado 17.

Infecções bacterianas sistémicas são uma grande ameaça para o bem-estar ea sobrevivência do recém-nascido; prematuros são particularmente vulneráveis. Meningite bacteriana neonatal (NBM), freqüentemente associada a sepse bacteriana, continua a ser uma fonte significativa de mortalidade e morbidade durante as primeiras semanas de vida e que o problema é agravado pela contínua evolução da resistência a drogas antibacterianas linha de frente 1,2. Um caso de NBM é uma emergência médica que carrega um fardo médico, social e económico elevado 3; conseqüentemente, há uma necessidade urgente de novas terapêuticas e, sobretudo, novas estratégias profiláticas para reduzir a carga da infecção. Algumas características de NBM são incomuns: no mundo desenvolvido, Escherichia coli e estreptococos do Grupo B são responsáveis ​​pela grande maioria dos casos e a capacidade destas estirpes para provocar NBM está quase sempre associada com a presença de um polissacarídeo de protecção cApsule que permite que o agente patogénico para fugir reconhecimento imunológico processa 4. Uma proporção muito elevada (80-85%) de E. neuroinvasive coli expressar a cápsula K1 5,6, um polímero de ácido polissiálico α-2,8-ligadas que é estruturalmente idêntico ao acolher moduladores da plasticidade neuronal 7. A avaliação de novas terapêuticas e profiláticas para NBM e bacteremia e septicemia associada beneficiariam claramente de um modelo animal robusto de infecção que imita as principais características da doença no recém-nascido humano, em particular o forte de dependência da idade e da via natural de infecção . Uma vasta gama de modelos para a meningite bacteriana Gram-positivas e Gram-negativas estão disponíveis 8,9 e estes têm alargado consideravelmente o nosso conhecimento das opções de patogénese, a patofisiologia e tratamento dessas infecções. Assim, as infecções experimentais em ratos, ratinhos, coelhos e macacos foram usadas para estudar a meningite em ambos os neonate e do adulto. No entanto, muitos destes modelos empregam injecção directa intracisternal ou subcutânea de bactérias para a iniciação da infecção, criando uma patogénese artificial, ignorando os processos naturais de difusão a partir do local de colonização. Em alguns casos, estes métodos de inoculação conduziu a alterações significativas na patologia; por exemplo, a administração subcutânea de E. estirpes de E. coli K1 revogada a dependência da idade associada com a infecção natural, produzindo bacteremia e invasão do sistema nervoso central (SNC) em ambos os recém-nascidos e adultos 10. Predisposição a E. coli NBM é criticamente dependente da transmissão vertical do agente causador da mãe para o bebê no momento ou logo após o nascimento 11. Maternalmente-derivado E. bactérias coli K1 colonizar o gastrointestinal neonatal (GI) 13/11, que é estéril ao nascimento, mas rapidamente adquire uma microbiota complexa 14. Em recém-nascidos colonizados, E. coliK1 bactérias têm a capacidade de translocar a partir do lúmen intestinal para a circulação sistémica antes de entrar no SNC através do sangue ou cérebro-cefalorraquidiano de sangue barreiras de fluido 9,15. O design de modelos robustos de infecção experimental deve levar esses detalhes em conta. Embora os ratos têm sido amplamente utilizados para o estudo de algumas formas de meningite bacteriana 8, eles não são adequados para estudos de infecção neonatal: eles são esmagados por uma infecção sistémica e não mostram a forte dependência da característica idade de 16 bebés humanos. Além disso, α-defensinas, péptidos-chave do tracto GI, proporcionando protecção contra a invasão por E. sistémica coli K1 17, são altamente expresso em células de Paneth e neutrófilos nos seres humanos e de ratos, mas não em ratos 18. Há um notável grau de duplicação, redundância e heterogeneidade no rato defensin e genes relacionados cryptidin não encontrada em outro umanimais produtores 19. O rato neonatal foi inicialmente usado por Moxon e colegas de trabalho de 20 para investigar a patogênese da meningite por Haemophilus influenzae após inoculação intranasal, replicando o local natural da colonização deste patógeno neonatal no ser humano, e posteriormente adaptado para a idade-dependente E. coli K1 bacteremia e meningite. Bortolussi et al. 21 empregada injeção intraperitoneal do inóculo bacteriano para iniciar a infecção, mas o estudo fundamental de Glode e colaboradores 22 utilizaram alimentação gástrica por via oral para paralela a via natural de infecção após colonização GI. Como o tubo gástrico pode danificar superfícies mucosas, o procedimento foi aperfeiçoada para incluir a alimentação do inóculo para os recém-nascidos 23. Aqui, o método de colonização e procedimentos para a detecção da infecção em filhotes de ratos suscetíveis são descritos trato GI; adicionalmente, são discutidas aplicações terapêuticas e preventivas do modelo.

