强之方在慢性约束应激诱导的抑郁大鼠模型中的抗抑郁机制的网络药理学和验证

本研究评价了强之方在慢性约束应激诱导的抑郁大鼠模型中的抗抑郁疗效，并通过网络药理学和分子对接分析阐明其对 HIF-1 和 JAK-STAT 通路的调节作用。

抑郁症是一种复杂的精神疾病，会带来重大的治疗挑战。强之坊 （QZF） 是一种用于中药的化合物，在治疗抑郁症方面显示出潜在的临床疗效。然而，QZF 的作用机制和活性成分尚未完全阐明。本研究的主要目的是通过将网络药理学预测与实验验证相结合，阐明 QZF 缓解抑郁症的有效活性成分和潜在分子机制。

采用慢性约束应激 （CRS） 大鼠模型，进行旷场试验 （OFT） 、蔗糖偏好试验 （SPT） 和强迫游泳试验 （FST） 等行为测试，评价 QZF 对抑郁症的治疗效果。在行为参数方面，与模型组相比，QZF 组表现出显著更高的体重、蔗糖偏好比和中央区停留时间 （P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01），并且在 强迫游泳测试中固定时间显着减少 （P < 0.001）。 网络药理学和分子对接研究表明，QZF 可能通过调节 HIF-1 和 JAK-STAT 通路具有抗抑郁作用，关键靶基因包括 AKT1、IL-6、MTOR 和 TP53，与炎症、神经保护和细胞凋亡有关。综上所述，本研究为中药化合物的现代化和开发提供了新的见解，用于抑郁症的综合治疗。

抑郁症是一项普遍的全球健康挑战，其特征是持续的情绪低落、兴趣和愉悦感降低以及认知和神经功能障碍¹。据世界卫生组织报告，抑郁症影响了全球约 3.8 亿人，预计这一数字将增加²。抑郁症作为一种复杂的、多因素的精神障碍，会影响患者的生活质量，并给社会带来相当大的经济和医疗负担，其特点是发病率、复发率和残疾率高³。

抑郁症的病因很复杂，确切的机制尚未完全清楚。随着该领域研究的进展，神经炎症、氧化应激和细胞凋亡等因素引起了广泛关注。研究表明，与健康个体相比，抑郁症患者的促炎细胞因子（如 TNF 和白细胞介素-1β）水平升高，并且在患有炎症的患者中观察到抑郁症的患病率更高⁴。在氧化应激中，活性氧 （ROS） 在有害刺激下过度产生，压倒了身体的抗氧化防御，导致氧化和抗氧化系统之间的不平衡，从而导致组织损伤。抑郁症中氧化应激升高会增强脂质过氧化并加剧对细胞基因和蛋白质的损伤，影响神经元功能并导致神经元变性、细胞凋亡和可塑性受损⁵。此外，在抑郁症患者的临床表现、生化标志物和大脑结构中观察到的改变与细胞凋亡有关。影像学研究显示，抑郁症患者的海马体积减少和萎缩，神经元凋亡可能在这些变化中起关键作用⁶。

目前，药物治疗是控制抑郁症的主要方法，选择性血清素再摄取抑制剂 （SSRIs） 和去甲肾上腺素再摄取抑制剂 （NRI） 在临床实践中经常使用⁷。然而，这些药物伴随着明显的不良反应。除了头痛和失眠等中枢神经系统症状外，大多数抗抑郁药还经常出现胃肠道副作用，包括恶心和腹泻 ^8,9。一些抗抑郁药还会导致性功能障碍¹⁰，这会严重影响治疗结果并降低抑郁症患者的服药依从性¹¹。此外，这些药物对某些患者的疗效有限。最近的代谢组学研究表明，肠道微生物群的个体差异可能会影响药物疗效¹²。因此，开发更安全、更有效的治疗方法仍然是抑郁症研究的重点。

