Farmacología de la red y validación de los mecanismos antidepresivos de Qiangzhifang en un modelo de rata con depresión crónica inducida por estrés

Este estudio evaluó la eficacia antidepresiva de Qiangzhifang en un modelo de rata de depresión inducida por estrés crónico y dilucidó su efecto regulador sobre las vías HIF-1 y JAK-STAT mediante farmacología de red y análisis de acoplamiento molecular.

La depresión es un trastorno psiquiátrico complejo que plantea importantes desafíos en el tratamiento. El Qiangzhifang (QZF), un compuesto utilizado en la medicina tradicional china, demuestra una eficacia clínica potencial en el tratamiento de la depresión. Sin embargo, los mecanismos de acción y los ingredientes activos de QZF no se han dilucidado por completo. El objetivo principal de este estudio fue dilucidar los ingredientes activos efectivos y los posibles mecanismos moleculares de QZF para el alivio de la depresión mediante la integración de predicciones farmacológicas en red con validaciones experimentales.

Adoptamos un modelo de rata de estrés crónico por restricción (CRS) y realizamos pruebas de comportamiento como la prueba de campo abierto (OFT), la prueba de preferencia por la sacarosa (SPT) y la prueba de natación forzada (FST) para evaluar los efectos terapéuticos de QZF sobre la depresión. En cuanto a los parámetros conductuales, el grupo QZF exhibió una masa corporal, un índice de preferencia de sacarosa y un tiempo de residencia en la zona central significativamente mayores en comparación con el grupo modelo (P < 0,01, P < 0,01, P < 0,01), y un tiempo de inmovilización significativamente menor en la prueba de natación forzada (P < 0,001). La farmacología de redes y los estudios de acoplamiento molecular sugieren que QZF puede tener efectos antidepresivos al modular las vías HIF-1 y JAK-STAT, con genes diana clave como AKT1, IL-6, MTOR y TP53, implicados en la inflamación, la neuroprotección y la apoptosis. En conclusión, este estudio ofrece nuevos conocimientos sobre la modernización y el desarrollo de los compuestos de la medicina china para el tratamiento integral de la depresión.

La depresión, un problema de salud generalizado a nivel mundial, se caracteriza por un estado de ánimo bajo y persistente, una disminución del interés y el placer, y deficiencias cognitivas y neurológicas¹. Según lo informado por la Organización Mundial de la Salud, la depresión afecta aproximadamente a 380 millones de personas en todo el mundo, y se espera que esta cifra aumente². Al ser un trastorno mental complejo y multifactorial, la depresión afecta la calidad de vida de los pacientes y representa una carga económica y médica considerable para la sociedad, caracterizada por altas tasas de incidencia, recurrencia y tasas de discapacidad³.

La etiología de la depresión es compleja y los mecanismos precisos aún no se comprenden completamente. A medida que avanza la investigación en este campo, factores como la neuroinflamación, el estrés oxidativo y la apoptosis han atraído una atención significativa. Los estudios indican que los pacientes con depresión exhiben niveles elevados de citocinas proinflamatorias como el TNF y la interleucina-1β en comparación con los individuos sanos, y se observa una mayor prevalencia de depresión en aquellos con afecciones inflamatorias⁴. En el estrés oxidativo, las especies reactivas de oxígeno (ROS) se producen en exceso en respuesta a estímulos dañinos, abrumando las defensas antioxidantes del cuerpo y provocando un desequilibrio entre los sistemas oxidativo y antioxidante, causando así daño tisular. El estrés oxidativo elevado en la depresión puede aumentar la peroxidación lipídica y exacerbar el daño a los genes y proteínas celulares, afectando la función neuronal y contribuyendo a la degeneración neuronal, la apoptosis y el^{deterioro de la} plasticidad. Además, las alteraciones observadas en las presentaciones clínicas, los marcadores bioquímicos y las estructuras cerebrales en pacientes con depresión están relacionadas con la apoptosis. Los estudios de imagen revelan una reducción del volumen del hipocampo y atrofia en pacientes con depresión, con la apoptosis neuronal potencialmente jugando un papel fundamental en estos cambios⁶.

En la actualidad, el tratamiento farmacológico es el enfoque principal para el tratamiento de la depresión, con inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS) e inhibidores de la recaptación de norepinefrina (NRI) que se emplean con frecuencia en la práctica clínica⁷. Sin embargo, estos fármacos se acompañan de efectos adversos significativos. Además de los síntomas del sistema nervioso central, como el dolor de cabeza y el insomnio, la mayoría de los antidepresivos también suelen presentar efectos secundarios gastrointestinales, como náuseas y diarrea ^8,9. Algunos antidepresivos también pueden causar disfunción sexual¹⁰, lo que afecta gravemente los resultados del tratamiento y reduce la adherencia a la medicación entre los pacientes con depresión¹¹. Además, la eficacia de estos fármacos es limitada para algunos pacientes. Estudios metabolómicos recientes han indicado que las diferencias individuales en la microbiota intestinal pueden influir en la eficacia de los fármacos¹². Por lo tanto, el desarrollo de tratamientos más seguros y eficaces sigue siendo un enfoque crítico en la investigación de la depresión.