<table><tbody><tr><td>Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)</td><td><a href="http://www.harlan.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Harlan, UK</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli K1 A192PP</td><td><a href="http://www.ucl.ac.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Taylor lab</a></td><td></td><td>Mushtaq &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2004</td></tr><tr><td>Bacteriophage K1E</td><td><a href="http://www.ucl.ac.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Taylor lab</a></td><td></td><td>Mushtaq &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2004</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton Agar</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Oxoid, UK</a></td><td>CM0037</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton Broth</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Oxoid, UK</a></td><td>CM0405</td><td></td></tr><tr><td>MacConkey Agar</td><td><a href="http://www.oxoid.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Oxoid, UK</a></td><td>CM0007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Salt</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>84020</td><td>Prepare 20 - 50 units/ml</td></tr><tr><td>RNAlater Solution</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>R0901</td><td>10 &amp;mu;l/mg tissue</td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped swabs</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>11542483</td><td></td></tr><tr><td>Alcotip Swabs</td><td><a href="http://www.scientificlabs.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Scientific Laboratory Supplies, UK</a></td><td>SWA1000</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Sigma, UK</a></td><td>P5856</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Universal Tube</td><td><a href="http://www.alphalabs.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> AlphaLaboratories, UK</a></td><td>CW3890</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml microcentrifuge tubes</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>I1405-1500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &amp;mu;l calibrated loops</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>E1412-0112</td><td></td></tr><tr><td>L-shaped spreaders</td><td><a href="http://www.starlab.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> StarLab, UK</a></td><td>E1412-1005</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>10594175</td><td></td></tr><tr><td>Forceps straight with fine points</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12780036</td><td></td></tr><tr><td>Forceps straight with blunt tips</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12391369</td><td></td></tr><tr><td>Forceps watchmaker&#039;s curved with very fine points</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12740926</td><td></td></tr><tr><td>Scissors straight with very fine points</td><td><a href="http://www.fisher.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Fisher Scientific, UK</a></td><td>12972055</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Scissors</td><td><a href="http://www.vwr.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> VWR, UK</a></td><td>USBE4251</td><td></td></tr><tr><td>25 G Syringe Needles</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Greiner Bio-One Ltd</a></td><td>N2525</td><td></td></tr><tr><td>LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers</td><td><a href="http://www.perkinelmer.co.uk" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> PerkinElmer, UK</a></td><td>L60000BB</td><td></td></tr><tr><td>Unitemp Incubator</td><td>B&amp;amp;T, UK</td><td>OP958</td><td></td></tr><tr><td>Multitron shaking incubator</td><td><a href="http://www.infors-ht.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> INFORS HT, UK</a></td><td>AJ118</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Turrax T-10 homogenizer</td><td><a href="http://www.ika.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> IKA Werke</a></td><td>0003737000</td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat

A investigação das interações entre hospedeiro animal e patógeno bacteriano só faz sentido se o modelo de infecção empregada replica as principais características da infecção natural. Este protocolo descreve os procedimentos de elaboração e avaliação de infecção sistêmica devido a neuropatogénico K1 Escherichia coli no rato neonatal. A colonização do tracto gastrointestinal leva à difusão do agente patogénico ao longo do curso da linfa-intestino-sangue-cérebro de infecção e o modelo exibe forte dependência da idade. A cepa de E. coli O18: K1 com maior virulência para o rato neonatal produz excepcionalmente altas taxas de colonização, a translocação para o compartimento de sangue e invasão das meninges após o trânsito através do plexo coróide. Tal como no hospedeiro humano, a penetração do sistema nervoso central é acompanhada por uma inflamação local e um resultado invariavelmente letal. O modelo de utilidade é comprovada por estudos do mecanismoda patogênese, para a avaliação de intervenções terapêuticas e para avaliar a virulência bacteriana.