中医 （TCM） 制剂在治疗抑郁症方面显示出巨大的潜力，这归因于它们涉及多种成分、靶点和途径的协同作用¹³。中医认为，旺盛的阳气对于维持身体的活力至关重要。因此，丁元青教授利用中医诊疗的独特原理和丰富的临床经验，提出“养煜神推”是抑郁症的基本发病机制。基于这个概念，他开发了强之方 （QZF） 来专门解决这种发病机制¹⁴。QZF 治疗抑郁症的临床应用已显示出显著疗效，总有效率为 71.43%¹⁵。QZF由多种传统中药材组成，包括 桂 植（桂植，GZ）、 多叶 （元植，YZ）、 高山芍 （宜植任，YZR）、 芍药 （白韶，BS）、 贝母 （川北目，CBM）、 人参 （任参，RS）、 红景天 （红景天，HJT）和 甘草 （甘草，GC）（补充文件 1).研究表明， Polygala tenuifolia 富含皂苷并表现出神经保护作用¹⁶。同样， Ramulus Cinnamomi-Paeonia lactiflora 草本对在缓解疼痛和抑郁方面显示出潜在的功效¹⁷。此外，人参的总皂苷可以降低大鼠的海马促炎细胞因子水平，改善抑郁行为，并减轻海马神经损伤¹⁸。甘草主要含有三萜类化合物和黄酮类化合物。甘草的总类黄酮 （LF） 可以通过改善抑郁行为、调节 BDNF/TrkB 信号通路和增强突触可塑性来发挥抗抑郁作用¹⁹。然而，QZF 抗抑郁作用的具体机制仍不清楚，从而限制了其广泛应用。

因此，本研究旨在建立 CRS 抑郁大鼠模型，通过行为实验证明 QZF 对大鼠抑郁的治疗效果，并利用网络药理学和分子对接技术系统评价 QZF 的抗抑郁机制²⁰。通过明确 QZF 的活性成分和潜在靶点，可以准确定位抑郁症的核心靶点。我们相信，通过深入探索 QZF 的作用机制，不仅可以为抑郁症患者提供更安全、更有效的治疗选择，还可以为中医治疗抑郁症的应用提供科学依据。

所有实验方案均经山东中医药大学动物实验伦理委员会批准（批准文号：YYLW2023000327），并符合美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》。在这个实验中，我们使用了 40 只健康的雄性 Wistar 大鼠，SPF 级，平均体重为 （140 ± 10） g（图 1）。有关本协议中使用的所有材料、设备和软件的列表，请参阅 材料表 。

1. 大鼠抑郁模型

1. 动物饲养和分组
   1. 进入动物的繁殖室，用尾巴标记仪给它们编号。
   2. 将大鼠单独关在笼子中，保持 21 ± 2 °C 的温度和 12 小时/12 小时的光照/黑暗循环。
   3. 让大鼠在实验室中适应 7 天 ，随意获取 食物和水，同时每天处理它们以适应。
   4. 驯化期后，测量体重，并进行蔗糖偏好试验 （SPT） 和旷场试验 （OFT）。
   5. 根据实验数据，将大鼠分为四组，确保每组由 10 只大鼠组成：对照 （CON） 组、模型 （CRS） 组、QZF 组和氟西汀 （F） 组。
2. 慢性约束应激 （CRS） 大鼠模型的建立
   1. 构建老鼠约束装置。选择直径和长度适合大鼠²¹ 号的透明塑料管，让大鼠在防止逃跑的同时，在里面站立和转动。使用电烙铁打孔机在塑料管的侧面和盖子上打孔，以确保空气流通。
   2. 每天胃内给药后 1 小时，轻轻地将大鼠放入约束装置（C 组大鼠除外）中，确保它们处于舒适的位置。
   3. 在约束期内剥夺所有大鼠群体的食物和水。约束期结束后，统一为他们提供充足的食物和水。将每日约束持续时间固定在 6 小时（从 9：30 到 15：30）并连续维持 28 天。

2. 药物干预

1. 通过管饲法给药：1 mL 溶液/100 g 体重、氟西汀（2.7 mg·^kg-1·天^-1）和 QZF（2 g·^kg-1·天^-1）²²。为 C 组和 CRS 组提供等效的生理盐水以进行单变量控制。
   注意：每日给药于 08：00 进行，与模型建立同步启动，并在整个 28 天的建模期间持续进行。

