Farmacologia della rete e convalida dei meccanismi antidepressivi di Qiangzhifang in un modello di ratto con depressione indotta da stress da contenzione cronica

Questo studio ha valutato l'efficacia antidepressiva di Qiangzhifang in un modello di ratto di depressione indotta da stress da contenzione cronica e ha chiarito il suo effetto regolatorio sulle vie HIF-1 e JAK-STAT mediante farmacologia di rete e analisi di docking molecolare.

La depressione è un disturbo psichiatrico complesso che pone sfide significative al trattamento. Il Qiangzhifang (QZF), un composto utilizzato nella medicina tradizionale cinese, dimostra una potenziale efficacia clinica nel trattamento della depressione. Tuttavia, i meccanismi d'azione e i principi attivi della QZF non sono stati completamente chiariti. L'obiettivo principale di questo studio è stato quello di chiarire i principi attivi efficaci e i potenziali meccanismi molecolari del QZF per l'attenuazione della depressione integrando le previsioni farmacologiche della rete con le validazioni sperimentali.

Abbiamo adottato un modello di ratto con stress da contenzione cronica (CRS) e condotto test comportamentali come il test in campo aperto (OFT), il test delle preferenze per il saccarosio (SPT) e il test del nuoto forzato (FST) per valutare gli effetti terapeutici del QZF sulla depressione. Per quanto riguarda i parametri comportamentali, il gruppo QZF ha mostrato una massa corporea, un rapporto di preferenza per il saccarosio e un tempo di residenza della zona centrale significativamente più elevati rispetto al gruppo modello (P < 0,01, P < 0,01, P < 0,01) e un tempo di immobilizzazione significativamente ridotto nel test di nuoto forzato (P < 0,001). La farmacologia di rete e gli studi di docking molecolare suggeriscono che QZF può avere effetti antidepressivi modulando le vie HIF-1 e JAK-STAT, con geni bersaglio chiave tra cui AKT1, IL-6, MTOR e TP53, implicati nell'infiammazione, nella neuroprotezione e nell'apoptosi. In conclusione, questo studio offre nuove intuizioni sulla modernizzazione e lo sviluppo dei composti della medicina cinese per il trattamento completo della depressione.

La depressione, una sfida pervasiva per la salute globale, è caratterizzata da un umore basso persistente, riduzione dell'interesse e del piacere e disturbi cognitivi e neurologici¹. Come riportato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità, la depressione colpisce circa 380 milioni di persone in tutto il mondo e si prevede che questa cifra aumenterà². Essendo un disturbo mentale complesso e multifattoriale, la depressione influisce sulla qualità della vita dei pazienti e rappresenta un notevole onere economico e medico per la società, caratterizzata da un'elevata incidenza, tassi di recidiva e tassi di disabilità³.

L'eziologia della depressione è complessa, con meccanismi precisi non ancora completamente compresi. Con il progredire della ricerca in questo campo, fattori come la neuroinfiammazione, lo stress ossidativo e l'apoptosi hanno attirato un'attenzione significativa. Gli studi indicano che i pazienti con depressione mostrano livelli elevati di citochine pro-infiammatorie come il TNF e l'interleuchina-1β rispetto agli individui sani, e una maggiore prevalenza di depressione si osserva in quelli con condizioni infiammatorie⁴. Nello stress ossidativo, le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono sovraprodotte in risposta a stimoli dannosi, travolgendo le difese antiossidanti dell'organismo e portando a uno squilibrio tra i sistemi ossidativo e antiossidante, causando così danni ai tessuti. L'elevato stress ossidativo nella depressione può aumentare la perossidazione lipidica ed esacerbare il danno ai geni cellulari e alle proteine, influenzando la funzione neuronale e contribuendo alla degenerazione neuronale, all'apoptosi e alla ridotta plasticità⁵. Inoltre, le alterazioni osservate nelle presentazioni cliniche, nei marcatori biochimici e nelle strutture cerebrali nei pazienti con depressione sono legate all'apoptosi. Gli studi di imaging rivelano una riduzione del volume e dell'atrofia dell'ippocampo nei pazienti con depressione, con l'apoptosi neuronale che potenzialmente gioca un ruolo fondamentale in questi cambiamenti⁶.

Attualmente, il trattamento farmacologico è l'approccio principale per la gestione della depressione, con inibitori selettivi della ricaptazione della serotonina (SSRI) e inibitori della ricaptazione della noradrenalina (NRI) frequentemente impiegati nella pratica clinica⁷. Tuttavia, questi farmaci sono accompagnati da effetti avversi significativi. Oltre ai sintomi del sistema nervoso centrale come mal di testa e insonnia, la maggior parte degli antidepressivi mostra anche comunemente effetti collaterali gastrointestinali, tra cui nausea e diarrea ^8,9. Alcuni antidepressivi possono anche causare disfunzioni sessuali¹⁰, che influiscono gravemente sui risultati del trattamento e riducono l'aderenza ai farmaci tra i pazienti con depressione¹¹. Inoltre, l'efficacia di questi farmaci è limitata per alcuni pazienti. Recenti studi di metabolomica hanno indicato che le differenze individuali nel microbiota intestinale possono influenzare l'efficacia dei farmaci¹². Pertanto, lo sviluppo di trattamenti più sicuri ed efficaci rimane un obiettivo critico nella ricerca sulla depressione.

