Bu derlemede, Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri, AI074420-02, Burroughs Wellcome Araştırmacı Ödülü, BKC için Hirschl&#39;ın Kariyer Bilim Adamı Ödülü ve NSF Biophotonics Bilim ve Teknoloji Merkezi, Kooperatif Sözleşmesi PHY012099, TH UCD Sağlık Sistemi Araştırma Ödülü tarafından desteklenen UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Bu yöntem bildirilen araştırma <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner ve ark Bilim 323: 1743-1747 (2009)</a> . 1. Genel bakış HIV hücre-hücre yayılmasını başlangıçta donör hücreleri ve birincil CD4 + T lenfositleri acceptor hücreleri 1,2,3 olarak HIV ile enfekte Jurkat hücreleri kullanılarak tarif edilmiştir. Bu çalışmalarda, virüs sabit hücrelerin antikor boyama ile tespit edildi. Canlı hücrelerde virüs hücreye transfer izlemek için, biz HIV, HIV Gag-iGFP 4 olarak adlandırılan bir rekombinant, bulaşıcı moleküler klon istifade eder. MA ve CA etki alanları arasında Gag protein dahili takılı yeşil floresan proteininin (GFP) taşır. HIV Bu moleküler klon yardımcı virüs için gerek kalmadan enfektivite korur. Bu klon yapılan virüs partikülleri stoichiometrically hücreleri arasındaki viral montaj ve transfer izlemek için güçlü bir floresan bir sinyal sağlayarak, yeşil floresan protein ile yüklenir. Ile birlikte kullanıldığında asal hücre izleme floresan boyalar, alıcı hücreleri girdi donör hücreleri ayrımcılık ve bir HIV virüslü bir T hücre bulaşmamış T hücre 5 transfer görselleştirmek için izin olabilir. Mühürlü bir gaz geçirgen görüntüleme odasında kültüre ise Virolojik sinaps oluşumu ve sonra virüs bir hücreden diğerine transferi canlı hücreler görülebilir. (Gün 1) 2. HIV Gag iGFP hazırlanması Jurkat T Hücreler transfekte <ol><li> Dikkatle 2 x 10 5 ve 8 x 10 5 hücreleri / Jurkat kültür medya (RPMI 1640,% 10 fetal sığır serumu ml arasında konsantrasyonda hücreleri koruyarak insan CD4 + T hücre hattı Jurkat (ATCC, Manassas, VA) hazırlayın . 100 ünite / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin). Başarının Anahtarı: 8 x 10 5 hücre / mL aşan konsantrasyonlarda Jurkat hücreleri Kültür transfeksiyon verimliliğinde bir azalmaya neden olacaktır. Not: aşağıda açıklandığı gibi HIV Gag-iGFP proviral DNA T hücrelerine, bir çoğaltma yetkin insan immün yetmezlik virüsü üretim sonuçları transfeksiyon. Bunun gibi, bütün işlemleri sertifikalı biyogüvenlik düzeyi 2 + veya biyogüvenlik seviye 3 (BL2 + / BL3) doku kültürü odası, sadece eğitimli laboratuar personel tarafından yapılmalıdır. İş görüntüleme tesislerinde bulaşıcı HIV ile yerel kurumsal biyogüvenlik ofisi tarafından onaylanması gerekir. </li><li> Amaxa nucleofection yöntemi (Lonza, Walkersville, MD) kullanarak viral plazmid, HIV Gag-iGFP Jurkats Transfect. 