3. 蔗糖偏好试验 （SPT）

1. 在实验开始前，剥夺大鼠的食物和水 24 小时。
2. 配制 1% 蔗糖水溶液，将溶液和纯水倒入实验动物的饮水瓶中称重。通过在实验前后称量瓶子来测量纯水和蔗糖水的消耗量。
3. 在每个鼠笼盖的进水口放置一瓶蔗糖溶液和一瓶纯净水，左边各一瓶，供免费饮用。为防止大鼠偏爱一侧饮水，实验 30 分钟后，请切换左右水瓶的位置。
4. 实验 1 小时后，取出所有水瓶，及时称重，并记录蔗糖溶液和纯水的消耗量。使用以下公式计算每周蔗糖偏好率：
   蔗糖偏好值 = × 100%

4. 体重测量

1. 大鼠进入实验室后每周称重，并将称重的固定时间设置为上午 7：00。建立此时间表以促进观察体重变化。

5. 旷场试验 （OFT）

1. 在实验开始前，将大鼠适应行为室 1 小时，并在空旷的田间箱中调整照明以确保分布均匀。确认大鼠在跟踪软件中清晰可见。
2. 利用视频跟踪和分析系统，将空场箱的底面 （50 cm x 50 cm x 50 cm） 划分为 9 个等面积的方形网格。将与墙壁相邻的 8 个网格指定为外围区域，将中心网格指定为中心区域。
3. 将大鼠放在空地盒子的中央区域。使用视频跟踪系统记录大鼠的运动 5 分钟。
4. 对每只大鼠进行测试后，用 75% 乙醇清洁腔室，以去除残留气味并防止干扰下一只大鼠的行为。在 OFT 记录的中央网格中输入旷场活动的总距离 （mm） 和条目数。

6. 强迫游泳测试 （FST）

注意：大鼠强迫游泳实验包括预实验和正式实验。在正式实验前 24 小时进行预实验，遵循相同的程序，大鼠游泳 15 分钟。

1. 在实验前至少 30 分钟将实验动物运送到行为室，让它们适应环境。
2. 准备一个透明的圆柱形有机玻璃水缸（高 50 厘米，直径 20 厘米），并在 23-25 °C 下装满水。 根据动物的体重调整水深，确保动物的尾巴与圆柱体底部保持一定距离。
3. 慢慢地将大鼠放入水缸中，并在整个实验过程中保持安静。激活相机和信号采集系统。观察并记录 300 秒内浮动不动的持续时间。立即将大鼠从水中取出，并在实验结束时将其擦干。
4. 每次治疗后，更换水以防止对下一只老鼠产生任何影响。