Le formulazioni della medicina tradizionale cinese (MTC) hanno dimostrato un potenziale significativo nel trattamento della depressione, attribuito ai loro effetti sinergici che coinvolgono più componenti, bersagli e percorsi¹³. La MTC postula che il vigoroso qi Yang è essenziale per mantenere la vitalità del corpo. Pertanto, il professor Yuanqing Ding, sfruttando i principi unici della diagnosi e del trattamento della MTC e una vasta esperienza clinica, ha proposto che "yang yu shen tui" sia la patogenesi fondamentale della depressione. Sulla base di questo concetto, ha sviluppato il Qiangzhifang (QZF) per affrontare specificamente questa patogenesi¹⁴. L'applicazione clinica della QZF nel trattamento della depressione ha dimostrato un'efficacia significativa, con un tasso di efficacia totale del 71,43%¹⁵. La QZF è composta da vari materiali medicinali tradizionali cinesi, tra cui Ramulus cinnamomi (gui zhi, GZ), Polygala tenuifolia (yuan zhi, YZ), Alpinia oxyphylla miq (yi zhi ren, YZR), Paeonia lactiflora (bai shao, BS), Fritillariae cirrhosae bulbus (chuan bei mu, CBM), Panax ginseng (ren shen, RS), Rhodiola rosea L (hong jing tian, HJT) e liquirizia (gan cao, GC) (File supplementare 1). Gli studi hanno dimostrato che la Polygala tenuifolia è ricca di saponine e mostra effetti neuroprotettivi¹⁶. Allo stesso modo, la coppia di erbe Ramulus Cinnamomi-Paeonia lactiflora dimostra una potenziale efficacia nell'alleviare il dolore e la depressione¹⁷. Inoltre, le saponine totali del ginseng possono ridurre i livelli di citochine proinfiammatorie dell'ippocampo, migliorare il comportamento depressivo e attenuare il danno al nervo ippocampale nei ratti¹⁸. La liquirizia contiene principalmente triterpenoidi e flavonoidi. I flavonoidi totali (LF) della liquirizia possono svolgere un ruolo antidepressivo migliorando il comportamento depressivo, modulando la via di segnalazione BDNF/TrkB e migliorando la plasticità sinaptica¹⁹. Tuttavia, i meccanismi specifici alla base degli effetti antidepressivi della QZF rimangono poco chiari, limitandone così l'applicazione diffusa.

Pertanto, il nostro studio mira a stabilire un modello di ratto con depressione CRS, dimostrare l'effetto terapeutico di QZF sulla depressione nei ratti attraverso esperimenti comportamentali e valutare sistematicamente il meccanismo antidepressivo di QZF utilizzando la farmacologia di rete e la tecnologia di docking molecolare²⁰. Chiarendo i componenti attivi e i potenziali bersagli della QZF, è possibile localizzare con precisione i bersagli principali della depressione. Riteniamo che, esplorando a fondo il meccanismo d'azione della QZF, non solo possiamo fornire opzioni di trattamento più sicure ed efficaci per i pazienti con depressione, ma anche fornire una base scientifica per l'applicazione della MTC nel trattamento della depressione.

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Etico per gli Esperimenti Animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shandong (numero di approvazione: YYLW2023000327) e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio emessa dal National Institutes of Health. In questo esperimento, abbiamo utilizzato 40 ratti Wistar maschi sani, di grado SPF, con un peso corporeo medio di (140 ± 10) g (Figura 1). Consulta la Tabella dei materiali per un elenco di tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Modello di depressione del ratto

1. Stabulazione e raggruppamento degli animali
   1. Entra nella stanza dell'allevamento con gli animali e numerali utilizzando uno strumento per marcare la coda.
   2. Alloggiare i ratti individualmente in gabbie, mantenendo una temperatura di 21 ± 2 °C e un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore.
   3. Acclimatare i ratti in laboratorio per 7 giorni, fornendo loro l'accesso ad libitum a cibo e acqua mentre li maneggiano quotidianamente per l'adattamento.
   4. Dopo il periodo di acclimatazione, misurare il peso corporeo ed eseguire i test di preferenza del saccarosio (SPT) e i test in campo aperto (OFT).
   5. Sulla base dei dati sperimentali, dividere i ratti in quattro gruppi, assicurandosi che ogni gruppo sia composto da 10 ratti: il gruppo di controllo (CON), il gruppo modello (CRS), il gruppo QZF e il gruppo fluoxetina (F).
2. Istituzione di un modello di ratto con stress da restrizione cronica (CRS)
   1. Costruisci il dispositivo di ritenuta per ratti. Scegli un tubo di plastica trasparente con un diametro e una lunghezza adatti alla taglia²¹ del ratto, che consenta al topo di stare in piedi e girarsi all'interno impedendo la fuga. Utilizzare un perforatore elettrico per saldatore per creare fori sui lati del tubo di plastica e sul coperchio per garantire una corretta circolazione dell'aria.
   2. Posizionare delicatamente i ratti nei dispositivi di contenzione (ad eccezione di quelli del gruppo C) 1 ora dopo la somministrazione intragastrica quotidiana del farmaco, assicurandosi che siano in una posizione comoda.
   3. Privare tutti i gruppi di ratti di cibo e acqua durante il periodo di contenzione. Al termine del periodo di contenzione, fornisci loro cibo e acqua in abbondanza in modo uniforme. Fissare la durata della ritenuta giornaliera a 6 ore (dalle 9:30 alle 15:30) e mantenerla per 28 giorni consecutivi.

2. Intervento farmacologico

1. Somministrare tramite gavage: 1 mL di soluzione/100 g di peso corporeo, fluoxetina (2,7 mg·^kg-1·^giorno-1) e QZF (2 g·^kg-1·^giorno-1)²². Fornire ai gruppi C e CRS una soluzione fisiologica normale equivalente per il controllo a variabile singola.
   NOTA: La somministrazione giornaliera del farmaco è stata condotta alle 08:00, iniziando in modo sincrono con la definizione del modello e persistendo per tutto il periodo di modellazione di 28 giorni.