Las formulaciones de la medicina tradicional china (MTC) han demostrado un potencial significativo en el tratamiento de la depresión, atribuido a sus efectos sinérgicos que involucran múltiples componentes, objetivos y vías¹³. La medicina tradicional china postula que el Yang qi vigoroso es esencial para mantener la vitalidad del cuerpo. Por lo tanto, el profesor Yuanqing Ding, aprovechando los principios únicos del diagnóstico y tratamiento de la medicina tradicional china y una amplia experiencia clínica, propuso que "yang yu shen tui" es la patogénesis fundamental de la depresión. Sobre la base de este concepto, desarrolló Qiangzhifang (QZF) para abordar específicamente esta patogenia¹⁴. La aplicación clínica de QZF en el tratamiento de la depresión ha demostrado una eficacia significativa, con una tasa efectiva total del 71,43%¹⁵. QZF se compone de varios materiales medicinales tradicionales chinos, incluidos Ramulus cinnamomi (gui zhi, GZ), Polygala tenuifolia (yuan zhi, YZ), Alpinia oxyphylla miq (yi zhi ren, YZR), Paeonia lactiflora (bai shao, BS), Fritillariae cirrhosae bulbus (chuan bei mu, CBM), Panax ginseng (ren shen, RS), Rhodiola rosea L (hong jing tian, HJT) y regaliz (gan cao, GC) (Archivo suplementario 1). Los estudios han demostrado que Polygala tenuifolia es rica en saponinas y exhibe efectos neuroprotectores¹⁶. De manera similar, el par de hierbas Ramulus Cinnamomi-Paeonia lactiflora demuestra una eficacia potencial para aliviar el dolor y la depresión¹⁷. Además, las saponinas totales del ginseng pueden reducir los niveles de citocinas proinflamatorias del hipocampo, mejorar el comportamiento depresivo y atenuar el daño del nervio del hipocampo en ratas^. El regaliz contiene principalmente triterpenoides y flavonoides. Los flavonoides totales (LF) del regaliz pueden desempeñar un papel antidepresivo al mejorar el comportamiento depresivo, modular la vía de señalización BDNF/TrkB y mejorar la plasticidad sináptica^. Sin embargo, los mecanismos específicos que subyacen a los efectos antidepresivos de la QZF siguen sin estar claros, lo que limita su aplicación generalizada.

Por lo tanto, nuestro estudio tiene como objetivo establecer un modelo de CRS en ratas con depresión, demostrar el efecto terapéutico de QZF sobre la depresión en ratas a través de experimentos conductuales y evaluar sistemáticamente el mecanismo antidepresivo de QZF utilizando farmacología de red y tecnología de acoplamiento molecular²⁰. Al clarificar los componentes activos y los objetivos potenciales de QZF, se pueden localizar con precisión los objetivos principales de la depresión. Creemos que al explorar en profundidad el mecanismo de acción de QZF, no solo podemos proporcionar opciones de tratamiento más seguras y efectivas para los pacientes con depresión, sino que también proporcionamos una base científica para la aplicación de la medicina tradicional china en el tratamiento de la depresión.

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentos con Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shandong (número de aprobación: YYLW2023000327) y cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio emitida por los Institutos Nacionales de Salud. En este experimento, utilizamos 40 ratas Wistar macho sanas, grado SPF, con un peso corporal promedio de (140 ± 10) g (Figura 1). Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de todos los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo.

1. Modelo de depresión de ratas

1. Alojamiento y agrupamiento de animales
   1. Entra en la sala de cría con los animales y numéralos con un instrumento de marcado de cola.
   2. Aloje a las ratas individualmente en jaulas, manteniendo una temperatura de 21 ± 2 °C y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.
   3. Aclimatar a las ratas en el laboratorio durante 7 días, proporcionando acceso ad libitum a la comida y al agua mientras las manipula diariamente para su adaptación.
   4. Después del período de aclimatación, mida el peso corporal y realice las pruebas de preferencia de sacarosa (SPT) y las pruebas de campo abierto (OFT).
   5. Con base en los datos experimentales, divida las ratas en cuatro grupos, asegurándose de que cada grupo conste de 10 ratas: el grupo de control (CON), el grupo modelo (CRS), el grupo QZF y el grupo de fluoxetina (F).
2. Establecimiento de un modelo de Estrés Crónico por Restricción (CRS) en ratas
   1. Construye el dispositivo de sujeción para ratas. Seleccione un tubo de plástico transparente con un diámetro y longitud adecuados para el tamaño²¹ de la rata, permitiendo que la rata se pare y gire hacia adentro mientras evita escapar. Use un perforador de orificios de soldador eléctrico para crear orificios en los lados del tubo de plástico y en la tapa para garantizar la circulación de aire adecuada.
   2. Coloque suavemente a las ratas en los dispositivos de retención (excepto las del grupo C) 1 h después de la administración intragástrica diaria del medicamento, asegurándose de que estén en una posición cómoda.
   3. Privar a todos los grupos de ratas de comida y agua durante el período de restricción. Después de que termine el período de restricción, bríndeles abundante comida y agua de manera uniforme. Fijar la duración diaria de la sujeción en 6 h (de 9:30 h a 15:30 h) y mantenerla durante 28 días consecutivos.

2. Intervención farmacológica

1. Administrar por sonda nasogástrica: 1 mL de solución/100 g de peso corporal, fluoxetina (2,7 mg·^kg-1·^día-1) y QZF (2 g·^kg-1·^día-1)²². Proporcionar a los grupos C y CRS solución salina normal equivalente para el control de una sola variable.
   NOTA: La administración diaria del fármaco se realizó a las 08:00 h, iniciándose sincrónicamente con el establecimiento del modelo y persistiendo durante todo el período de modelado de 28 días.