7. 网络药理预测

1. QZF 化合物和推定靶标的集合
   1. 访问传统中医系统药理学 （TCMSP） 数据库 （https://old.tcmsp-e.com/）²³、HERB 数据库²⁴ 和 TCMID 数据库 （https://www.bidd.group/TCMID/）。使用 QZF 中的 GZ、YZ、YZR、BS、CBM、RS、HJT 和 ZGC 八个中药名称作为关键字，检索草药的活性化合物和靶点。从 TCMSP 和 Swiss target prediction （http://www.swisstargetprediction.ch/） 收集目标。将过滤器值设置为 Probability* > 0。
      注：通常，根据其药代动力学特性将成分作为活性成分包括在内：口服生物利用度 （OB） ≥ 30% 和药物样特性 （DL） ≥ 0.18²⁵。
2. 预测疾病靶点
   1. 在 GeneCards 数据库 （https://www.genecards.org/） 中搜索关键词 “depression”，获取与抑郁症相关的基因靶点，下载疾病靶点电子电子表格，过滤出高于平均值的基因评分，编制抑郁靶点列表²⁶。
3. 药物-成分-疾病-靶点网络
   1. 创建一个新的电子表格，并在同一列中填充与抑郁症相关的靶标和药物靶标。点击菜单栏中的开始 |条件格式 |高亮显示单元格规则 |重复值。在出现²⁷ 的对话框中选择一种格式（例如，“浅红色填充”），单击“确定”查看结果。
   2. 启动网络分析软件，然后单击菜单栏中的 File |导入 |网络。通过在左侧控制面板的 Style （样式） 面板中调整节点的大小和颜色来优化网络的外观。通过单击菜单栏中的 Tools |分析网络²⁷.
4. 蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络
   1. 访问 Jvenn （https://jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html） 工具，分别上传化合物靶标和疾病靶标，绘制化合物推测靶标和疾病靶标之间的重叠基因 （OGE）。单击图像中的数字并将其复制到电子表格中，然后下载维恩图图像。
   2. 访问 STRING 数据库 （https://stringdb.org/）²⁸，然后将电子表格中的 OGE 输入到数据库中。具体来说，将 QZF 抗抑郁重叠目标列表粘贴到 List of Names 对话框中。在 Organisms 部分选择 Homo sapiens，然后单击 SEARCH |继续。从标题栏中选择 Exports 选项，然后下载 PNG 和 TSV 格式的 PPI 网络摘要表²⁹。
5. 核心蛋白的筛选
   1. 启动网络分析软件 （https://cytoscape.org/）。然后，在菜单栏中，单击 File |导入 |网络 |File 导入上一步中生成的 TSV 格式文件³⁰.
   2. 在菜单栏中选择 Analyze Network ，然后单击 Analyze 按钮。然后，查看分析结果并了解网络的整体结构特征，例如节点数、边数和平均度。
   3. 选择 应用程序 |菜单栏中的 App Manager 。搜索 MCODE，安装插件，然后运行插件以获取 Hub 目标。然后，搜索 CytoNCA，安装插件，关注 Degree、Closeness centrality （CC） 和 Betweenness centrality （BC） 三个参数值。根据这些参数的值，筛选 Degree 、CC 和 BC 较高的节点，它们通常被认为是核心蛋白³¹。
6. 基因本体论 （GO） 和京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 富集分析
   1. 打开生物信息学平台 （https://www.omicshare.com/）。单击“工具 ”菜单，找到 ID 基因转换工具，然后单击它。然后，点击 upload file 按钮，在目标基因的核心选择生成的步骤，并下载转换后的文件 ID 列表。
   2. 在 Tools 菜单中，单击 Dynamic KEGG enrichment Analysis 工具。上传基因 ID 列表。在 Species 选项中，选择 Homo sapiens 并单击 Submit 按钮。
   3. 在 Tools 菜单中，单击 Dynamic GO enrichment Analysis tool |基因 选项 |上传文件 选项。选择 基因 ID 列表 ，然后在 Species 选项中选择 Homo sapiens。选择要分析的 GO 类型，包括 Biological Process、Molecular Function 和 Cellular Component。
   4. 对于 KEGG 和 GO 富集分析的结果，将 过滤阈值 设置为 p < 0.05。按降序排列计数。

8. 分子对接验证

1. 请访问 PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 网站。在搜索栏中输入目标化合物。单击 2D 结构并下载它。
2. 打开 PDB （https://www.Rcsb.org/） 数据库。选择分辨率高且包含原始配体的晶体结构。下载 PDB 文件。
3. 为了优化蛋白质结构，请打开分子可视化软件。加载下载的 PDB 文件。去除水分子并保存优化的 PDB 文件。
4. 打开分子对接软件，导入优化后的 PDB 文件。在 AutoDockTools 中，单击 “编辑”|”Delete Water （删除水 ） 以删除水分子。单击 Edit |添加氢气 |添加 以将氢原子添加到蛋白质和配体²⁹.
5. 在 AutoDockTools 中，将 受体 条设置为 receptor.pdbqt ，将 配体 条设置为 ligand.pdbqt。打开 pdbqt。file 查看蛋白质和配体的结合位点，并设置对接盒的大小和位置，以确保其能完全包裹受体蛋白和配体化合物。在 AutoDockTools 中，单击 “网格”|”定义 Grid Box 以设置框的中心坐标和尺寸，并使用分子对接的默认值。停靠框架将按结合能的降序自动排序。
6. 打开结果文件并记录最佳结合能量值。较低的结合能表示更稳定的结合。使用分子可视化软件加载结果文件。调整视图和颜色以清晰显示配体-受体相互作用。

9. 统计分析

1. 在科学数据分析和可视化软件中进行统计分析，并将所有数据表示为 SEM ±平均值。使用重复测量双向方差分析在给药前后进行组间比较。使用单因子方差分析在两个以上的组之间进行比较。
2. 将 P 的值< 0.05 视为统计显著性。

CRS 诱导的大鼠抑郁模型的行为测试结果

蔗糖偏好测试结果
基线时，各组蔗糖偏好系数无差异 （P > 0.05）。干预 28 d 后，CRS 组的蔗糖偏好系数显著低于 CON 组 （P < 0.05），而 F 和 QZF 组的系数显著高于 CRS 组 （ 均 P < 0.01）。结果表明，应激大鼠表现出典型的快感缺乏症状，用 F 和 QZF 治疗缓解了这些症状（图 2A）。