3. Test di preferenza del saccarosio (SPT)

1. Privare i ratti di cibo e acqua per 24 ore prima dell'inizio dell'esperimento.
2. Preparare una soluzione acquosa di saccarosio all'1% e versare la soluzione e l'acqua pura nelle bottiglie degli animali da esperimento per la pesatura. Misurare il consumo di acqua pura e acqua di saccarosio pesando le bottiglie prima e dopo l'esperimento.
3. Metti una bottiglia di soluzione di saccarosio e una bottiglia di acqua pura alla presa d'acqua di ogni coperchio della gabbia per topi, una a sinistra e una a destra, per il libero accesso all'acqua potabile. Per evitare che i ratti favoriscano un lato per l'assunzione di acqua, invertire le posizioni delle bottiglie d'acqua a sinistra e a destra dopo 30 minuti dall'inizio dell'esperimento.
4. Dopo 1 ora dall'esperimento, rimuovere tutte le bottiglie d'acqua, pesarle prontamente e registrare il consumo di soluzione di saccarosio e acqua pura. Calcola il rapporto di preferenza settimanale per il saccarosio utilizzando la formula:
   Valore di preferenza del saccarosio = × 100%

4. Misurazione del peso corporeo

1. Pesare i ratti settimanalmente al loro ingresso in laboratorio e fissare l'ora fissa per la pesatura alle 7:00 del mattino. Stabilisci questo programma per facilitare l'osservazione delle variazioni di peso corporeo.

5. Test in campo aperto (OFT)

1. Prima dell'inizio dell'esperimento, acclimatare i ratti nella stanza comportamentale per 1 ora e regolare l'illuminazione nella scatola in campo aperto per garantire una distribuzione uniforme. Verifica che i ratti siano chiaramente visibili nel software di tracciamento.
2. Utilizza il sistema di tracciamento e analisi video per dividere la superficie inferiore della scatola per campi aperti (50 cm x 50 cm x 50 cm) in nove griglie quadrate di uguale area. Designate le otto griglie adiacenti alle pareti come area periferica e la griglia centrale come area centrale.
3. Posiziona il topo nella zona centrale della scatola in campo aperto. Registra il movimento del ratto per 5 minuti utilizzando il sistema di tracciamento video.
4. Dopo aver testato ogni ratto, pulire la camera con etanolo al 75% per rimuovere l'odore residuo e prevenire interferenze con il comportamento del ratto successivo. Inserire la distanza totale (mm) delle attività in campo aperto e il numero di voci nella griglia centrale nei record OFT.

6. Test di nuoto forzato (FST)

NOTA: L'esperimento di nuoto forzato nel ratto comprende un pre-esperimento e un esperimento formale. Condurre il pre-esperimento 24 ore prima dell'esperimento formale, seguendo la stessa procedura, con il ratto che nuota per 15 minuti.

1. Trasportare gli animali da esperimento nella stanza comportamentale almeno 30 minuti prima dell'esperimento per consentire loro di acclimatarsi all'ambiente.
2. Preparare un cilindro cilindrico in plexiglass trasparente (50 cm di altezza, 20 cm di diametro) e riempirlo d'acqua a 23-25 °C. Regola la profondità dell'acqua in base al peso dell'animale, assicurandoti che la coda dell'animale rimanga a una certa distanza dal fondo del cilindro.
3. Posiziona lentamente i ratti nel cilindro dell'acqua e rimani in silenzio durante l'esperimento. Attiva la telecamera e il sistema di acquisizione del segnale. Osservare e registrare la durata dell'immobilità fluttuante entro 300 s. Togliete immediatamente i ratti dall'acqua e asciugateli al termine dell'esperimento.
4. Dopo ogni sessione, sostituisci l'acqua per evitare qualsiasi influenza sul ratto successivo.