3. Prueba de preferencia de sacarosa (SPT)

1. Priva a las ratas de comida y agua durante 24 horas antes de que comience el experimento.
2. Preparar una solución acuosa de sacarosa al 1% y llenar la solución y el agua pura en los biberones de los animales de experimentación para su pesaje. Mida el consumo de agua pura y agua con sacarosa pesando las botellas antes y después del experimento.
3. Coloque una botella de solución de sacarosa y una botella de agua pura en la entrada de agua de cada tapa de jaula para ratas, una a la izquierda y otra a la derecha, para tener libre acceso a la bebida. Para evitar que las ratas favorezcan un lado para la ingesta de agua, cambie las posiciones de las botellas de agua a la izquierda y a la derecha después de 30 minutos en el experimento.
4. Después de 1 h del experimento, retire todas las botellas de agua, péselas rápidamente y registre el consumo de solución de sacarosa y agua pura. Calcule la proporción de preferencia semanal de sacarosa usando la fórmula:
   Valor de preferencia de sacarosa = × 100%

4. Medición del peso corporal

1. Pesar las ratas semanalmente a su entrada en el laboratorio y establecer la hora fija para el pesaje a las 7:00 a.m. Establezca este horario para facilitar la observación de los cambios en el peso corporal.

5. Prueba de campo abierto (OFT)

1. Antes de que comience el experimento, aclimate a las ratas a la sala de comportamiento durante 1 hora y ajuste la iluminación en la caja de campo abierto para garantizar una distribución uniforme. Confirme que las ratas sean claramente visibles en el software de seguimiento.
2. Utilice el sistema de análisis y seguimiento de video para dividir la superficie inferior de la caja de campo abierto (50 cm x 50 cm x 50 cm) en nueve cuadrículas cuadradas de áreas equivalentes. Designe las ocho cuadrículas adyacentes a las paredes como el área periférica y la cuadrícula central como el área central.
3. Coloca la rata en el área central de la caja de campo abierto. Grabe el movimiento de la rata durante 5 minutos utilizando el sistema de seguimiento de video.
4. Después de probar cada rata, limpie la cámara con etanol al 75% para eliminar el olor residual y evitar interferencias con el comportamiento de la siguiente rata. Introduzca la distancia total (mm) de las actividades a campo abierto y el número de entradas en la cuadrícula central en los registros OFT.

6. Prueba de natación forzada (FST)

NOTA: El experimento de natación forzada con ratas comprende un pre-experimento y un experimento formal. Realizar el pre-experimento 24 h antes del experimento formal, siguiendo el mismo procedimiento, con la rata nadando durante 15 min.

1. Transportar a los animales de experimentación a la sala de comportamiento al menos 30 minutos antes del experimento para que puedan aclimatarse al entorno.
2. Prepare un cilindro de agua cilíndrico de plexiglás transparente (50 cm de alto, 20 cm de diámetro) y llénelo con agua a 23-25 °C. Ajuste la profundidad del agua en función del peso del animal, asegurándose de que la cola del animal permanezca a cierta distancia del fondo del cilindro.
3. Coloque lentamente las ratas en el cilindro de agua y manténgase en silencio durante todo el experimento. Activar la cámara y el sistema de adquisición de señal. Observe y registre la duración de la inmovilidad flotante dentro de los 300 s. Retire inmediatamente las ratas del agua y séquelas al final del experimento.
4. Después de cada sesión, reemplace el agua para evitar cualquier influencia en la siguiente rata.