体重结果
在 CRS 诱导之前，组间未观察到显着差异 （P > 0.05）。应激 4 周后，CRS 组体重增长率显著低于 CON 组 （P < 0.01），而 F 和 QZF 组的生长速率显著高于 M 组 （P < 0.001，P < 0.01）。 这些发现表明，压力破坏了大鼠的正常生理代谢，F 和 QZF 组的异常代谢特征显示出显着的改善和纠正（图 2B）。

空场测试结果
干预 28 天后，四组旷野试验总距离无显著差异 （P > 0.05）（图 2D）。与 CON 组相比，CRS 组中央区域花费的时间显著减少 （P < 0.01）。与 CRS 组相比，F 和 QZF 组在中央区域花费的时间显著增加 （均 P < 0.01）。治疗组之间无显著差异 （P > 0.05） （图 2C，E）。

强迫游泳测试结果
干预 28 天后，与 CON 组相比，CRS 组的不动时间显著增加 （P < 0.0001）。与 CRS 组相比，F 和 QZF 组显示不动时间显着减少 （P < 0.05，P < 0.001）（图 2F）。

网络药理学预测

具有复合假设的目标网络
为了构建 QZF-compound-hypothetical target network，我们首先筛选了 1,020 个 QZF 的假设目标，这些目标被收集并通过网络分析软件可视化为化合物目标。网络显示 1,184 个节点和 8,728 条边（图 3）³²。

QZF 和抑郁靶点筛查
从 GeneCards 数据库中共检索到 17,947 个抑郁相关靶标，平均相关性得分为 1.105。随后选择相关性得分超过 1.105 （n = 5,048） 的目标进行进一步的数据分析。用来自 QZF 的 1,020 个靶标构建了维恩图，以获得 612 个常见靶标 （OGE）（图 4A）。将 612 个共有靶点导入 STRING 数据库进行分析，PPI 网络包含 607 个节点和 14,375 条边 （图 4B），将 OGEs 导入网络分析软件，得到交互网络。

核心靶基因的筛选
使用 MCODE 插件的模块分析确定了得分最高的集群模块，其 MCODE 得分为 54.19029³¹。我们在 cluster hub 模块中确定了 64 个对 QZF 的抗抑郁作用至关重要的关键靶点（图 4C）。使用 CytoNCA 插件，我们根据三个中心性指标筛选了高度连接的节点：度中心性 （DC）、接近中心性 （CC） 和中介中心性 （BC）。具体来说，度中心性衡量节点在网络内拥有的直接连接数。接近中心性量化了一个节点与所有其他节点之间平均最短路径长度的倒数，表明一个节点访问其他节点的效率。中介中心性评估节点在所有节点对之间的最短路径中出现的频率，反映其中介作用。根据这些指标，我们构建了核心网络并确定了前 10 个连接最多的节点：BCL2、AKT1、IL6、BCL2L1、MTOR、CASP3、TP53、STAT3、NFKB1 和 HIF1A（图 4D）。数据过滤后，我们对这 10 个关键靶基因进行了功能富集分析，以进一步阐明它们的生物学功能。

GO 富集分析
GO 富集分析共产生 2,783 个注释项目，其中 2,385 个具有统计学意义。该分析主要影响生物过程 （BP） 、分子功能 （MF） 和细胞成分 （CC） 类别。具体来说，GO-BP 类别包括 2,450 个项目，其中 1,926 个被认为具有统计学意义。分子功能 （GO-MF） 类别确定了 184 个项目，其中 117 个项目具有统计学意义。细胞成分 （GO-CC） 类别揭示了 149 个项目，其中 59 个具有统计学意义（图 5）。

KEGG 富集分析
KEGG 通路富集分析共确定了 156 条与 10 个关键靶点相关的通路，其中 119 条通路显示出统计学意义。这些图说明了富集得分最高的前 20 条通路（图 6）。去除一些相关疾病留下了 HIF-1 和 JAK-STAT 信号通路两条信号通路，预计它们是 QZF 和抑郁的关键通路。