7. Predizione farmacologica di rete

1. Raccolta di composti QZF e bersagli putativi
   1. Accedi al database (https://old.tcmsp-e.com/)²³ della farmacologia dei sistemi di medicina tradizionale cinese (TCMSP), al database HERB²⁴ e al database TCMID (https://www.bidd.group/TCMID/). Usa gli otto nomi TCM in QZF, tra cui GZ, YZ, YZR, BS, CBM, RS, HJT e ZGC, come parole chiave per cercare composti attivi e bersagli delle erbe. Raccogli gli obiettivi dal TCMSP e dalla previsione degli obiettivi svizzeri (http://www.swisstargetprediction.ch/). Impostare il valore del filtro su Probabilità* > 0.
      NOTA: Tipicamente, gli ingredienti sono stati inclusi come principi attivi in base alle loro caratteristiche farmacocinetiche: biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e caratteristiche farmaco-simili (DL) ≥ 0,18²⁵.
2. Previsione dei bersagli della malattia
   1. Cerca la parola chiave "depressione" nel database GeneCards (https://www.genecards.org/), ottieni i target genetici associati alla depressione, scarica il foglio di calcolo elettronico dei target della malattia, filtra i punteggi genetici superiori al valore medio e compila un elenco di target di depressione²⁶.
3. Rete farmaco-componente-malattia-bersaglio
   1. Crea un nuovo foglio di calcolo e popolalo con gli obiettivi relativi alla depressione e gli obiettivi dei farmaci nella stessa colonna. Fare clic su Start nella barra dei menu | Formattazione condizionale | Regole per l'evidenziazione delle celle | Valori duplicati. Selezionare un formato (ad esempio, "Riempimento rosso chiaro") nella finestra di dialogo visualizzata²⁷, fare clic su OK per visualizzare i risultati.
   2. Avvia il software di analisi della rete e importa il file del foglio di calcolo facendo clic su File nella barra dei menu | Importazione | Rete. Ottimizza l'aspetto della rete regolando le dimensioni e il colore dei nodi nel pannello Stile situato nel pannello di controllo a sinistra. Eseguire l'analisi della topologia di rete facendo clic su Strumenti nella barra dei menu | Analizza la rete²⁷.
4. Rete di interazione proteina-proteina (PPI)
   1. Accedi allo strumento Jvenn (https://jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html), carica separatamente i bersagli del composto e i bersagli della malattia, traccia i geni sovrapposti (OGE) tra i presunti bersagli del composto e i bersagli della malattia. Fai clic sui numeri nell'immagine e copiali in un foglio di calcolo e scarica l'immagine del diagramma di Venn.
   2. Accedere al database STRING (https://stringdb.org/)²⁸ e inserire gli OGEs dal foglio di calcolo nel database. In particolare, incollare l'elenco dei bersagli sovrapposti anti-depressione QZF nella finestra di dialogo Elenco dei nomi . Seleziona Homo sapiens nella sezione Organismi e clicca su CERCA | CONTINUA. Seleziona l'opzione Esportazioni dalla barra del titolo e scarica la tabella riassuntiva della rete PPI in entrambi i formati PNG e TSV²⁹.
5. Screening delle proteine core
   1. Avviare il software di analisi della rete (https://cytoscape.org/). Quindi, nella barra dei menu, fai clic su File | Importazione | Rete | File per importare il file in formato TSV generato nel passaggio^{precedente 30}.
   2. Seleziona Analizza rete nella barra dei menu e fai clic sul pulsante Analizza . Quindi, visualizza i risultati dell'analisi e comprendi le caratteristiche strutturali generali della rete, come il numero di nodi, il numero di bordi e il grado medio.
   3. Seleziona App | App Manager nella barra dei menu. Cercare MCODE, installare il plug-in ed eseguirlo per ottenere la destinazione dell'hub. Quindi, cerca CytoNCA, installa il plug-in e concentrati sui tre valori dei parametri di Grado, Centralità di vicinanza (CC) e Centralità di interezza (BC). In base ai valori di questi parametri, selezionare i nodi con grado più elevato, CC e BC, che sono generalmente considerati proteine core³¹.
6. Analisi dell'arricchimento dell'ontologia genica (GO) e dell'Enciclopedia di Kyoto dei geni e dei genomi (KEGG)
   1. Aprire la piattaforma bioinformatica (https://www.omicshare.com/). Fare clic sul menu Strumenti , trovare lo strumento di conversione del gene ID e fare clic su di esso. Quindi, fai clic sul pulsante di caricamento del file , seleziona il passaggio generato sul nucleo dei geni target e scarica l'elenco degli ID file convertiti.
   2. Nel menu Strumenti , fare clic sullo strumento di analisi dell'arricchimento dinamico KEGG . Carica l'elenco degli ID del gene. Nell'opzione Specie , seleziona Homo sapiens e fai clic sul pulsante Invia .
   3. Nel menu Strumenti, fare clic sullo strumento di analisi dell'arricchimento GO dinamico | Opzione genetica | Opzione di caricamento del file. Seleziona l'elenco degli ID del gene e nell'opzione Specie, seleziona Homo sapiens. Selezionare il tipo di GO per l'analisi, tra cui Processo biologico, Funzione molecolare e Componente cellulare.
   4. Per i risultati dell'analisi dell'arricchimento KEGG e GO, impostare la soglia di filtraggio su p < 0,05. Disponi i conteggi in ordine decrescente.

8. Verifica dell'attracco molecolare

1. Visita il sito web di PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Inserisci i composti target nella barra di ricerca. Clicca sulla struttura 2D e scaricala.
2. Aprire il database PDB (https://www.Rcsb.org/). Selezionare la struttura cristallina ad alta risoluzione e contenente il legante originale. Scaricare il file PDB.
3. Per ottimizzare la struttura della proteina, aprire il software di visualizzazione molecolare. Carica il file PDB scaricato. Rimuovi le molecole d'acqua e salva il file PDB ottimizzato.
4. Apri il software di docking molecolare e importa il file PDB ottimizzato. In AutoDockTools, fare clic su Modifica | Elimina acqua per eliminare le molecole d'acqua. Fare clic su Modifica | Aggiungere idrogeni | Aggiungere per aggiungere atomi di idrogeno alla proteina e al ligando²⁹.
5. In AutoDockTools, impostare la barra del recettore su receptor.pdbqt e la barra del ligando su ligand.pdbqt. Aprire il file pdbqt. per visualizzare i siti di legame della proteina e del ligando e impostare le dimensioni e la posizione della docking box per garantire che possa racchiudere completamente la proteina del recettore e il composto del ligando. In AutoDockTools, fare clic su Griglia | Definite Casella griglia (Grid Box ) per impostare le coordinate centrali e le dimensioni della scatola e utilizzare i valori predefiniti per l'aggancio molecolare. I telai di aggancio saranno automaticamente ordinati in ordine decrescente di energie di legame.
6. Aprire il file dei risultati e registrare il valore ottimale dell'energia di legame. Energie di legame più basse indicano un legame più stabile. Utilizzare il software di visualizzazione molecolare per caricare il file dei risultati. Regola la vista e il colore per visualizzare chiaramente l'interazione ligando-recettore.

9. Analisi statistica

1. Condurre analisi statistiche nel software di analisi e visualizzazione dei dati scientifici e rappresentare tutti i dati come media ± SEM. Utilizzare l'ANOVA bidirezionale a misure ripetute per i confronti tra i gruppi prima e dopo la somministrazione del farmaco. Utilizzare l'ANOVA unidirezionale per i confronti tra più di due gruppi.
2. Prendi il valore di P < 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati dei test comportamentali nel modello di depressione del ratto indotta da CRS

Risultati del test di preferenza del saccarosio
Al basale, non c'era differenza nel coefficiente di preferenza del saccarosio tra i gruppi (P > 0,05). Dopo 28 giorni di intervento, il coefficiente di preferenza per il saccarosio del gruppo CRS era significativamente inferiore a quello del gruppo CON (P < 0,05), mentre i gruppi F e QZF hanno mostrato coefficienti significativamente più alti rispetto al gruppo CRS (entrambi P < 0,01). I risultati hanno indicato che i ratti stressati mostravano sintomi anedonici tipici, che sono stati alleviati dal trattamento con F e QZF (Figura 2A).