7. Predicción farmacológica de la red

1. Colección de compuestos QZF y dianas putativas
   1. Acceda a la base de datos de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP) (https://old.tcmsp-e.com/)²³, a la base de datos HERB²⁴ y a la base de datos TCMID (https://www.bidd.group/TCMID/). Utilice los ocho nombres de TCM en QZF, incluidos GZ, YZ, YZR, BS, CBM, RS, HJT y ZGC, como palabras clave para buscar compuestos activos y objetivos de las hierbas. Recopile objetivos del TCMSP y de la predicción de objetivos suizos (http://www.swisstargetprediction.ch/). Establezca el valor del filtro en Probabilidad* > 0.
      NOTA: Por lo general, los ingredientes se incluyeron como ingredientes activos en función de sus características farmacocinéticas: biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30% y características similares a medicamentos (DL) ≥ 0,18²⁵.
2. Predicción de dianas patológicas
   1. Busque la palabra clave "depresión" en la base de datos de GeneCards (https://www.genecards.org/), obtenga objetivos genéticos asociados con la depresión, descargue la hoja de cálculo electrónica de objetivos de enfermedades, filtre las puntuaciones genéticas que sean más altas que el valor promedio y compile una lista de objetivos para la depresión²⁶.
3. Red de fármacos-componentes-enfermedades-dianas
   1. Cree una nueva hoja de cálculo y rellénela con objetivos relacionados con la depresión y objetivos de medicamentos en la misma columna. Haga clic en Inicio en la barra de menú | Formato condicional | Reglas de resaltado de celdas | Valores duplicados. Seleccione un formato (por ejemplo, "Relleno rojo claro") en el cuadro de diálogo que aparece²⁷, haga clic en Aceptar para ver los resultados.
   2. Inicie el software de análisis de red e importe el archivo de la hoja de cálculo haciendo clic en Archivo en la barra de menú | Importación | Red. Optimice la apariencia de la red ajustando el tamaño y el color de los nodos en el panel Estilo ubicado en el panel de control izquierdo. Realice un análisis de la topología de la red haciendo clic en Herramientas en la barra de menú | Analizar la red²⁷.
4. Red de interacción proteína-proteína (PPI)
   1. Acceda a la herramienta Jvenn (https://jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html), cargue los objetivos compuestos y los objetivos de enfermedades por separado, trace los genes superpuestos (OGE) entre los presuntos objetivos compuestos y los objetivos de enfermedades. Haz clic en los números de la imagen y cópialos en una hoja de cálculo y descarga la imagen del diagrama de Venn.
   2. Acceda a la base de datos STRING (https://stringdb.org/)²⁸ e introduzca los OGE de la hoja de cálculo en la base de datos. En concreto, pegue la lista de objetivos superpuestos antidepresivos QZF en el cuadro de diálogo Lista de nombres . Seleccione Homo sapiens en la sección Organismos y haga clic en BUSCAR | CONTINÚE. Seleccione la opción Exportaciones de la barra de título y descargue la tabla resumen de la red PPI en formatos PNG y TSV²⁹.
5. Cribado de proteínas centrales
   1. Inicie el software de análisis de red (https://cytoscape.org/). Luego, en la barra de menú, haga clic en Archivo | Importación | Red | Fichero para importar el fichero en formato TSV generado en el paso³⁰ anterior.
   2. Seleccione Analizar red en la barra de menú y haga clic en el botón Analizar . A continuación, vea los resultados del análisis y comprenda las características estructurales generales de la red, como el número de nodos, el número de bordes y el grado medio.
   3. Seleccionar aplicaciones | Administrador de aplicaciones en la barra de menú. Busque MCODE, instale el complemento y ejecute el complemento para obtener el destino del concentrador. A continuación, busque CytoNCA, instale el complemento y concéntrese en los tres valores de parámetro de Grado, Centralidad de cercanía (CC) y Centralidad de intermediación (BC). De acuerdo con los valores de estos parámetros, se seleccionan los nodos con mayor grado, CC y BC, que generalmente se consideran proteínas centrales³¹.
6. Análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) y Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG)
   1. Abra la plataforma bioinformática (https://www.omicshare.com/). Haga clic en el menú Herramientas , busque la herramienta de conversión de genes ID y haga clic en ella. A continuación, haga clic en el botón de carga de archivo , seleccione el paso generado en el núcleo de los genes objetivo y descargue la lista de ID de archivo convertido.
   2. En el menú Herramientas , haga clic en la herramienta Análisis de enriquecimiento dinámico de KEGG . Cargue la lista de identificación de genes. En la opción Especie , seleccione Homo sapiens y haga clic en el botón Enviar .
   3. En el menú Herramientas, haga clic en la herramienta Análisis de enriquecimiento dinámico de GO | Opción genética | Opción de cargar archivo. Seleccione la lista de ID de genes y, en la opción Especie, seleccione Homo sapiens. Seleccione el tipo de GO para el análisis, incluido el proceso biológico, la función molecular y el componente celular.
   4. Para los resultados del análisis de enriquecimiento de KEGG y GO, establezca el umbral de filtrado en p < 0,05. Organice los recuentos en orden descendente.

8. Verificación del acoplamiento molecular

1. Visite el sitio web de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Introduzca los compuestos objetivo en la barra de búsqueda. Haga clic en la estructura 2D y descárguela.
2. Abra la base de datos PDB (https://www.Rcsb.org/). Seleccione la estructura cristalina con alta resolución y que contenga el ligando original. Descargue el archivo PDB.
3. Para optimizar la estructura de la proteína, abra el software de visualización molecular. Cargue el archivo PDB descargado. Retire las moléculas de agua y guarde el archivo PDB optimizado.
4. Abra el software de acoplamiento molecular e importe el archivo PDB optimizado. En AutoDockTools, haga clic en Editar | Eliminar agua para eliminar las moléculas de agua. Haga clic en Editar | Añadir hidrógenos | Añadir para añadir átomos de hidrógeno a la proteína y al ligando²⁹.
5. En AutoDockTools, establezca la barra de receptores en receptor.pdbqt y la barra de ligandos en ligand.pdbqt. Abra el archivo pdbqt. para ver los sitios de unión de la proteína y el ligando y establecer el tamaño y la posición de la caja de acoplamiento para garantizar que pueda encerrar completamente la proteína receptora y el compuesto del ligando. En AutoDockTools, haga clic en Cuadrícula | Defina el cuadro de cuadrícula para establecer las coordenadas centrales y las dimensiones del cuadro y utilice los valores predeterminados para el acoplamiento molecular. Los marcos de acoplamiento se ordenarán automáticamente en orden descendente de energías de enlace.
6. Abra el archivo de resultados y registre el valor óptimo de energía de enlace. Las energías de enlace más bajas indican una unión más estable. Utilice el software de visualización molecular para cargar el archivo de resultados. Ajuste la vista y el color para mostrar claramente la interacción ligando-receptor.

9. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos en el software de análisis y visualización de datos científicos y representar todos los datos como la media ± SEM. Utilice el ANOVA de dos factores de medidas repetidas para realizar comparaciones entre grupos antes y después de la administración del fármaco. Emplee el ANOVA de un factor para realizar comparaciones entre más de dos grupos.
2. Tome el valor de P < 0.05 como estadísticamente significativo.

Resultados de las pruebas conductuales en el modelo de depresión en ratas inducida por CRS

Resultados de la prueba de preferencia de sacarosa
Al inicio del estudio, no hubo diferencia en el coeficiente de preferencia de sacarosa entre los grupos (P > 0,05). Después de 28 días de intervención, el coeficiente de preferencia de sacarosa del grupo CRS fue significativamente menor que el del grupo CON (P < 0,05), mientras que los grupos F y QZF mostraron coeficientes significativamente más altos en comparación con el grupo CRS (ambos P < 0,01). Los resultados indicaron que las ratas estresadas presentaron síntomas anhedónicos típicos, que se aliviaron con el tratamiento con F y QZF (Figura 2A).