QZF 和抑郁症的主要靶点通路网络
为了阐明 QZF 与其对抑郁症影响之间的机制关系，我们开发了一个关键的中医-化合物-靶点-途径相互作用网络（图 7）。利用网络分析软件，我们可视化了具有最显着 p 值的信号通路及其相关靶标。生成的网络图包含 93 个节点和 218 条边。此外，我们生成了一个 Sankey 图来表示关键基因及其相应的活性化合物，特别关注 HIF-1 和 JAK-STAT 核心信号通路（图 8）。

分子对接
采用分子对接分析来证实化合物的靶点特异性。该技术评估配体与其蛋白质靶标之间的结合亲和力，其中结合能的强度较低表明相互作用越强，配体与其结合位点的距离越近³³。结果显示，HIF1A 和甘草黄酮醇 A 的结合能为 -8.7 kcal/mol，STAT3 和人参皂苷 rh2 的结合能为 -8.5 kcal/mol，BCL2 和异黄酮醇的结合能为 -7.6 Kcal/mmol，MTOR 和甘草查尔酮 B 的结合能为 -6.8 Kcal/mol，AKT1 和山奈酚的结合能为 -6.7 Kcal/mol，IL6 和亚麻酸的结合能为 -5.2 Kcal/mol。

总体而言，分子对接结果表明，这些化合物对其靶标表现出很强的结合亲和力。每种蛋白质的结合能可视化如下：白色卡通图案代表蛋白质受体，蓝色是小分子配体，黄色虚线表示配体与受体之间形成的氢键，绿色代表蛋白质受体与小分子配体之间氢键的附着位点， 数字表示氢键距离，这意味着配体和受体之间的结合非常稳定（图 9）³⁴。

图 1：实验大鼠的分组和行为测试流程图。 缩写： CRS = 慢性约束压力;QZF （Q） = 强志芳;F = 氟西汀;OFT = 旷场试验;FST = 强迫游泳测试;SPT = 蔗糖偏好试验。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：QZF 对 CRS 诱导的大鼠抑郁模型的影响。 （A） 第 0 天和第 28 天蔗糖消耗水平 （%）。（B） 第 0 天和第 28 天的体重 （g）。（C） 第 4 周旷场测试中大鼠轨迹图。（D） 第 0 天和第 28 天的旷场地总距离。（E） 第 4 周时每组在 OFT 中心区域停留的时间。** P < 0.01 表示与 CRS 组相比，F 组和 QZF 组之间存在显著差异。（F） 第 4 周时每组的 FST 不动时间 （%）。* P < 0.01 表示 F 组与 CRS 组之间存在显著差异。 P < 0.001 表示 QZF 组与 CRS 组相比差异显著。缩写： CRS = 慢性约束压力;QZF = 强之芳。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：QZF-Compound-Target 网络。 绿色三角形表示 QZF 中的中药;圆圈表示中药的成分;菱形表示目标。粉红色箭头表示几种中草药的常见成分。A （MOL000211） 与 Bai shao 和 Zhi gan cao 有关;B （MOL000358） 与白少、川北母、顾志和任神有关;C（MOL000359）与白少、川北母和桂芝相连;D （MOL000422） 属于白少、知干曹和任神;E （MOL000492） 与白少和孤芝有关。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：交叉口目标的识别和核心目标的筛选。 （A） QZF 和抑郁症常见靶点的维恩图。浅绿色圆圈代表 QZF 中活性成分的靶蛋白;蓝色圆圈表示与抑郁症相关的蛋白质。两种颜色相交的重叠区域说明了共享蛋白质，总计 612 个。（B） QZF 和抑郁的 PPI 网络。（C） MCODE 分析。（D） 前 10 大核心目标。缩写：QZF = qiangzhifang;PPI = 蛋白质-蛋白质相互作用。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：常见靶标的 GO 富集分析的直方图。 绿色条代表生物过程;红色条表示分子功能;蓝色条表示蜂窝组件。每个条形的高度反映了与相应 GO 术语相关的基因计数。缩写：GO = 基因本体论。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6：QZF 治疗抑郁症靶点的 KEGG 富集途径。 （A） 前 20 条通路的条形图，按 P 值排序。（B） 前 20 条通路的气泡图：点大小表示基因数量;颜色强度反映 P 值显著性。（C） KEGG 通路的功能注释。缩写：KEGG = 京都基因和基因组百科全书。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7：TCM-化合物-靶点-途径的交互网络。 红色表示 QZF 和抑郁症，紫色表示信号通路，绿色突出显示核心通路蛋白，黄色表示 QZF 中的中药，蓝色表示组成草药化合物。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 8：基于 HIF-1 和 JAK-STAT 信号通路的 QZF 抗抑郁作用的中医-化合物-靶点-通路的桑基图。 缩写：QZF = qiangzhifang;TCM = 传统中医;HIF-1 = 缺氧诱导因子-1;JAK-STAT = Janus 激活的激酶信号转导子和转录激活剂。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 9：分子对接验证结果。 （A） QZF 代表成分与靶蛋白分子之间结合能 （kcal/mol） 的热图 （B） 对接情况的可视化。简称：QZF = qiangzhifang。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件 1：QZF 中药颗粒的制备。 简称：QZF = qiangzhifang。 请点击此处下载此文件。