Risultati del peso corporeo
Prima dell'induzione della CRS, non sono state osservate differenze significative tra i gruppi (P > 0,05). Dopo 4 settimane di stress, il tasso di crescita del peso corporeo del gruppo CRS era significativamente inferiore a quello del gruppo CON (P < 0,01), mentre i gruppi F e QZF hanno mostrato tassi di crescita significativamente più elevati rispetto al gruppo M (P < 0,001, P < 0,01). Questi risultati indicano che lo stress ha interrotto il normale metabolismo fisiologico nei ratti, con i gruppi F e QZF che hanno mostrato miglioramenti e correzioni significativi nei loro profili metabolici anormali (Figura 2B).

Risultati dei test in campo aperto
Dopo 28 giorni di intervento, non c'era alcuna differenza significativa nella distanza totale del test in campo aperto tra i quattro gruppi (P > 0,05) (Figura 2D). Rispetto al gruppo CON, il tempo trascorso nell'area centrale del gruppo CRS è stato significativamente ridotto (P < 0,01). Rispetto al gruppo CRS, il tempo trascorso nell'area centrale dei gruppi F e QZF è stato significativamente aumentato (sia P < 0,01). Non c'è stata alcuna differenza significativa tra i gruppi di trattamento (P > 0,05) (Figura 2C, E).

Risultati del test di nuoto forzato
Dopo 28 giorni di intervento, il gruppo CRS ha mostrato un tempo di immobilità significativamente aumentato rispetto al gruppo CON (P < 0,0001). Rispetto al gruppo CRS, i gruppi F e QZF hanno mostrato tempi di immobilità significativamente ridotti (P < 0,05, P < 0,001) (Figura 2F).

Previsione farmacologica di rete

Reti target con ipotesi composite
Per costruire la rete di bersagli ipotetici composti QZF, abbiamo prima esaminato 1.020 bersagli ipotetici di QZF, che sono stati raccolti e visualizzati come bersagli composti dal software di analisi della rete. La rete mostrava 1.184 nodi e 8.728 bordi (Figura 3)³².

Screening del QZF e del target della depressione
Un totale di 17.947 obiettivi relativi alla depressione sono stati recuperati dal database GeneCards, mostrando un punteggio medio di rilevanza di 1,105. I target con un punteggio di rilevanza superiore a 1,105 (n = 5.048) sono stati successivamente selezionati per un'ulteriore analisi dei dati. È stato costruito un diagramma di Venn con 1.020 bersagli da QZF per ottenere 612 bersagli comuni (OGE) (Figura 4A). I 612 bersagli comuni sono stati importati nel database STRING per l'analisi, e la rete PPI conteneva 607 nodi e 14.375 bordi (Figura 4B), e gli OGEs sono stati importati nel software di analisi della rete per ottenere la rete di interazione.

Screening dei geni bersaglio principali
L'analisi del modulo utilizzando il plug-in MCODE ha identificato il modulo cluster con il punteggio più alto, che aveva un punteggio MCODE di 54,19029³¹. Abbiamo identificato 64 bersagli chiave all'interno del modulo hub cluster che sono fondamentali per gli effetti antidepressivi di QZF (Figura 4C). Utilizzando il plug-in CytoNCA, abbiamo effettuato lo screening dei nodi altamente connessi in base a tre metriche di centralità: Centralità del grado (DC), Centralità della vicinanza (CC) e Centralità dell'interposizione (BC). In particolare, il grado di centralità misura il numero di connessioni dirette che un nodo ha all'interno della rete. La centralità della vicinanza quantifica il reciproco della lunghezza media del percorso più breve tra un nodo e tutti gli altri nodi, indicando l'efficienza con cui un nodo può accedere agli altri. La centralità dell'betweenness valuta la frequenza con cui un nodo appare nei percorsi più brevi tra tutte le coppie di nodi, riflettendo il suo ruolo di mediazione. Sulla base di queste metriche, abbiamo costruito la rete principale e identificato i primi 10 nodi più connessi: BCL2, AKT1, IL6, BCL2L1, MTOR, CASP3, TP53, STAT3, NFKB1 e HIF1A (Figura 4D). Dopo il filtraggio dei dati, abbiamo eseguito l'analisi dell'arricchimento funzionale su questi 10 geni bersaglio chiave per chiarire ulteriormente le loro funzioni biologiche.

Analisi dell'arricchimento GO
L'analisi dell'arricchimento GO ha prodotto un totale di 2.783 elementi annotati, di cui 2.385 con significatività statistica. Questa analisi ha influenzato prevalentemente le categorie dei processi biologici (BP), della funzione molecolare (MF) e dei componenti cellulari (CC). In particolare, la categoria GO-BP comprendeva 2.450 articoli, di cui 1.926 ritenuti statisticamente significativi. La categoria delle funzioni molecolari (GO-MF) ha identificato 184 item, di cui 117 che mostrano una significatività statistica. La categoria dei componenti cellulari (GO-CC) ha rivelato 149 item e, tra questi, 59 erano statisticamente significativi (Figura 5).

Analisi dell'arricchimento KEGG
L'analisi dell'arricchimento dei percorsi KEGG ha identificato un totale di 156 percorsi associati ai 10 obiettivi chiave, di cui 119 che dimostrano una significatività statistica. Le cifre illustrano i primi 20 percorsi con i punteggi di arricchimento più elevati (Figura 6). La rimozione di alcune malattie associate ha lasciato due vie di segnalazione, HIF-1 e JAK-STAT, che si prevedeva fossero vie chiave per la QZF e la depressione.