Resultados de peso corporal
Antes de la inducción del SRC, no se observaron diferencias significativas entre los grupos (P > 0,05). Después de 4 semanas de estrés, la tasa de crecimiento del peso corporal del grupo CRS fue significativamente menor que la del grupo CON (P < 0,01), mientras que los grupos F y QZF exhibieron tasas de crecimiento significativamente más altas que el grupo M (P < 0,001, P < 0,01). Estos hallazgos indican que el estrés interrumpió el metabolismo fisiológico normal en ratas, y los grupos F y QZF mostraron mejoras y correcciones significativas en sus perfiles metabólicos anormales (Figura 2B).

Resultados de pruebas de campo abierto
Después de 28 días de intervención, no hubo diferencia significativa en la distancia total de la prueba de campo abierto entre los cuatro grupos (P > 0,05) (Figura 2D). En comparación con el grupo CON, el tiempo de permanencia en el área central del grupo CRS se redujo significativamente (P < 0,01). En comparación con el grupo CRS, el tiempo de permanencia en el área central de los grupos F y QZF se incrementó significativamente (ambos P < 0,01). No hubo diferencia significativa entre los grupos de tratamiento (P > 0,05) (Figura 2C,E).

Resultados de la prueba de natación forzada
Después de 28 días de intervención, el grupo CRS mostró un tiempo de inmovilidad significativamente mayor en comparación con el grupo CON (P < 0,0001). En comparación con el grupo CRS, los grupos F y QZF mostraron tiempos de inmovilidad significativamente reducidos (P < 0,05, P < 0,001) (Figura 2F).

Predicción de farmacología de red

Redes de destino con supuestos compuestos
Para construir la red de objetivos hipotéticos compuestos QZF, primero seleccionamos 1.020 objetivos hipotéticos de QZF, que fueron recopilados y visualizados como objetivos compuestos por el software de análisis de redes. La red mostró 1.184 nodos y 8.728 bordes (Figura 3)³².

QZF y detección de objetivos de depresión
Un total de 17.947 objetivos relacionados con la depresión fueron recuperados de la base de datos GeneCards, exhibiendo una puntuación de relevancia promedio de 1.105. Posteriormente, se seleccionaron objetivos con una puntuación de relevancia superior a 1,105 (n = 5.048) para un análisis posterior de los datos. Se construyó un diagrama de Venn con 1.020 objetivos de QZF para obtener 612 objetivos comunes (OGEs) (Figura 4A). Los 612 objetivos comunes se importaron a la base de datos STRING para su análisis, y la red PPI contenía 607 nodos y 14.375 bordes (Figura 4B), y los OGE se importaron al software de análisis de red para obtener la red de interacción.

Cribado de los principales genes diana
El análisis de módulos utilizando el complemento MCODE identificó el módulo de clúster con la puntuación más alta, que tenía una puntuación MCODE de 54,19029³¹. Identificamos 64 objetivos clave dentro del módulo concentrador de clúster que son críticos para los efectos antidepresivos de QZF (Figura 4C). Con el complemento CytoNCA, seleccionamos nodos altamente conectados en función de tres métricas de centralidad: Centralidad de grado (DC), Centralidad de cercanía (CC) y Centralidad de intermediación (BC). En concreto, la centralidad de grado mide el número de conexiones directas que tiene un nodo dentro de la red. La centralidad de cercanía cuantifica el recíproco de la longitud de ruta promedio más corta entre un nodo y todos los demás nodos, lo que indica la eficiencia con la que un nodo puede acceder a otros. La centralidad de intermediación evalúa la frecuencia con la que un nodo aparece en las rutas más cortas entre todos los pares de nodos, lo que refleja su papel mediador. Sobre la base de estas métricas, construimos la red central e identificamos los 10 nodos más conectados: BCL2, AKT1, IL6, BCL2L1, MTOR, CASP3, TP53, STAT3, NFKB1 y HIF1A (Figura 4D). Tras el filtrado de datos, realizamos un análisis de enriquecimiento funcional de estos 10 genes diana clave para dilucidar aún más sus funciones biológicas.

Análisis de enriquecimiento de GO
El análisis de enriquecimiento de GO arrojó un total de 2.783 ítems anotados, de los cuales 2.385 mostraron significación estadística. Este análisis influyó predominantemente en las categorías de procesos biológicos (BP), función molecular (MF) y componentes celulares (CC). En concreto, la categoría GO-BP abarcó 2.450 ítems, de los cuales 1.926 se consideraron estadísticamente significativos. La categoría de función molecular (GO-MF) identificó 184 ítems, de los cuales 117 mostraron significación estadística. La categoría de componente celular (GO-CC) reveló 149 ítems, de los cuales 59 fueron estadísticamente significativos (Figura 5).

Análisis de enriquecimiento de KEGG
El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG identificó un total de 156 vías asociadas con los 10 objetivos clave, y 119 de estas vías demostraron significación estadística. Las figuras ilustran las 20 vías principales con las puntuaciones de enriquecimiento más altas (Figura 6). La eliminación de algunas enfermedades asociadas dejó dos vías de señalización, las vías de señalización HIF-1 y JAK-STAT, que se predijeron como vías clave para QZF y la depresión.