CRS 是建立抑郁症动物模型的一种广泛使用的方法。该模型模拟了人类生活中遇到的慢性心理压力，并诱导大鼠出现类似抑郁的行为³⁵。在本研究中，大鼠约束管由透明塑料制成，在确保动物安全的同时，可以在实验过程中进行清晰的观察。透明管长约 18 cm，直径约 6 cm，具有多个通风孔，每个通风孔的直径为 1 cm，沿侧面和盖子均匀分布，为大鼠提供充足的气流。应激大鼠表现出嗜睡和眼睛呆滞等抑郁症状，以及抑郁症特征的行为改变。具体来说，这些变化包括 OFT 运动活动减少、FST 不动时间延长以及 SPT 蔗糖消耗减少。这些行为表现与临床抑郁症患者观察到的运动迟缓、快感缺乏和兴趣丧失非常相似。

在研究抑郁症复杂病理机制的背景下，网络药理学与分子对接技术的结合为分析中药化合物治疗抑郁症的分子机制提供了创新策略。本研究确定 HIF1A 、 STAT3 、 BCL2 、 MTOR 、 AKT1 和 IL6 是 QZF 治疗抑郁症的核心靶点。这些靶标主要在 HIF-1 和 JAK-STAT 信号通路中富集。这两个信号通路在抑郁症的关键病理过程中起着核心作用，例如神经炎症、氧化应激和细胞凋亡。

HIF-1 信号通路作为细胞氧代谢的中心调节机制，在各种生理过程中起着至关重要的作用，包括神经保护、抗氧化应激反应和血管生成³⁶。研究表明，抑郁症患者的脑组织表现出明显的缺氧微环境和氧化应激损伤，这与神经炎症反应的激活和神经递质的失衡密切相关³⁷。Semenza 的研究表明，在缺氧条件下，HIF-1α 上调与氧代谢和抗氧化防御机制相关的基因，包括血管内皮生长因子 （VEGF）、促红细胞生成素 （EPO） 和线粒体基因。因此，这增强了线粒体功能，促进了脑微血管的形成，增加了向脑组织的氧气输送，并减少了活性氧 （ROS） 积累³⁸。

进一步的实验研究表明，HIF-1α 缺陷显著增强了神经元对氧化应激的易感性，从而触发凋亡信号通路的异常激活³⁹。这导致神经元凋亡显著增加和进行性认知能力下降。相比之下，转基因小鼠模型中神经元特异性 HIF-1α 过表达可显著提高神经元存活率和突触密度⁴⁰。这些发现不仅证实了 HIF-1α 在抗氧化防御机制中的关键作用，而且强调了其通过促进神经可塑性重塑和突触结构优化来增强脑功能的潜在治疗意义。此外，HIF-1 信号通路拮抗 NF-κB 信号转导通路，导致炎性细胞因子 IL-6 和 TNF-α 的产生减少，抑制神经炎症，并表现出潜在的神经保护和抗抑郁作用⁴¹。

值得注意的是，甘草黄酮醇 A 是 QZF 的活性成分之一，已被证实具有抗氧化和抗炎特性。在这项研究中，分子对接数据显示甘草素 A 与 HIF-1α 蛋白表现出高结合亲和力，达到 -8.7 kcal/mol。这一发现强烈表明甘草黄酮醇 A 可能直接靶向 HIF-1α，调节其蛋白质稳定性或转录活性。因此，它调节 HIF-1 信号通路内参与氧代谢和抗氧化防御的基因的表达，从而增强低氧条件下的神经元存活并减轻与抑郁症相关的神经损伤。