150 10 dakika süreyle santrifüj yoluyla Pelet 5 x 10 6 hücre x g. Süpernatant aspire ve steril fosfat hücrelerin yıkayın tamponlu salin (PBS). Hücreler santrifüj ve üreticinin ek içeren, önceden ısıtılmış nucleofector çözüm V 97 mcL pelet tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonu plazmid endotoksin ücretsiz HIV Gag-iGFP (1 mcg / ml) üç mcL ekleyin ve hafifçe karıştırın. G-18 programı kullanarak, bir küvet ve nucleofect hücre süspansiyonu aktarın. Hemen antibiyotik olmadan prewarmed Jurkat kültür ortamı 3 mL hücrelere aktarın. </li><li> CD4 + hedef hücreleri virolojik sinaps için hazırlamak için, standart bir Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, İsveç) protokolünü kullanarak buffy kat insan periferik kan mononükleer hücreleri edinin. CD4 + T hücreleri, daha sonra olumsuz bir manyetik boncuk izolasyon kiti (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) kullanılarak seçilir. Bu cryogenically donma medya 5 x 10 6 cells/500 mcL (% 90 fetal sığır serum/10% DMSO) hacimde sıvı N2 saklanabilir. Çözülmüş birincil CD4 + T hücrelerinin IL-2 10 adet / ml ile desteklenmiş RPMI% 10 FBS, kültür. </li></ol> (2. Gün) 3. HIV Gag-iGFP ve Floresan Boyalar ile Hedef Hücreler boyanması ile transfekte Jurkats Canlı Hücreler Kurtarma <ol><li> Jurkat hücreleri gecede transfeksiyon kurtarmak için izin verin. Sonra bir Ficoll hypaque yoğunluk gradiyenti malzeme üzerinde santrifüj hücresel enkaz kaldırmak. 1.5 ml, 15 ml konik bir tüp alt Ficoll-Paque koyun. Yavaşça RPMI bir 5 ml hacminde transfekte Jurkats bu degrade malzeme kaplaması. Fren kapalı olarak oda sıcaklığında, 20 dakika boyunca 400 xg&#39;de hücreler santrifüjleyin. Dikkatle bir pipet kullanarak medya / Ficoll arayüzü hücreleri kaldırmak. Yeni bir 15 ml konik tüp aktarabilirsiniz. 10 dakika için 300 xg&#39;de toplam hacmi 15 ml ve santrifüj RMPI ile hücreler sulandırınız. Iyi bir 2 cm (6 sıra plaka) 3 mL Jurkat kültür ortamı pelletini tekrar ve hücrelerin doku kültürü inkübatör dönün. </li><li> Donör hücreleri hedef hücreleri, hücre-hücre transferi deneyleri ayırt etmek için prelabel CD4 + floresan boya ile hedef hücreler. İlköğretim CD4 + T hücreleri bile etiketliKullanmadan önce ing. Biz CellTracker ve CellTrace boyalar (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile mükemmel bir başarı etiketleme T hücreleri oldu. Boya konsantrasyonu ve inkübasyon süreleri, özellikle kullanılan boya ve hücre tipine bağlı olarak optimize edilmesi gerekir iken, bir temsilci protokolü izlemektedir. Pelet 4 x 10 6 birincil CD4 + T 10 dakika için 400 xg&#39;de iplik hücreleri. 2 mL PBS 5 ml PBS ve tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın. Nihai konsantrasyonu 1.5 mcM CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) ve 37 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edin. 8 mL komple Jurkat medya ekleyin ve 10 dakika için 400 xg&#39;de santrifüj. 3 ml, 10 adet / ml, IL-2 ve geceleme doku kültürü inkübatörde ile desteklenmiş tam medya hücrelerin tekrar </li></ol> (Gün 3) 4. Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak HIV İzleme Hücre-hücre Transfer Gag-iGFP Biz rutin HIV Gag-iGFP transfekte Jurkat hücreler 48 saat sonrası transfeksiyon kullanabilirsiniz. Ancak, 24 saat gibi erken bir sürede başarıyla hücreleri kullanılır, ve 72 saat sonrası transfeksiyon gibi geç. <ol><li> Yaklaşık 48 saat sonrası transfeksiyon, HIV Gag iGFP ifade Jurkats CO ile yıkanmış sayılır 2 bağımsız medya (Invitrogen, Carlsbad, CA), ve canlı hücre görüntüleme medya (CO 2 bağımsız medya,% 10 fetal sığır serumu, yeniden süspanse 1-3 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon az 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin, 