Principales redes de vías diana para QZF y Depresión
Para dilucidar la relación mecanicista entre QZF y sus efectos sobre la depresión, desarrollamos una red de interacción fundamental TCM-compuesto-objetivo-vía (Figura 7). Utilizando software de análisis de redes, visualizamos la ruta de señalización con el valor p más significativo junto con sus objetivos asociados. El grafo de red resultante constaba de 93 nodos y 218 bordes. Además, generamos un diagrama de Sankey para representar genes clave y sus compuestos activos correspondientes, centrándonos específicamente en las vías de señalización del núcleo HIF-1 y JAK-STAT (Figura 8).

Acoplamiento molecular
Se adoptó el análisis de acoplamiento molecular para corroborar la especificidad del compuesto. Esta técnica evalúa la afinidad de unión entre un ligando y su proteína diana, donde las magnitudes más bajas de energía de unión indican una interacción más fuerte y una mayor proximidad del ligando a su sitio de unión³³. Los resultados revelaron que las energías de unión fueron de -8,7 kcal/mol para HIF1A y Glycyrrhiza flavonol A, -8,5 kcal/mol para STAT3 y Ginsenósido rh2, -7,6 Kcal/mmol para BCL2 e Isolicoflavonol, -6,8 Kcal/mol para MTOR y Licochalcona B, -6,7 Kcal/mol para AKT1 y Kaempferol, y -5,2 Kcal/mol para IL6 y ácido linolénico.

En general, los resultados del acoplamiento molecular demostraron que los compuestos exhibieron una fuerte afinidad de unión para sus objetivos. La energía de enlace de cada proteína se visualiza de la siguiente manera: el patrón de dibujos animados blanco representa el receptor de proteína, el azul es el ligando de molécula pequeña, la línea punteada amarilla indica el enlace de hidrógeno formado entre el ligando y el receptor, el verde representa el sitio de unión del enlace de hidrógeno entre el receptor de proteína y el ligando de molécula pequeña, y los números significan las distancias de enlace de hidrógeno, lo que implica que la unión entre el ligando y el receptor es altamente estable (Figura 9)³⁴.

Figura 1: Diagrama de flujo de agrupamiento y pruebas de comportamiento para ratas experimentales. Abreviaturas: CRS = estrés crónico de restricción; QZF (Q) = qiangzhifang; F = fluoxetina; OFT = prueba de campo abierto; FST = prueba de natación forzada; SPT = prueba de preferencia de sacarosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Efectos de QZF en el modelo de depresión de ratas inducida por CRS. (A) Nivel de consumo de sacarosa (%) en el día 0 y el día 28. (B) Peso corporal (g) en el día 0 y el día 28. (C) Trazado de las trayectorias de las ratas en la prueba de campo abierto en la semana 4. (D) Distancia total a campo abierto en los días 0 y 28. (E) El tiempo de permanencia en el área central de OFT en cada grupo en la semana 4. ** P < 0,01 indica una diferencia significativa entre los grupos F y QZF en comparación con el grupo CRS. (F) El tiempo de inmovilidad de FST (%) en cada grupo en la semana 4. * P < 0,01 indica una diferencia significativa entre el grupo F en comparación con el grupo CRS. P < 0,001 indica que el grupo QZF mostró diferencias significativas en comparación con el grupo CRS. Abreviaturas: CRS = estrés crónico de restricción; QZF = qiangzhifang. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Red QZF-Compound-Target. Los triángulos verdes denotan las medicinas tradicionales chinas en QZF; los círculos denotan los componentes de las medicinas tradicionales chinas; Los rombos denotan los objetivos. Las flechas rosas indican los componentes comunes de varias hierbas medicinales chinas. A (MOL000211) se relaciona con Bai shao y Zhi gan cao; B (MOL000358) se asocia con Bai shao, Chuan bei mu, Gu zhi y Ren shen; C (MOL000359) se conecta con Bai shao, Chuan bei mu y Gui zhi; D (MOL000422) pertenece a Bai shao, Zhi gan cao y Ren shen; E (MOL000492) es relevante para Bai shao y Gu zhi. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Identificación de los objetivos de intersección y cribado de los objetivos principales. (A) Diagrama de Venn de los objetivos comunes de QZF y depresión. Los círculos de color verde claro representan las proteínas objetivo de los ingredientes activos de QZF; Los círculos azules denotan proteínas asociadas con la depresión. Las áreas superpuestas, donde se cruzan los dos colores, ilustran las proteínas compartidas, con un total de 612. (B) Red PPI de QZF y depresión. (C) Análisis MCODE. D) Los 10 principales objetivos básicos. Abreviaturas: QZF = qiangzhifang; PPI = interacción proteína-proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Histograma para el análisis de enriquecimiento de GO de objetivos comunes. Las barras verdes representan procesos biológicos; las barras rojas representan las funciones moleculares; Las barras azules representan los componentes celulares. La altura de cada barra refleja el recuento de genes asociado con el término GO correspondiente. Abreviatura: GO = Ontología de genes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Vías de enriquecimiento de KEGG de las dianas terapéuticas de QZF en la depresión. (A) Gráfico de barras de las 20 rutas principales, clasificadas por valor P. (B) Gráfico de burbujas de las 20 vías principales: el tamaño del punto indica el número de genes; La intensidad del color refleja la significación del valor P. (C) Anotación funcional de las vías KEGG. Abreviatura: KEGG = Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Red de interacción de TCM-compound-target-pathway. El rojo denota QZF y depresión, el morado designa las vías de señalización, el verde resalta las proteínas de la vía central, el amarillo identifica las medicinas tradicionales chinas dentro de QZF y el azul especifica los compuestos herbales constituyentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Diagrama de Sankey de la vía TCM-compuesto-diana para el efecto antidepresivo de QZF basado en las vías de señalización HIF-1 y JAK-STAT. Abreviaturas: QZF = qiangzhifang; MTC = Medicina tradicional china; HIF-1 = factor 1 inducible por hipoxia; JAK-STAT = Transductores de señales de quinasa activados por Janus y activadores de la transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Resultados de la validación del acoplamiento molecular. (A) Mapa de calor de la energía de unión (kcal/mol) entre los componentes representativos de QZF y las moléculas de proteína objetivo (B) Visualización de la situación de acoplamiento. Abreviatura: QZF = qiangzhifang. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Preparación de gránulos de medicina tradicional china QZF. Abreviatura: QZF = qiangzhifang. Haga clic aquí para descargar este archivo.