JAK-STAT 信号转导通路是细胞因子信号转导的中心枢纽，在各种生物过程中起着关键作用，包括炎症调节、免疫反应调节和神经元存活^42,43。广泛的研究表明，抑郁症的发病机制与 JAK-STAT 信号通路失调错综复杂地相关⁴⁴。Dowlati 等人进行的一项荟萃分析显示，与健康对照组相比，抑郁症患者血清促炎细胞因子（如 IL-6 和 TNF-α）水平显著升高，与抑郁症状的严重程度呈正相关⁴⁵。具体来说，这些促炎因子能够激活 JAK-STAT 通路，从而引发炎症反应。这个过程不仅会直接损伤神经元和神经胶质细胞，还会损害突触结构和功能，最终加剧患者的认知和情绪障碍⁴⁶。

此外，JAK-STAT 通路的过度激活与神经元凋亡密切相关。持续的 STAT3 磷酸化上调促凋亡基因的表达，包括 Caspase 家族的成员，最终导致神经元丢失。此外，该通路的异常激活会损害海马区域的神经发生并降低突触可塑性，从而加剧神经功能缺陷⁴⁷。在本研究中，QZF 的重要活性成分人参皂苷 Rh2 在分子对接分析中与 STAT3 蛋白表现出显著的结合亲和力。基于这些发现，人参皂苷 Rh2 可能通过特异性抑制 STAT3 激活来有效缓解神经炎症反应，从而减少促炎细胞因子的产生和释放⁴⁸。

除了 HIF-1 和 JAK-STAT 两个核心信号通路外，本研究还确定了 QZF 抗抑郁作用期间其他活性成分和靶点之间的协同相互作用。BCL2 是一种经典的抗凋亡蛋白，在维持细胞存活和抑制凋亡信号通路中起着至关重要的作用⁴⁹。在 QZF 中，异立黄酮醇通过特异性靶向和激活 BCL2 蛋白表现出抗氧化和抗凋亡特性，从而有效抑制神经元凋亡、保护神经元并改善与抑郁症相关的神经病理改变。此外，抑郁症患者异常的 MTOR 信号通路与神经元功能障碍密切相关⁵⁰。研究表明，甘草查尔酮 B 通过调节 MTOR 信号通路⁵¹ 促进神经元生长和存活，增强突触可塑性和功能连接，从而发挥抗抑郁作用。此外，天然类黄酮山奈酚以其强大的抗氧化和抗炎活性为特征，特异性激活 AKT1 信号通路。通过调节多个关键下游分子，它不仅可以促进神经元存活，还可以加速功能恢复，从而为 QZF 的抗抑郁作用提供额外的分子靶点支持。

综上所述，本研究利用网络药理学和分子对接来预测 QZF 治疗抑郁症的治疗途径、核心靶点和有效活性成分。QZF 的抗抑郁作用在大鼠抑郁症模型中得到验证，表明它可能通过调节多种信号通路（包括 HIF-1 和 JAK-STAT）并靶向神经炎症、氧化应激和细胞凋亡等关键病理过程来发挥其抗抑郁作用。这一发现不仅加深了我们对抑郁症病理机制的理解，也为中医方剂在抑郁症治疗中的应用提供了理论基础和新的治疗靶点。但是，这项研究有一定的局限性。QZF 中多种成分的协同机制仍有待完全阐明，这些成分 在体内 的代谢过程和相互作用需要进一步研究。未来的研究可以将 体外 和 体内 实验与液相色谱、高通量测序和多组学整合等先进技术相结合，以全面准确地识别与 QZF 抗抑郁作用相关的关键靶点和通路，从而验证和扩展通过网络药理学做出的预测。

作者没有需要声明的利益冲突。

该研究得到了国家自然科学基金 （82374311）、国家中医药管理局高水平中医基础理论重点学科建设项目 （zyyzdxk-2023118）、国家中医专家工作室建设项目 （全国中医药教育信第 75 号） 和山东省自然科学基金 （ZR2022LZY016） 的支持。QZF 颗粒由山东中医药大学附属医院医药产品科制备。