Principali reti di percorsi bersaglio per QZF e depressione
Per chiarire la relazione meccanicistica tra QZF e i suoi effetti sulla depressione, abbiamo sviluppato una rete di interazione TCM-composto-bersaglio-via (Figura 7). Utilizzando un software di analisi della rete, abbiamo visualizzato il percorso di segnalazione con il valore p più significativo insieme ai suoi obiettivi associati. Il grafo di rete risultante comprendeva 93 nodi e 218 bordi. Inoltre, abbiamo generato un diagramma di Sankey per rappresentare i geni chiave e i loro corrispondenti composti attivi, concentrandoci in particolare sulle vie di segnalazione principali HIF-1 e JAK-STAT (Figura 8).

Docking molecolare
L'analisi di docking molecolare è stata adottata per convalidare la specificità del bersaglio del composto. Questa tecnica valuta l'affinità di legame tra un ligando e il suo bersaglio proteico, dove entità inferiori dell'energia di legame indicano un'interazione più forte e una maggiore vicinanza del ligando al suo sito di legame³³. I risultati hanno rivelato che le energie di legame erano -8,7 kcal/mol per HIF1A e Glycyrrhiza flavonol A, -8,5 kcal/mol per STAT3 e Ginsenoside rh2, -7,6 Kcal/mmol per BCL2 e Isolicoflavonolo, -6,8 Kcal/mol per MTOR e Licochalcone B, -6,7 Kcal/mol per AKT1 e Kaempferol e -5,2 Kcal/mol per IL6 e acido linolenico.

Nel complesso, i risultati del docking molecolare hanno dimostrato che i composti hanno mostrato una forte affinità di legame per i loro bersagli. L'energia di legame di ciascuna proteina è visualizzata come segue: il modello bianco del cartone animato rappresenta il recettore della proteina, quello blu è il ligando della piccola molecola, la linea tratteggiata gialla indica il legame idrogeno formato tra il ligando e il recettore, il verde rappresenta il sito di attacco del legame idrogeno tra il recettore della proteina e il ligando della piccola molecola, e i numeri indicano le distanze di legame idrogeno, il che implica che il legame tra il ligando e il recettore è altamente stabile (Figura 9)³⁴.

Figura 1: Diagramma di flusso dei test di raggruppamento e comportamentali per ratti sperimentali. Abbreviazioni: CRS = stress cronico da contenzione; QZF (Q) = qiangzhifang; F = fluoxetina; OFT = prova in campo aperto; FST = prova di nuoto forzato; SPT = test di preferenza del saccarosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Effetti della QZF sul modello di depressione del ratto indotta da CRS. (A) Livello di consumo di saccarosio (%) il giorno 0 e il giorno 28. (B) Peso corporeo (g) il giorno 0 e il giorno 28. (C) Grafico delle traiettorie dei ratti nel test in campo aperto alla settimana 4. (D) Distanza totale in campo aperto nei giorni 0 e 28. (E) La durata del soggiorno nell'area centrale di OFT in ciascun gruppo alla settimana 4. ** P < 0,01 indica una differenza significativa tra i gruppi F e QZF rispetto al gruppo CRS. (F) Il tempo di immobilità FST (%) in ciascun gruppo alla settimana 4. * P < 0,01 indica una differenza significativa tra il gruppo F rispetto al gruppo CRS. P < 0,001 indica che il gruppo QZF ha mostrato differenze significative rispetto al gruppo CRS. Abbreviazioni: CRS = stress cronico da contenzione; QZF = qiangzhifang. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rete QZF-Compound-Target. I triangoli verdi denotano le medicine tradizionali cinesi in QZF; i cerchi denotano i componenti delle medicine tradizionali cinesi; I rombi denotano i bersagli. Le frecce rosa indicano i costituenti comuni di diverse erboristerie cinesi. A (MOL000211) si riferisce a Bai shao e Zhi gan cao; B (MOL000358) è associato a Bai Shao, Chuan bei mu, Gu zhi e Ren shen; C (MOL000359) si collega con Bai Shao, Chuan bei mu e Gui zhi; D (MOL000422) riguarda Bai Shao, Zhi gan cao e Ren shen; E (MOL000492) è rilevante per Bai Shao e Gu zhi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Identificazione dei bersagli di intersezione e screening dei bersagli principali. (A) Diagramma di Venn dei bersagli comuni di QZF e depressione. I cerchi verde chiaro rappresentano le proteine bersaglio dei principi attivi di QZF; I cerchi blu denotano proteine associate alla depressione. Le aree sovrapposte, dove i due colori si intersecano, illustrano le proteine condivise, per un totale di 612. (B) Rete PPI di QZF e depressione. (C) Analisi MCODE. (D) I primi 10 obiettivi principali. Abbreviazioni: QZF = qiangzhifang; PPI = interazione proteina-proteina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Istogramma per l'analisi dell'arricchimento GO di bersagli comuni. Le barre verdi rappresentano i processi biologici; le barre rosse rappresentano le funzioni molecolari; Le barre blu rappresentano i componenti cellulari. L'altezza di ogni barra riflette la conta genica associata al termine GO corrispondente. Abbreviazione: GO = Ontologia Genetica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Percorsi di arricchimento KEGG dei bersagli terapeutici di QZF nella depressione. (A) Grafico a barre dei primi 20 percorsi, classificati in base al valore P. (B) Grafico a bolle delle prime 20 vie: la dimensione del punto indica il numero di geni; l'intensità del colore riflette il significato del valore P. (C) Annotazione funzionale delle vie KEGG. Abbreviazione: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Rete di interazione tra TCM e il composto del percorso bersaglio. Il rosso indica la QZF e la depressione, il viola le vie di segnalazione, il verde evidenzia le proteine della via principale, il giallo identifica le medicine tradizionali cinesi all'interno della QZF e il blu specifica i composti erboristici costituenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Diagramma di Sankey della via TCM-compound-target-pathway per l'effetto antidepressivo di QZF basato sulle vie di segnalazione HIF-1 e JAK-STAT. Abbreviazioni: QZF = qiangzhifang; MTC = Medicina Tradizionale Cinese; HIF-1 = fattore 1 inducibile dall'ipossia; JAK-STAT = Trasduttori del segnale chinasico attivato da Giano e attivatori della trascrizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Risultati della convalida del docking molecolare. (A) Mappa termica dell'energia di legame (kcal/mol) tra componenti rappresentativi di QZF e molecole proteiche bersaglio (B) Visualizzazione della situazione di attracco. Abbreviazione: QZF = qiangzhifang. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Preparazione dei granuli della medicina tradizionale cinese QZF. Abbreviazione: QZF = qiangzhifang. Clicca qui per scaricare questo file.