A E. coli K1 modelo de infecção sistémica descrito aqui replica muitas das características da infecção natural em seres humanos. As bactérias são ingeridos, colonizar o tracto GI, se translocam para o compartimento do sangue através dos nódulos linfáticos mesentéricos antes de estabelecer a doença específica do órgão associada à inflamação do cérebro 24. É importante ressaltar que o modelo apresenta forte dependência dos idosos; como mostrado na Figura 3, de dois dias de idade (P2) crias de ratos são altamente susceptíveis à doença invasiva, mas ao longo de um período de sete dias, os animais tornam-se progressivamente mais refractários à infecção, mas não para a colonização do tracto GI 17. Depois de trânsito a partir do local de colonização GI para o compartimento do sangue, as bactérias podem ser visualizados em amostras de sangue por microscopia de fluorescência (Figura 4) antes de entrar no SNC predominantemente no plexo coróide 25. Em alguns animais, existe extensa invasão de outros órgãos importantes, tais comopulmão, baço e rins 25. Os números bacterianos em tecidos pode variar entre substancialmente 25 crias individuais, mas quando a carga microbiana é pontuado como presente ou ausente existe um elevado grau de reprodutibilidade em relação à invasão de órgãos. Com uma ninhada de 12 filhotes de cachorro como um único grupo de teste, cálculos de potência, usando G * Power Software determinou que este tamanho de amostra equivale a uma probabilidade de 98,6% de encontrar um efeito baseado na sobrevivência utilizando seis animais da coorte e&gt; 99% de probabilidade, se tudo doze são levados em consideração. O modelo é, portanto, adequado para a avaliação de novos agentes, concebidas especificamente para o tratamento de infecções bacterianas neonatais e foi usado no procedimento para avaliar o potencial terapêutico da cápsula depolimerase EndoE que remove selectivamente a cápsula K1 a partir da superfície bacteriana 24-26. Ele também pode ser usado para investigar interacções hospedeiro-bactérias que têm impacto sobre o pathogenesis de E. neuropathogens coli; dentro deste contexto, tem sido utilizada para estudos de E. colonização coli A192PP e divulgação. Foi demonstrado que a E. coli A192PP persistem no tracto GI de P2, P5 e P9 filhotes em grande número; aspectos temporais da colonização nestes três grupos foram muito semelhantes (Figura 5) e reflecte a capacidade das bactérias para replicar e manter a densidade de população no intestino. A virulência do isolado clínico A192 foi melhorada por passagem em série em ratos recém-nascidos, a fim de assegurar pouca ou nenhuma redundância do uso de animais. E. coli A192 colonizado ratos neonatais P2 com 100% de eficiência, provocada bacteremia em 35% dos animais e produziram um efeito letal em 25% 27. O A192PP derivado passadas coloniza o trato gastrointestinal, produz bacteremia e provoca letalidade em todas as crias P2. Assim, o modelo pode ser utilizado para investigar a virulência de different K1 estirpes no que diz respeito à sua capacidade de invadir o sistema nervoso central e outros sistemas de órgãos a partir do local de colonização. Neste contexto, Pluschke e co-trabalhadores 23 utilizado um modelo de infecção de rato neonatal para determinar a capacidade de 95 E. coli K1 cepas de origem humana para causar bacteremia após a colonização do intestino; eles observaram grandes variações na eficiência de ambos colonização e capacidade invasiva, sustentando a natureza clonal de E. coli K1 neuropathogens. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Materiais para coleta de tecido: (A) balança, (B) tubos pré-pesados ​​contendo mídia necessárias, (C) operação de mesa, régua e agulhas de definir o animal, (D) 70% (v / v) etanol e PBS para esterilizar o equipamento de recolha de tecidos, <strong&gt; (E) kit de recolha de tecido incluindo uma grande par de tesouras para a decapitação e tesouras e pinças e lâminas de vários tamanhos e formas, (F) de gelo para preservar os tecidos, (G) 70% (v / v) de etanol para esterilizar mesa de operação e circunda. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="A Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Separação do trato GI e sistema linfático mesentérico. (A) Segure a massa central do sistema linfático mesentérica com uma pinça de dissecação multa. (B) Segure a parte proximal do intestino delgado, e puxar em direções opostas. (C) O trato gastrointestinal e sistema linfático mesentérica será totalmente separate. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="A Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Sobrevivência de filhotes de ratos recém-nascidos com idade a partir de dois dias (P2) a nove dias (P9), após a administração oral de E. coli A192PP, ilustrando a forte dependência idade de infecção sistêmica. Cada grupo representa 24 recém-nascidos. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. As imagens de fluorescência de E. coli em células A192PP um esfregaço de sangue a partir de um cachorro P2 infectada, após a administração oral de bactérias. O antigénio de lipopolissacárido ó na superfície bacteriana foi rained elevação com anticorpo policlonal de coelho anti-O18 e segundo anticorpo conjugado Alexa546 de cabra anti-coelho. A cápsula K1 foi visualizado com reagente EndoE-GFP. Virtualmente todas as bactérias detectados em amostras de sangue exibida a cápsula de protecção K1. As imagens foram capturadas pelo Dr. Andrea Zelmer. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="A Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. E. coli A192PP colonização intestinal a seguir à administração do inoculo bacteriano. O DNA foi extraído a partir de todo intestino e E. unidades formadoras de colónias / g (CFU / g) de tecido coli K1 determinado pela reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) gene alvo polysialyltransferase (NEUS) tal como descrito noutro local 17 </sup&gt;. LOD: limite de detecção. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Característica </td><td> Saudável </td><td> Insalubre </td></tr><tr><td> Cor da pele </td><td> Rosa </td><td> Pálido / Amarelo </td></tr><tr><td> Agilidade (reflexo de endireitamento) </td><td> Pup reverte imediatamente em colocação para trás </td><td> Dificuldade em reverter colocação para trás (&gt; 3 seg) ou não pode alcançar </td></tr><tr><td> Uma leve pressão no abdômen </td><td> Não há som </td><td> Som da agitação </td></tr><tr><td> Estômago line / leite </td><td> Visível e branco </td><td> Não visível </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> Quente </td><td> Relativamente frio * </td></tr><tr><td> Peso </td><td> Ganho de 1,5-2 g por dia </td><td> Nenhum ganho ou perda de peso </td></tr><tr><td> Comportamento quando colocado na gaiola </td><td> Move-se para a mãe e começa feeding </td><td> Não é possível mover em direção a mãe e mostra dificuldade para se alimentar </td></tr></tbody></table> Tabela 1. sete pontos sistema de pontuação: As três primeiras contagens listados são geralmente os primeiros sinais observados. * Recém-nascidos com infecção sistêmica experiência temperatura corporal elevada (&gt; 2 ° C). No entanto, devido à falta de agilidade dos animais para chegar a sua mãe para manter a temperatura corporal, os animais não saudáveis ​​pode separar-se da maca e sentir frio à mão nua.

