Bu yöntem, ışık görüntülemenin mevcut olmadığı sistemde nükleer ve sitoplazmik translokasyon ile ilgili protein ticareti alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, ışık görüntülemesi dahil olmadan temporal protein hareketinin incelenmesi için genel bir protokol olarak uygulanabilen olmasıdır. 20-24 saat önce virüs enfeksiyonu tohum 5 kez 10 4 insan embriyonik akciğer veya HEL lif patlama hücreleri iyi bir dört kuyu 11 milimetre sendeledi slayt ve büyüme orta gece kuluçka için 37 derece santigrat yüzde beş karbondioksit ile.
Kültür ortamının dökülmesini önlemeye özen gösterirken hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için slaytı iyice sallamak önemlidir. Ertesi gün, süpernatants değiştirin böylece 70-80 yüzde kabarık kültürler Orta 199 ile, hücre başına 410 plak şekillendirme birimleri içeren, ve sallayarak 37 derece santigrat slayt yerleştirin, bir saat boyunca. Kuluçka sonunda, supernatants taze büyüme ortamı ile değiştirin ve uygun deneysel enfeksiyon dönemi için kuvöz hücreleri iade.
Virüs bulaşmış hücrelerin immünoffloresan boyama için, hızlı pbs ile üç kez hücreleri yıkayın. Bunu, pbs'de %4'lük paraformaldehitin 200 mikrolitresinde 8-10 dakikalık bir kuluçka. Fiksasyon sonunda, yıkama başına 200 mikrolitre PBS ile hücreleri üç kez yıkayın ve beş ila on dakika boyunca iyi başına yüzde 0,2 non-iyonik yüzey aktif 100 mikrolitre ile hücreleri permeabilize.
Permeabilize hücreleri gösterildiği gibi PBS'de üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her kuyuya 200 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin. Daha sonra, iki saatlik oda sıcaklığında kuluçka için her kuyuya ilgi birincil antikor uygun konsantrasyonekleyin. Kuluçka sonunda, taze engelleme tamponunda üç, on dakikalık yıkar ile herhangi bir bağlanmamış birincil antikor kaldırın ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her kuyuya uygun bir ikincil antikor ekleyin, ışıktan korunan.
Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi bir engelleme tampon hücreleri üç kez yıkayın, PBS bir yıkama ardından ve her kuyuda DAPI ile takviye antifade montaj ortamı bir damla ekleyin. Sonra slayt üzerine bir kapak kayma yerleştirin ve şeffaf oje ile kapak eğimmühür. Kapak fişini monte ederken hafif basınç uygulamak, fazla montaj ortamını ortadan kaldırarak yüksek kaliteli görüntülerin elde edilmesini sağlamaya yardımcı olur.
Etiketli, enfekte hücrelerin konfokal görüntülemesi için uygun ikincil antikor ve DAPI dalga boylarını seçin ve görüntü biçimini ortalama sekiz satırla 1, 024 piksele ayarlayın. Daha sonra 100x hedefi altında dört kuyulu slayt üzerinde her iyi görüntü. Çok sayıda hücre saymak için, 40x hedefi altında aynı kuyudaki ardışık alanlardan beş ila on görüntü elde edin.
ICP0'nin nükleer ve sitoplazmik dağılımını analiz etmek için, projeyi konfokal uygulama yazılımında açın ve bir görüntü seçin. Miktar sekmesini açın ve Araçlar menüsünden İlgi Bölgelerini Sırala'yı seçin. Draw Line'ı seçin ve çözümlenecek hücre boyunca uzunlamasına bir çizgi çizin.
Bir histogram ilgi hem protein için çizgi boyunca floresan yoğunluğu gösteren görünür, ve DAPI. Arka plan boyama dayanarak, her deneyde proteinin alt hücresel dağılımının analizi için ilgi proteinyoğunluğu için sabit bir eşik kurmak. Protein sinyali, ortalama olarak, nükleer bölgedeki eşiğin altındaysa, ancak DAPI sınırının ötesinde ki eşiğin üzerindeyse, protein sinyalini ağırlıklı olarak sitoplazma içinde bulunan olarak sınıflandırın.
Protein sinyali çekirdek boyunca eşiğin üzerinde yse ve DAPI sinyalinin sınırının ötesindeyse, protein sinyalini çekirdek artı sitoplazmik lokalizasyon olarak grupla. Eğer protein sinyali çekirdekteki eşiğin üzerindeyse, ancak ortalama olarak DAPI sinyal grubunun sınırının dışındaki eşiğin altındaysa, nükleer lokalizasyon olarak protein sinyali. Son olarak, her örnekten 200'den fazla enfekte hücreyi farklı enfeksiyon zaman noktalarında ayıklave zaman içinde ilgi proteininin hareketini göstermek için bir çubuk grafikteki verileri çizin.
Gösterildiği gibi, bu yöntem ilgi proteinlerin nükleer-sitoplazmik translokasyon analizini kolaylaştırır. Örneğin, enfekte hücre proteini sıfır veya viral enfeksiyon ilerledikçe ICP0 hücre altı dağılımı değişir. Enfeksiyon sırasında ICP0 ticareti için gerekli unsurları anlamak için, ICP0 hareketleri Wild Type ve Mutant Type Herpes Simplex Virus 1-enfekte hücrelerde farklı enfeksiyon evrelerinde izlenebilir, enfeksiyon farklı zaman noktalarında ICP0 alt hücresel dağılımının değerlendirilmesi sağlayan.
Virions hücrelere eşit erişim esahip böylece monolayer kültürleri kullanmayı hatırlamak ve enfeksiyon ilerlemesi arasında ve virüsler içinde karşılaştırılabilir böylece virüs başlığına göre enfeksiyon çokluğu normalleştirmek için önemlidir. Her gelişmeden sonra, bu teknik biyoloji ve hücre virolojisi alanlarındaaraştırmacıların hücre popülasyonu içindeki ilgi çekici proteinlerin zamansal hücre altı lokalizasyonlarını inceleyerek protein hareketini keşfetmelerinin önünü açmıştır.