La CRS è un metodo ampiamente utilizzato per stabilire modelli animali di depressione. Questo modello imita lo stress psicologico cronico incontrato nella vita umana e induce comportamenti simili alla depressione nei ratti³⁵. In questo studio, il tubo di contenzione per ratti è stato costruito in plastica trasparente, garantendo la sicurezza degli animali e consentendo un'osservazione chiara durante l'esperimento. Il tubo trasparente misurava circa 18 cm di lunghezza e 6 cm di diametro e presentava più fori di ventilazione, ciascuno con un diametro di 1 cm, distribuiti uniformemente lungo i lati e il coperchio per fornire un flusso d'aria sufficiente per i ratti. I ratti stressati mostravano sintomi depressivi come letargia e occhi vitrei, insieme a cambiamenti comportamentali caratteristici della depressione. In particolare, questi cambiamenti includevano una diminuzione dell'attività motoria nell'OFT, un tempo di immobilità prolungato nell'FST e una riduzione del consumo di saccarosio nell'SPT. Queste manifestazioni comportamentali assomigliano molto alla bradicinesia, all'anedonia e alla perdita di interesse osservate nei pazienti con depressione clinica.

Nel contesto dello studio dei complessi meccanismi patologici della depressione, la combinazione di farmacologia di rete e tecnologia di docking molecolare fornisce una strategia innovativa per analizzare i meccanismi molecolari dei composti della medicina tradizionale cinese nel trattamento della depressione. Questo studio ha identificato HIF1A, STAT3, BCL2, MTOR, AKT1 e IL6 come i bersagli principali della QZF nel trattamento della depressione. Questi bersagli sono stati arricchiti principalmente nelle vie di segnalazione HIF-1 e JAK-STAT. Queste due vie di segnalazione svolgono un ruolo centrale nei processi patologici chiave della depressione, come la neuroinfiammazione, lo stress ossidativo e l'apoptosi.

La via di segnalazione HIF-1, che funge da meccanismo di regolazione centrale per il metabolismo cellulare dell'ossigeno, svolge un ruolo cruciale in vari processi fisiologici, tra cui la neuroprotezione, le risposte allo stress antiossidante e l'angiogenesi³⁶. La ricerca indica che il tessuto cerebrale degli individui con depressione mostra un pronunciato microambiente ipossico e lesioni da stress ossidativo, che sono strettamente associati all'attivazione delle risposte neuroinfiammatorie e allo squilibrio dei neurotrasmettitori³⁷. La ricerca di Semenza dimostra che in condizioni di ipossia, HIF-1α sovraregola i geni associati al metabolismo dell'ossigeno e ai meccanismi di difesa antiossidante, tra cui il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), l'eritropoietina (EPO) e i geni mitocondriali. Di conseguenza, ciò migliora la funzione mitocondriale, promuove la formazione di microvasi cerebrali, aumenta l'apporto di ossigeno al tessuto cerebrale e riduce l'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS)³⁸.

Ulteriori studi sperimentali dimostrano che il deficit di HIF-1α aumenta notevolmente la suscettibilità neuronale allo stress ossidativo, innescando così un'attivazione anomala della via di segnalazione apoptotica³⁹. Ciò porta ad un aumento significativo dell'apoptosi neuronale e al progressivo declino cognitivo. Al contrario, la sovraespressione neurone-specifica di HIF-1α in modelli murini transgenici aumenta significativamente sia la sopravvivenza neuronale che la densità sinaptica⁴⁰. Questi risultati non solo confermano il ruolo critico di HIF-1α nel meccanismo di difesa antiossidante, ma evidenziano anche il suo potenziale significato terapeutico nel migliorare la funzione cerebrale attraverso la promozione del rimodellamento della plasticità neurale e l'ottimizzazione dell'architettura sinaptica. Inoltre, la via di segnalazione HIF-1 antagonizza la via di trasduzione del segnale NF-κB, portando a una riduzione della produzione di citochine infiammatorie IL-6 e TNF-α, alla soppressione della neuroinfiammazione e all'esibizione di potenziali effetti neuroprotettivi e antidepressivi⁴¹.

In particolare, è stato confermato che il flavonolo A della glicirriza, uno dei componenti attivi di QZF, presenta proprietà antiossidanti e antinfiammatorie. In questo studio, i dati di docking molecolare rivelano che la liquiritigenina A mostra un'elevata affinità di legame con la proteina HIF-1α, raggiungendo -8,7 kcal/mol. Questa scoperta indica fortemente che il flavonolo A della glicirriza può colpire direttamente HIF-1α, modulando la sua stabilità proteica o l'attività trascrizionale. Di conseguenza, regola l'espressione dei geni coinvolti nel metabolismo dell'ossigeno e nella difesa antiossidante all'interno della via di segnalazione HIF-1, migliorando così la sopravvivenza neuronale in condizioni di ipossia e alleviando il danno neurale associato alla depressione.