10 adet / ml, IL-2). </li><li> Benzer bir şekilde, yıkama ve 1-3 x 10 7 hücre / ml canlı hücre görüntüleme medyada bir konsantrasyon etiketli birincil CD4 + T hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Mix HIV Gag-iGFP-transfekte Jurkats birincil CD4 + T hücreleri tedavi doku kültürü, gaz geçirgen, microchamber (Ibidi, Verona, WI) bir 1:2 veya 1:03 oranında ve yük. Örneğin, HIV Gag-iGFP transfekte Jurkats etiketli birincil CD4 + T hücrelerinin yüzde 40 mcL ile 20 mcL karıştırın. Bu karışımı 50 mcL Ibidi odasına yerleştirin ve fişler ile donatıldı mühür. Fişleri, fiş / Ibidi odasına arayüzü ile parafilm sararak sabitleyin. </li></ol> 5. Mikroskopi platformlarda dikkat edilmesi gereken noktalar: dönen disk konfokal görüntüleme Hücreleri ile bir Ibidi görüntüleme odasına yerleştirdikten sonra, derhal cihazı ters bir optik mikroskop (iX71 Olympus, Merkez Vadisi, PA) üzerine monte edin. Ibidi odasında sadece uygun güvenlik kıyafetler giyiyor BL2 + eğitilmiş laboratuvar personeli tarafından mikroskop transfer edilmelidir. Canlı hücre görüntüleme genellikle istikrarlı bir 37 ° C çevre korumak için pahalı inkübasyon odaları kullanmasına rağmen, bu bir T-tipi termokupl ucu ile birlikte basit ve ekonomik bir termostatik ısıtıcı (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) kullanılarak elde edildi yanına monte Uygun sıcaklık geri bildirim için örnek. CO 2-bağımsız medya CO 2 odasının kullanımı kaçınarak, yüksek hücre canlılığı korumak sağlar bulduk . Oda sıcaklığı dalgalanmalara karşı platformu tampon ve arka plan oda ışığı engellemek için, büyük bir siyah kefen sistemi etrafında yalıtımlı bir hava cebi oluşturarak tüm mikroskop / ısıtıcı kurulum üzerinde bol dökümlü. Bu, sıcaklık değişimi ve ilişkili sıcaklık ile ilgili örnek sürüklenme büyük ölçüde azaltır, ama 30 dakika boyunca örnek montaj önce ön ısıtma gerektirir. 6. Veri Toplama, Transfer ve Görüntü İşleme Görüntüler yüksek sayısal açıklık (NA) büyük ölçüde çözünürlüğünü artırır olarak bir 60x 1.42 NA immersiyon yağı amacı (UPlanApo N, Olympus) kullanılarak alınır. 3D konfokal görüntüler oluşturmak için, tarama aynı anda tarama hızını önemli ölçüde artırmak için&gt; 800 konfokal noktalar kullanan dönen bir disk konfokal birimi (CSU-10, Yokagawa, Japonya) tarafından yapılır. Hızı, CSU-10 photobleaching ve fototoksisite azaltır hızlı, düşük ışık koşullarında görüntüleme izin için çok hassas bir elektron çarparak ücret çiftli cihazı (EMCCD, IXON + 897, Andor Technologies, İrlanda) kamera ile eşleştirilmiş. Iltifat için Floresan ışık kaynağı bir tarafından seçilen istenen dalga boyunda (488 nm) ve lazer güç mikroskop objektif (&lt;1 mW) hemen önce ölçülen dalga boyu çok ArKr iyon gaz lazer (Innova 70C, Tutarlı, Santa Clara) acousto optik ayarlanabilir filtre (AOTF), (Andor Teknolojileri). Daha photobleaching azaltmak ve toplam görüntüleme süresini uzatmak için, hızla AOTF (mikrosaniye) yeni elde edilen bir görüntüyü CCD (15-30 ms maruz) teslim ederken kamera (10-20 ms) devre dışı lazer ışını her zaman kapanır. bilgisayara. Lazer ışığı 405/488/568/647 dört bant dikroik ayna (Semrock, Rochester, NY) ile dönen disk sistemi birleştirilmiştir. Floresans emisyon 525/50 bant geçiren bir filtre tekerlek (Ludl Elektronik Ürünler, Hawthorne, NY) içinde bir filtre (Semrock) süzülür monte bEMCCD kamera ve konfokal dönen disk ünitesi etween. Z-evre (Mad City Labs, Madison, WI) dahil olmak üzere tüm donanım ve satın alma, Andor iQ v1.8 yazılımı tarafından kontrol edilir. 