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Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Aqui, é descrito um procedimento para o estabelecimento de uma infecção sistémica no rato neonatal com culturas de Escherichia coli K1. Este procedimento não-invasivo permite a colonização do tracto gastrointestinal, a translocação do agente patogénico para a circulação sistémica, e invasão do sistema nervoso central no plexo coróide.

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infecção no Rato Neonatal

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

non-invasive-model-neuropathogenic-escherichia-coli-infection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

10.9K visualizações.  University College London.  Aqui, é descrito um procedimento para o estabelecimento de uma infecção sistémica no rato neonatal com culturas de Escherichia coli K1. Este procedimento não-invasivo permite a colonização do tracto gastrointestinal, a translocação do agente patogénico para a circulação sistémica, e invasão do sistema nervoso central no plexo coróide. 

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The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe and permanent neuropsychological sequelae, including mental retardation, cerebral palsy, and epilepsy. The outcomes of HIE are devastating and permanent, making it critical to identify and develop therapeutic strategies to reduce brain injury in newborns with HIE. To that end, the neonatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury has been developed to model this human condition. The HIE model was first validated by Vannucci et al 1 and has since been extensively used to identify mechanisms of brain injury resulting from perinatal hypoxia-ischemia 2 and to test potential therapeutic interventions 3,4. The HIE model is a two step process and involves the ligation of the left common carotid artery followed by exposure to a hypoxic environment. Cerebral blood flow (CBF) in the hemisphere ipsilateral to the ligated carotid artery does not decrease because of the collateral blood flow via the circle of Willis; however with lower oxygen tension, the CBF in the ipsilateral hemisphere decreases significantly and results in unilateral ischemic injury. The use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to stain and identify ischemic brain tissue was originally developed for adult models of rodent cerebral ischemia 5, and is used to evaluate the extent of cerebral infarctin at early time points up to 72 hours after the ischemic event 6. In this video, we demonstrate the hypoxic-ischemic injury model in postnatal rat brain and the evaluation of the infarct size using TTC staining.

The postnatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury is a well-established model of human neonatal hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). In this article, we describe the model of HIE in post-natal rat pups.

O Modelo de encefalopatia hipóxico isquêmica Perinatal da Isquemia

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe ...

Biologia

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

O<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Imunologia e Infecção

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

Medicina

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Injecção Intrarenal de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Em um modelo de rato de peleonefrite

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal ...

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human intestinal epithelium, leading to increased intestinal permeability, impaired restitution, and increased cell death. Although there are numerous animal models of NEC, response to injury and therapeutic interventions may be highly variable between species. Furthermore, it is ethically challenging to study disease pathophysiology or novel therapeutic agents directly in human subjects, especially children. Therefore, it is highly desirable to develop a novel model of NEC using human tissue. Enteroids are 3-dimensional organoids derived from intestinal epithelial cells. They are ideal for the study of complex physiologic interactions, cell signaling, and host-pathogen defense. In this manuscript we describe a protocol that cultures human enteroids after isolating intestinal stem cells from patients undergoing bowel resection. The crypt cells are cultured in media containing growth factors that encourage differentiation into the various cell types native of the human intestinal epithelium. These cells are grown in a synthetic, collagenous mix of proteins that serve as a scaffold, mimicking the extra-cellular basement membrane. As a result, enteroids develop apical-basolateral polarity. Co-administration of lipopolysaccharide (LPS) in media causes an inflammatory response in the enteroids, leading to histologic, genetic, and protein expression alterations similar to those seen in human NEC. An experimental model of NEC using human tissue may provide a more accurate platform for drug and treatment testing prior to human trials, as we strive to identify a cure for this disease.

Enteroids are emerging as a novel model in the study of human disease. The protocol describes how to simulate an enteroid model of human necrotizing enterocolitis using lipopolysaccharide (LPS) treatment of enteroids generated from neonatal tissue. Collected enteroids demonstrate inflammatory changes akin to those seen in human necrotizing enterocolitis.

Um novo modelo Enteroid epitelial humana de enterocolite necrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a protocol for studying the pathogenesis of E. coli O1:K1:H7, a serotype responsible for high mortality rates in neonates. Our method utilizes intravital imaging of neonatal pups at different time points during the progression of infection. This imaging, paralleled by measurement of bacteria in the blood, inflammatory profiling, and tissue histopathology, signifies a rigorous approach to understanding infection dynamics during sepsis. In the current report, we model two infectious inoculums for comparison of bacterial burdens and severity of disease. We find that subscapular infection leads to disseminated infection by 10 h post-infection. By 24 h, infection of luminescent E. coli was abundant in the blood, lungs, and other peripheral tissues. Expression of inflammatory cytokines in the lungs is significant at 24 h, and this is followed by cellular infiltration and evidence of tissue damage that increases with infectious dose. Intravital imaging does have some limitations. This includes a luminescent signal threshold and some complications that can arise with neonates during anesthesia. Despite some limitations, we find that our infection model offers an insight for understanding longitudinal infection dynamics during neonatal murine sepsis, that has not been thoroughly examined to date. We expect this model can also be adapted to study other critical bacterial infections during early life.