La via di segnalazione JAK-STAT funge da hub centrale per la trasduzione del segnale delle citochine e svolge un ruolo fondamentale in vari processi biologici, tra cui la regolazione dell'infiammazione, la modulazione della risposta immunitaria e la sopravvivenza neuronale^42,43. Ricerche approfondite hanno dimostrato che la patogenesi della depressione è strettamente legata alla disregolazione della via di segnalazione JAK-STAT⁴⁴. Una meta-analisi condotta da Dowlati et al. ha rivelato che, rispetto ai controlli sani, i livelli sierici di citochine pro-infiammatorie come IL-6 e TNF-α erano significativamente aumentati nei pazienti con depressione e correlati positivamente con la gravità dei sintomi depressivi⁴⁵. In particolare, questi fattori pro-infiammatori sono in grado di attivare la via JAK-STAT, suscitando così una risposta infiammatoria. Questo processo non solo induce danni diretti ai neuroni e alle cellule gliali, ma compromette anche la struttura e la funzione sinaptica, esacerbando in ultima analisi i disturbi cognitivi ed emotivi nei pazienti⁴⁶.

Inoltre, l'eccessiva attivazione della via JAK-STAT è fortemente associata all'apoptosi neuronale. La fosforilazione prolungata di STAT3 sovraregola l'espressione dei geni pro-apoptotici, compresi i membri della famiglia delle caspasi, con conseguente perdita neuronale. Inoltre, l'attivazione aberrante di questa via compromette la neurogenesi nella regione ippocampale e diminuisce la plasticità sinaptica, esacerbando così i deficit neurofunzionali⁴⁷. In questo studio, il ginsenosiside Rh2, un importante componente attivo di QZF, ha mostrato una significativa affinità di legame con la proteina STAT3 nell'analisi di docking molecolare. Sulla base di questi risultati, il ginsenosidio Rh2 può alleviare efficacemente le risposte neuroinfiammatorie inibendo specificamente l'attivazione di STAT3 e riducendo così la produzione e il rilascio di citochine pro-infiammatorie⁴⁸.

Oltre alle due principali vie di trasduzione del segnale, HIF-1 e JAK-STAT, questo studio ha identificato le interazioni sinergiche tra altri componenti attivi e bersagli durante l'azione antidepressiva di QZF. BCL2, una proteina anti-apoptotica canonica, svolge un ruolo essenziale nel sostenere la sopravvivenza cellulare e nel sopprimere le vie di segnalazione apoptotica⁴⁹. Nella QZF, l'isolicoflavonolo mostra proprietà antiossidanti e anti-apoptotiche mirando e attivando specificamente la proteina BCL2, inibendo così efficacemente l'apoptosi neuronale, proteggendo i neuroni e migliorando le alterazioni neuropatologiche associate alla depressione. Inoltre, la via di segnalazione aberrante di MTOR nei pazienti con depressione è fortemente associata alla disfunzione neuronale⁵⁰. Gli studi hanno dimostrato che il licocalcone B promuove la crescita e la sopravvivenza neuronale, migliora la plasticità sinaptica e la connettività funzionale modulando la via di segnalazione MTOR⁵¹, esercitando così un effetto antidepressivo. Inoltre, il flavonoide naturale kaempferolo, caratterizzato dalle sue potenti attività antiossidanti e antinfiammatorie, attiva in modo specifico la via di segnalazione AKT1. Attraverso la regolazione di più molecole chiave a valle, non solo promuove la sopravvivenza neuronale, ma accelera anche il recupero funzionale, fornendo così un ulteriore supporto molecolare per gli effetti antidepressivi della QZF.

In sintesi, questo studio ha utilizzato la farmacologia di rete e il docking molecolare per prevedere i percorsi terapeutici, i bersagli principali e i componenti attivi efficaci del QZF nel trattamento della depressione. L'effetto antidepressivo di QZF è stato convalidato in un modello di depressione nel ratto, suggerendo che potrebbe esercitare i suoi effetti antidepressivi modulando molteplici vie di segnalazione, tra cui HIF-1 e JAK-STAT, e mirando a processi patologici chiave come la neuroinfiammazione, lo stress ossidativo e l'apoptosi. Questa scoperta non solo approfondisce la nostra comprensione dei meccanismi patologici alla base della depressione, ma fornisce anche una base teorica e nuovi obiettivi terapeutici per l'applicazione delle formule della medicina tradizionale cinese nel trattamento della depressione. Tuttavia, questo studio presenta alcune limitazioni. I meccanismi sinergici di più componenti nella QZF devono ancora essere completamente chiariti e i processi metabolici e le interazioni di questi componenti in vivo richiedono ulteriori indagini. La ricerca futura potrebbe integrare esperimenti in vitro e in vivo con tecnologie avanzate come la cromatografia liquida, il sequenziamento ad alto rendimento e l'integrazione multi-omica per identificare in modo completo e accurato i bersagli chiave e i percorsi associati agli effetti antidepressivi del QZF, verificando e ampliando così le previsioni effettuate attraverso la farmacologia di rete.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

La ricerca è stata sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China (82374311), dal Progetto di costruzione della disciplina chiave della teoria di base della medicina tradizionale cinese (MTC) dell'Amministrazione statale della medicina tradizionale tradizionale cinese (TCM) (zyyzdxk-2023118), dal National Traditional Chinese Experts Studio Construction Project (National Chinese Medicine Education Letter No.75) e dalla Natural Science Foundation della provincia di Shandong (ZR2022LZY016). I granuli QZF sono stati preparati dal Dipartimento di Prodotti Farmaceutici, Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shandong.