1,2-1,9 etrafında ikinci 3D görüntü yığınlarının satın alma hızını en üst düzeye çıkarmak için, hücre çifti hemen alan EMCCD kamera kayıt bölgesi kırpmak. Ayrıca, bazı bilgiler z pahasına, 0,45-0,75 mikron arasında büyük bir z adım satın alma hızlandırmak için kullanılır. Bu koşullar altında Görüntüleme 6 saate kadar sürebilir sürekli 20-60 dakika segmentleri kullanarak minimum photobleaching. Toplamda, her bir veri parçası genellikle 5-20 GB, on binlerce görüntü alınır alanı kaplar. Büyük veri dosyaları taşıma ve analizi kolaylaştırmak için, her bir satın alma seti Andor iQ v1.8 yazılımı kullanarak 1 Gb TIFF görüntü dosyası kesimleri olarak parçalanır ve ihraç edilmesi gerekiyor. Burada, birçok mükemmel yazılım paketleri Metamorph, Volocity ve ImageJ (biz onun varyasyon Fiji öneririz) gibi görüntü analizi için kullanılabilir. Iki floresan belirteçlerinin izlenebilir zaman, biz aynı anda bir satın alma düşürmeden her ikisi de rekor &quot;split screen modu.&quot; Her iki işaretleri, bir seferde iki farklı ArKr lazer çizgileri (genellikle 488 ve 568 nm) heyecan duyuyoruz. EMCCD kamera iki farklı görüntü ayıran bir görüntü splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK) önce doğrudan yerleştirilebilir. Her görüntü daha sonra bağımsız bir kez &quot;bölünmüş ekran&quot; etkisi yaratmak kamera floresan filtreleri (Semrock) ve öngörülen yan yana süzülür. Bu daha sonra manuel kırpma ve daha sonra görüntü işleme görüntü hizalayarak gerektirecektir. 7. Görüntü İşleme ve Veri Analizi dikkat edilmesi gereken noktalar Biz genellikle Volocity (Perkin Elmer, Waltham, MA), Macintosh bilgisayarlarda (Apple, Inc.) Görüntü analizi gerçekleştirmek. Dönen disk lazer konfokal mikroskobu görüntüleri ilk sonra Volocity ile deconvolved, photobleaching için doğru yoğunluğu ayarlanır. Gag puncta yoğunluğu ölçüm ve izleme Volocity Niceleme modülü ile yapılır. Önceden oluşmuş bir sinaps göre hareket hesaplanması gereken görüntü setleri için, otomatik bir izleme algoritması, tüm dizi boyunca sinaptik düğmesine izler istihdam edilmektedir. Otomatik parça seçme yazılımı tarafından tanımlanan faiz bölgelerin Elle muayene, yazılım, istenilen nesneyi doğru takip doğrulamak için yapılmalıdır. Çevredeki nesnelerin kontrastı çok zayıf nesneler için, manuel izleme-kare bir çerçeve temelinde yapılabilir. Volocity yazılım paketi, istenilen nesneleri içinde XYZ konumu, hacmi ve entegre sinyal ihracat sağlar. Sinaptik düğmeye merkezine hareketleri normalleştirilmesi izlenen nesnenin sinaps ve hız mesafe hesaplanır. 8. Temsilcisi Sonuçlar Karıştırma 10 ila 15 dakika içinde bir birincil CD4 kalarak HIV Gag-iGFP ifade Jurkat hücreleri + T hücreleri görselleştirmek mümkün olmalıdır. Görüntüleme bu konjugatları, bir synaspe sonra hedef hücreleri enfekte hücrelerin yanı sıra Gag puncta hareketlerini değerlendirmek. Sinaps oluşur birinin kısa bir süre sonra hedef hücre içine Gag iGFP puncta hareket gözlemleyebiliriz.