El CRS es un método ampliamente utilizado para establecer modelos animales de depresión. Este modelo imita el estrés psicológico crónico que se encuentra en la vida humana e induce comportamientos similares a la depresión en^ratas. En este estudio, el tubo de sujeción de ratas se construyó con plástico transparente, lo que garantiza la seguridad de los animales y permite una observación clara durante el experimento. El tubo transparente medía aproximadamente 18 cm de largo y 6 cm de diámetro y presentaba múltiples orificios de ventilación, cada uno con un diámetro de 1 cm, distribuidos uniformemente a lo largo de los lados y la tapa para proporcionar suficiente flujo de aire para las ratas. Las ratas estresadas mostraron síntomas depresivos como letargo y ojos vidriosos, junto con cambios de comportamiento característicos de la depresión. Específicamente, estos cambios incluyeron una disminución de la actividad motora en el OFT, un tiempo de inmovilidad prolongado en el FST y un menor consumo de sacarosa en el SPT. Estas manifestaciones conductuales se asemejan mucho a la bradicinesia, la anhedonia y la pérdida de interés observadas en pacientes con depresión clínica.

En el contexto del estudio de los complejos mecanismos patológicos de la depresión, la combinación de la farmacología de red y la tecnología de acoplamiento molecular proporciona una estrategia innovadora para analizar los mecanismos moleculares de los compuestos de la medicina tradicional china en el tratamiento de la depresión. Este estudio identificó HIF1A, STAT3, BCL2, MTOR, AKT1 e IL6 como los objetivos principales de QZF en el tratamiento de la depresión. Estas dianas se enriquecieron principalmente en las vías de señalización HIF-1 y JAK-STAT. Estas dos vías de señalización desempeñan un papel central en los procesos patológicos clave de la depresión, como la neuroinflamación, el estrés oxidativo y la apoptosis.

La vía de señalización HIF-1, que sirve como mecanismo regulador central para el metabolismo celular del oxígeno, desempeña un papel crucial en varios procesos fisiológicos, incluida la neuroprotección, las respuestas antioxidantes al estrés y la angiogénesis³⁶. Las investigaciones indican que el tejido cerebral de las personas con depresión exhibe un microambiente hipóxico pronunciado y lesiones por estrés oxidativo, que están estrechamente asociadas con la activación de respuestas neuroinflamatorias y el desequilibrio de los neurotransmisores³⁷. La investigación de Semenza demuestra que, en condiciones hipóxicas, HIF-1α regula al alza los genes asociados con el metabolismo del oxígeno y los mecanismos de defensa antioxidante, incluido el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la eritropoyetina (EPO) y los genes mitocondriales. En consecuencia, esto mejora la función mitocondrial, promueve la formación de microvasos cerebrales, aumenta el suministro de oxígeno al tejido cerebral y reduce la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS)³⁸.

Otros estudios experimentales demuestran que la deficiencia de HIF-1α aumenta notablemente la susceptibilidad neuronal al estrés oxidativo, desencadenando así una activación anormal de la vía de señalización apoptótica³⁹. Esto conduce a un aumento significativo de la apoptosis neuronal y al deterioro cognitivo progresivo. Por el contrario, la sobreexpresión de HIF-1α neuronal específica en modelos de ratones transgénicos aumenta significativamente tanto la supervivencia neuronal como la densidad sináptica⁴⁰. Estos hallazgos no solo corroboran el papel crítico de HIF-1α en el mecanismo de defensa antioxidante, sino que también destacan su posible importancia terapéutica en la mejora de la función cerebral a través de la promoción de la plasticidad neuronal, la remodelación y la optimización de la arquitectura sináptica. Además, la vía de señalización HIF-1 antagoniza la vía de transducción de señales NF-κB, lo que conduce a una reducción en la producción de citocinas inflamatorias IL-6 y TNF-α, supresión de la neuroinflamación y la exhibición de potenciales efectos neuroprotectores y antidepresivos⁴¹.

En particular, se ha confirmado que Glycyrrhiza flavonol A, uno de los componentes activos de QZF, exhibe propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. En este estudio, los datos de acoplamiento molecular revelan que la liquiritigenina A exhibe una alta afinidad de unión a la proteína HIF-1α, alcanzando -8,7 kcal/mol. Este hallazgo indica fuertemente que Glycyrrhiza flavonol A, puede dirigirse directamente a HIF-1α, modulando su estabilidad proteica o actividad transcripcional. En consecuencia, regula la expresión de genes implicados en el metabolismo del oxígeno y la defensa antioxidante dentro de la vía de señalización HIF-1, mejorando así la supervivencia neuronal en condiciones hipóxicas y aliviando el daño neuronal asociado a la depresión.