Infection of neonatal mice with bioluminescent E. coli O1:K1:H7 results in a septic infection with significant pulmonary inflammation and lung pathology. Here, we describe procedures to model and further study neonatal sepsis using longitudinal intravital imaging in parallel with enumeration of systemic bacterial burdens, inflammatory profiling, and lung histopathology.

Um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Assessment of Intestinal Transcytosis of Neonatal Escherichia coli Bacteremia Isolates

Newborns ingest maternal E. coli strains that colonize their intestinal tract around the time of delivery. E. coli strains with the ability to translocate across the gut invade the newborn's bloodstream, causing life-threatening bacteremia. The methodology presented here utilizes polarized intestinal epithelial cells grown on semipermeable inserts to assess the transcytosis of neonatal E. coli bacteremia isolates in vitro. This method uses the established T84 intestinal cell line that has the ability to grow to confluence and form tight junctions and desmosomes. After reaching confluence, mature T84 monolayers develop transepithelial resistance (TEER), which can be quantified using a voltmeter. The TEER values are inversely correlated with the paracellular permeability of extracellular components, including bacteria, across the intestinal monolayer. The transcellular passage of bacteria (transcytosis), on the other hand, does not necessarily alter the TEER measurements. In this model, bacterial passage across the intestinal monolayer is quantified for up to 6 h post-infection, and repeated measurements of TEER are made to monitor the paracellular permeability. In addition, this method facilitates the use of techniques such as immunostaining to study the structural changes in tight junctions and other cell-to-cell adhesion proteins during bacterial transcytosis across the polarized epithelium. The use of this model contributes to the characterization of the mechanisms by which neonatal E. coli transcytose across the intestinal epithelium to produce bacteremia.

Assessment of Intestinal Transcytosis of Neonatal Escherichia coli Bacteremia Isolates

Escherichia coli&#160;causes sepsis in neonates who ingest the bacteria around the time of birth. The process involved in&#160;E. coli&#8217;s&#160;ability to travel from the enteric tract to the bloodstream is poorly understood. This&#160;in vitro&#160;model assesses the ability of&#160;E. coli&#160;strains to travel through the intestinal epithelial cells.

Avaliação da Transcitose Intestinal de Isolados de Bacteremia de Escherichia coli Neonatal

Newborns ingest maternal E. coli strains that colonize their intestinal tract around the time of delivery. E. coli strains with the ability to translocate ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Um modelo de rato BALB/c neonatal de Enterocolite Necrotizante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...

Early Pathological and Magnetic Resonance Detection of Cerebral Injury Using a Rat Model of Neonatal Hypoxic Ischemic Encephalopathy

Perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is an acute disease that may afflict newborns, resulting in variable long- and short-term neurodevelopmental outcomes. Early diagnosis is critical to identifying infants who may benefit from intervention; however, early diagnosis relies heavily on clinical criteria. No molecular or radiological tests have shown promise in detecting early cerebral injury. Studies have shown that magnetic resonance imaging (MRI) can show changes in both blood flow/ischemia and metabolic disruption. However, they have all been used to evaluate the secondary phase of the disease (&gt;12 h) after the onset of the injury. Early diagnosis is critical to rapidly starting therapeutic hypothermia in eligible infants, which is currently recommended to be initiated within 6 h of birth. The rat model of hypoxic-ischemic injury was developed in 1981 and has been validated and used extensively to study changes in brain perfusion, cerebral injury markers, and morphology. However, it has primarily been used as a "late model", evaluating injury several days after the initial ischemic insult. The model has been known to have poor sensitivity in evaluating reliable and reproducible early cerebral changes. The objective of this study was to develop a reliable model to study early gross morphological and radiological markers of HIE using pathological staining and cerebral magnetic resonance imaging/magnetic resonance spectroscopy.

The present protocol describes a rodent model of newborn hypoxic-ischemic injury for identifying early changes in cerebral tissue by gross morphology and magnetic resonance imaging. This has benefits over existing models, which can be used to study late injury but do not allow the evaluation of reproducible early changes.

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos

Resumo

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