免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1蛋白核细胞质转移的时间分析

该方法有助于回答蛋白质贩运领域有关核和细胞质转移在系统内没有光成像的关键问题。该技术的主要优点是，它可以作为研究时间蛋白运动的一般协议，不涉及光成像。20至24小时前，病毒感染种子5倍10至4个人类胚胎肺或H，纤维爆炸细胞每井到4井11毫米交错滑动和生长介质，在37摄氏度下用5%的二氧化碳进行夜间孵育。

必须彻底摇动幻灯片，以确保细胞的均匀分布，同时注意避免溢出培养基。第二天，用中199替换70%至80%的汇合培养物，每个细胞包含410个斑块形成单位，并在37摄氏度的震动下放置滑梯，一小时。在孵化结束时，用新鲜生长介质替换超级细胞，将细胞返回到培养箱，以进行适当的实验感染期。

对于受病毒感染细胞的免疫荧光染色，用PBS快速清洗细胞三次。接着是200微升的8至10分钟孵育，每井PBS中甲醛为4%。在固定结束时，每次洗涤用200微升PBS洗三次细胞，用每井0.2%非离子表面活性剂的100微升对细胞进行渗透，为期5至10分钟。

如证明，在PBS中清洗渗透细胞三次，并在每井中加入200微升阻尼缓冲液，在室温下孵育一小时。接下来，将感兴趣的原抗体的适当浓度添加到每井中，进行两小时的室温孵育。在孵育结束时，用3，10分钟的新鲜阻尼缓冲液去除任何未绑定的原抗体，并在每一井中加入适当的二级抗体，在室温下孵育一小时，免受光线影响。

在孵化结束时，如所证明的，在阻塞缓冲液中清洗细胞三次，随后在PBS中清洗一次，并在每孔中加入一滴抗淡淡安装介质，并辅以DAPI。然后在滑梯上放置盖滑，用透明指甲油密封盖斜。安装盖滑时施加温和压力可去除任何多余的安装介质，有助于确保获得高质量的图像。

对于标记的受感染细胞的共生成像，选择适当的二级抗体和 DAPI 波长，将图像格式设置为 1，024 x 1，024 像素，平均行为 8。然后在 100 倍目标下的四井幻灯片上成像每个井。要计算大量单元格，请从 40 倍目标下同一井中的连续字段中获取 5 到 10 个图像。

要分析ICP0的核质和细胞质分布，在共生应用软件中打开项目并选择图像。打开"数量"选项卡，然后从"工具"菜单中选择"排序感兴趣的区域"。选择"绘制线"，并在要分析的单元格上绘制一条纵向线。

将显示一个直方图，显示感兴趣的蛋白质和 DAPI 的沿线的荧光强度。基于背景染色，为感兴趣的蛋白质的强度设置一个恒定阈值，用于分析每个实验中蛋白质的亚细胞分布。如果蛋白质信号平均低于核区域的阈值，但高于 DAPI 边界的阈值，则将蛋白质信号分类为主要位于细胞质内。

如果蛋白质信号在整个核的阈值以上，并且超过DAPI信号的边界，则将蛋白质信号分组为细胞质，加上细胞质定位。如果蛋白质信号高于核的阈值，但平均低于DAPI信号组边界外的阈值，蛋白质信号作为核定位。最后，从不同感染时间点的每个样本中列出 200 多个受感染的细胞，并在条形图中绘制数据，以说明感兴趣的蛋白质在一段时间内的运动。

如证明，该方法有助于分析感兴趣的蛋白质的核到细胞质转移。例如，受感染的细胞蛋白为零，或ICP0亚细胞分布随着病毒感染的进展而变化。为了了解感染期间ICP0贩运所需的元素，可以在不同感染阶段追踪野生型和突变型单纯疱疹病毒1感染细胞中的ICP0运动，从而可以评估ICP0在不同感染点的亚细胞分布。

重要的是要记住使用单层培养，使病毒有平等的机会进入细胞，并正常化感染的多重根据病毒标题，使感染进展是可比的病毒之间和病毒内部。每次开发后，这项技术为生物学和细胞病毒学领域的研究人员通过研究细胞群体中感兴趣的蛋白质的时间亚细胞定位来探索蛋白质运动铺平了道路。