La vía de señalización JAK-STAT sirve como eje central para la transducción de señales de citocinas y desempeña un papel fundamental en varios procesos biológicos, incluida la regulación de la inflamación, la modulación de la respuesta inmune y la supervivencia neuronal^42,43. Numerosas investigaciones han demostrado que la patogénesis de la depresión está estrechamente relacionada con la desregulación de la vía de señalización JAK-STAT⁴⁴. Un metaanálisis realizado por Dowlati et al. reveló que, en comparación con controles sanos, los niveles séricos de citocinas proinflamatorias como IL-6 y TNF-α aumentaron significativamente en pacientes con depresión y se correlacionaron positivamente con la gravedad de los síntomas depresivos⁴⁵. En concreto, estos factores proinflamatorios son capaces de activar la vía JAK-STAT, provocando así una respuesta inflamatoria. Este proceso no solo induce daño directo a las neuronas y a las células gliales, sino que también compromete la estructura y función sináptica, lo que en última instancia exacerba los deterioros cognitivos y emocionales de los pacientes⁴⁶.

Además, la activación excesiva de la vía JAK-STAT está fuertemente asociada con la apoptosis neuronal. La fosforilación sostenida de STAT3 regula al alza la expresión de genes proapoptóticos, incluidos los miembros de la familia de las caspasas, lo que en última instancia resulta en la pérdida neuronal. Además, la activación aberrante de esta vía perjudica la neurogénesis en la región del hipocampo y disminuye la plasticidad sináptica, exacerbando así los déficits neurofuncionales⁴⁷. En este estudio, el ginsenósido Rh2, un componente activo importante de QZF, mostró una afinidad de unión significativa con la proteína STAT3 en el análisis de acoplamiento molecular. Sobre la base de estos hallazgos, el ginsenósido Rh2 puede aliviar eficazmente las respuestas neuroinflamatorias al inhibir específicamente la activación de STAT3 y, por lo tanto, reducir la producción y liberación de citocinas proinflamatorias⁴⁸.

Además de las dos vías de señalización principales, HIF-1 y JAK-STAT, este estudio identificó las interacciones sinérgicas entre otros componentes activos y objetivos durante la acción antidepresiva de QZF. BCL2, una proteína antiapoptótica canónica, desempeña un papel esencial en el mantenimiento de la supervivencia celular y la supresión de las vías de señalización apoptótica⁴⁹. En QZF, el isolicoflavonol exhibe propiedades antioxidantes y antiapoptóticas al dirigirse y activar específicamente la proteína BCL2, inhibiendo así eficazmente la apoptosis neuronal, protegiendo las neuronas y mejorando las alteraciones neuropatológicas asociadas con la depresión. Además, la vía de señalización MTOR aberrante en pacientes con depresión está fuertemente asociada con la disfunción neuronal⁵⁰. Los estudios han demostrado que la licochalcona B promueve el crecimiento y la supervivencia neuronal, mejora la plasticidad sináptica y la conectividad funcional al modular la vía de señalización MTOR⁵¹, ejerciendo así un efecto antidepresivo. Además, el flavonoide natural kaempferol, caracterizado por sus potentes actividades antioxidantes y antiinflamatorias, activa específicamente la vía de señalización AKT1. A través de la regulación de múltiples moléculas clave aguas abajo, no solo promueve la supervivencia neuronal, sino que también acelera la recuperación funcional, proporcionando así un apoyo molecular adicional para los efectos antidepresivos de QZF.

En resumen, este estudio utilizó la farmacología de red y el acoplamiento molecular para predecir las vías terapéuticas, los objetivos principales y los componentes activos efectivos de QZF en el tratamiento de la depresión. El efecto antidepresivo de QZF se validó en un modelo de rata de depresión, lo que sugiere que puede ejercer sus efectos antidepresivos modulando múltiples vías de señalización, incluidas HIF-1 y JAK-STAT, y dirigiéndose a procesos patológicos clave como la neuroinflamación, el estrés oxidativo y la apoptosis. Este hallazgo no solo profundiza nuestra comprensión de los mecanismos patológicos que subyacen a la depresión, sino que también proporciona una base teórica y nuevos objetivos terapéuticos para la aplicación de fórmulas de la medicina tradicional china en el tratamiento de la depresión. Sin embargo, este estudio tiene ciertas limitaciones. Los mecanismos sinérgicos de múltiples componentes en QZF aún no se han dilucidado completamente, y los procesos metabólicos y las interacciones de estos componentes in vivo requieren más investigación. La investigación futura podría integrar experimentos in vitro e in vivo con tecnologías avanzadas como la cromatografía líquida, la secuenciación de alto rendimiento y la integración multiómica para identificar de manera integral y precisa los objetivos y vías clave asociados con los efectos antidepresivos de QZF, verificando y ampliando así las predicciones realizadas a través de la farmacología en red.

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

La investigación contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82374311), el Proyecto de Construcción de la Disciplina Clave de la Teoría Básica de la Medicina Tradicional China (MTC) de Alto Nivel de la Administración Estatal de Medicina Tradicional China (zyyzdxk-2023118), el Proyecto Nacional de Construcción de Estudios de Expertos en Medicina Tradicional China (Carta Nacional de Educación en Medicina China No.75) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2022LZY016). Los gránulos de QZF fueron preparados por el Departamento de Productos Farmacéuticos del Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shandong.