<ol>
	<li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells.">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li><li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes.">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses.">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li></ol>

Biz burada, hücre-hücre HIV transferi görselleştirmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Laboratuar ve diğerleri &#39;tarafından yapılan son araştırma, HIV baskın modu T hücreleri arasında yayılmış olabileceğini düşündürmektedir. Burada anlatılan yöntemi HIV rekombinant formu istihdam temel yapısal protein, Gag genetik olarak kodlanmış olan yeşil floresan protein etiketi taşıyan Gag iGFP, HIV adı verilen. Çünkü her virüs parçacık üretilen GFP yüksek düzeyde, HIV Bu çoğaltma yetkili klonu, gerçek zamanlı olarak bireysel virüs partikülleri takip etmek için araştırmacılar sağlar. Bu virüs, HIV montaj ve hücre-hücre transferi ile ilgili çalışmalarda özellikle yararlı olacaktır. HIV hücre-hücre transferi ile transferi oldukça verimlidir. Üç saat boyunca ko-kültür, biz rutin akış sitometri ile değerlendirilen virüs birincil T hücrelerinin% 20-30 transfer bakın. Benzer verimliliği niteliksel canlı hücre görüntüleme sırasında görülür. Viral bulaşmış T hücrelerinin hemen eş-kültür başladıktan sonra bulaşmamış birincil T hücreleri ile sinaps oluşturarak başlar. İlginç, değil tüm ilköğretim T hücreleri lazer cımbız (yayınlanmamış gözlemler, GM) ile zorla etkileşimleri rağmen, HIV ile enfekte Jurkat hücreleri ile etkileşim yeteneğine sahiptir. HIV Gag-iGFP şüphesiz hücre-hücre transferi, in vitro ve in vivo hem de en duyarlı T hücre alt grupları belirlemek için yararlı olacaktır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Jurkat T Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leukocyte buffy coats from whole blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New York Blood Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector System and Solution V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EndoFree Maxi Prep Kits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HIV Gag-iGFP plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chen Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll-Paque</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Celltracker/CellTrace Dyes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-Independent Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ibidi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlanApo N 1.42NA 60X oil objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C ArKr ion gas laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>525/50 bandpass filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ASI 400 Thermostatic Heater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nevtek</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing cell-to-cell transfer of hiv using fluorescent clones of hiv and live confocal microscopy

Kaynaştırma sevdikleri proteinler yeşil flüoresan protein, biyologlar, floresan video mikroskopi kullanılarak karmaşık hücresel süreçleri yaşayan çalışma yeteneğine sahip. Insan immün yetmezlik virüsü hücre-hücre iletim sırasında insan immün yetmezlik virüsü çekirdek protein hareketlerini izlemek için, HIV bulaşıcı bir moleküler klon bağlamında Gag protein, HIV Gag-iGFP denilen GFP etiketli. Biz viral klon video konfokal mikroskopi kullanılarak bu çalışma. Aşağıdaki görüntülenmiştir deneyde, bir insan T hücre hattı HIV Gag-iGFP transfect ve biz floresan etiketli bulaşmamış CD4 + T hücreleri virüs için hedef hücreler olarak hizmet etmek için kullanır. Hücrelerarası yapılar arasında kolayca viral üretim ve nakliye takip edebilirsiniz farklı floresan etiketleri kullanarak virolojik sinaps denir. Basit gaz geçirgen görüntüleme odaları, bize gün dakika canlı konfokal mikroskobu ile sinaps gözlemlemek için izin verir. Bu yaklaşımlar, bir hücreden diğerine hareket gibi viral proteinleri izlemek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K Görüntüleme.  Mount Sinai School of Medicine. Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

Video: Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

Cryo-Elektron Mikroskopi tarafından HIV-1 kapsid Meclisleri Yapısı ve iteratif Helisel Gerçek uzay İmar

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Ölçümü<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...