Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (R01-DE025985) ve bir Amerikan Kanser Derneği araştırma bilim adamı Ödülü (RSG-13-383-MPC) tarafından desteklenmiştir. Bu eser, Davis de ABD Tarım Bakanlığı (2015-67015-23268 ve 2014-67015-21787) ve University of California, yeni araştırma girişimi bursu gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Dikkat: Bu yordamda kullanılan hücre hatları bulaşıcı virüs içerebilir, dikkatli olun ve yalnızca düzey 2 BSL tesis veya daha yüksek devam edin.
1. hücre hazırlık ve bakım
<ol><li>Kültür TREx-K-RTA BCBL-1 hücreleri (veya başka bir KSHV enfekte PEL hücre hatları) RPMI1640 orta % 15 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin streptomisin glutamin çözüm ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Sürekli olarak büyümeye ve 2 – 4 günde 1:4 oranında tarafından hücreleri bölmek için emin hücreleri ile %5 karbondioksit (CO2), 37 ° C'de büyümek.</li>
	<li>Hücre kültürleri iyi hücre büyümesini ve hücre kültürü yeniden başlatmak veya hücre kültür koşullar buna göre ayarlamak için tavsiye edilir Morfoloji, aksi takdirde onaylamak için her gün bir ışık mikroskobu ile izleyin.</li>
</ol>2. timidin eşitleme ve litik indüksiyon
<ol><li>Bir 10 cm Petri dish, plaka TREx-K-Rta BCBL-1 hücrelerde taze hazırlanan medya (1 x 106 hücreler/2 mL medya)</li>
	<li>200 mM timidin ekleyin (son konsantrasyonu: 2 mM) çanak, mix ve 18 h için kuluçkaya.</li>
	<li>500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve taze hazırlanmış medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Taze hazırlanmış medyada resuspend.</li>
	<li>Hücreler için 8 h S-faz çıkmak izin verir.</li>
	<li>Timidin ekleyin (son konsantrasyonu: 2 mM), mix ve 16 h için kuluçkaya.</li>
	<li>500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve taze hazırlanmış medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Taze hazırlanmış medyada resuspend.</li>
	<li>Viral reaktivasyonu ikna etmek için 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, son konsantrasyonu 20 ng/mL) ve Doksisiklin (DOX, nihai toplama 100 ng/mL) hücre kültürü ekleyin, karıştırın ve 4 h için kuluçkaya. K-Rta indüklenebilir kaset olmadan hücre hatlarında TPA (son konsantrasyonu 20 ng/mL ve sodyum bütrat (1 mM)) kullanarak yeniden etkinleştirme teşvik.</li>
	<li>500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve komple kültür medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Tam kültür medyada resuspend.</li>
	<li>Hücreler için 24 h büyümeye izin.</li>
</ol>3. fiksasyon ve Permeabilization
Not: devam etmeden önce sabitleme çözüm (% 3.7 formaldehit DEPC tedavi PBS), Dietil pyrocarbonate tedavi fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DEPC-PBS), glisin DEPC PBS olun (glycine son konsantrasyonu: 100 mM) ve permeabilizating çözüm (% 50 aseton, % 50 metanol) hazırlanır. Genellikle, her slayt en az 0,5 milyon hücre gerektirir, gerekirse çarp ve özellikle hücreleri sağlıklı olmayan ilave hücreler için arka kadar içerir.
<ol><li>Hücreleri bir 1.5 mL microcentrifuge tüpüne toplamak.</li>
	<li>Hücreler için 200 x g. yıkama, 2 dk santrifüj kapasitesi 3 kez ile 1 mL steril DEPC PBS hücreleri. 1.2 mL DEPC PBS resuspend.</li>
	<li>(Deneysel Kur tarafından belirlenen) coverslips uygun sayıda 6-şey plaka dipleri yerleştirin.</li>
	<li>Her coverslip DEPC PBS karışımı hücrenin 200 µL pipet, en az 0,5 milyon hücre her slayt üzerinde olduğundan emin olun. Hücreler 2 min için yerleşmek izin ve aşırı DEPC hücreleri sadece ince bir tabaka bırakarak PBS Aspire edin. Bu süreçte kaldırılacak hücreleri normaldir. Dikkat: PFA toksik, uygun koruma giymek.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde çözüm (DEPC PBS % 3.7 formaldehit) her kapak kayma sabitleme 1 mL ekleyin. 10 dakikadır düzeltmek hücreleri izin.</li>
	<li>Coverslips 3 kez DEPC PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Dikkatle glisin DEPC PBS 1 mL ekleyin (glycine son konsantrasyonu: 100 mM) her kapak kayma. 5 min için gidermek için hücreleri izin.</li>
	<li>Bir shaker 5 min için üzerinde DEPC PBS ve iki yerde 1,5 mL ekleyin veya sıkıca ama hafifçe el 1 dk. aspiratı aşırı DEPC PBS sallamayın. Hücreleri bozmaya değil dikkatli olun. Toplam 3 yıkama için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Dikkatle her kapak notu için çözüm (% 50 aseton, metanol % 50) permeabilizing 1 mL ekleyin. 15 dakikadır permeabilize hücrelere izin. Not: Bu noktada, coverslips-20 ° C-dondurucu için artık bir hafta daha saklanabilir. Donma önlemek veya görüntü kalitesi hızla düşebilir gibi dondurucuya harcanan zamanı en aza indirmek. Hücreleri kalır dondurucu ne zaman ıslak ve kapalı metanol/aseton ve onlar düzgün DEPC PBS ile dondurucu kaldırılması sonra suyla temasa olduğunu emin olmak için emin olun.</li>
	<li>Bir shaker 5 min için üzerinde DEPC PBS ve iki yerde 1,5 mL ekleyin veya sıkıca sallamak ama hafifçe el 1 dk. için aşırı DEPC PBS Aspire, hücreleri bozmaya değil dikkatli olun. Toplam 3 yıkama için bu adımı yineleyin.</li>
</ol>4. IFA ve RNA-balık
Not: RNA balık sonda etiketleme ve hazırlık ile ilgili olarak: için K-959 baz çifti, 31 farklı probları intron olduğunu Rta oluşturulan bu 20 baz bir GC içeren çifti her, yaklaşık % 50 içerik. Çalışma ve hisse senedi çözümleri sondalar, sırasıyla 100 µM ve 2.5 µM konsantrasyonları, bölünmemeli idi.
<ol><li>Mikroskop slaytlar ile gerekli deneysel bilgi ya da bir çeşit ayırt etiket etiket.</li>
	<li>Nemli kağıt havlu ile yapışmalı plastik konteyner alt çizgi.</li>
	<li>
Birincil antikor çözüm hazırlamak (1,5 µL LANA antikor, RNA Pol II antikor 0,75 µL, baker'ın 3 µL Maya tRNA, DEPC PBS 30 µL kadar) ve her coverslip mevcut tarifini çarpın. Birincil antikor çözüm her yer 30 µL mikroskop slayt etiketli.
	<ol>
<li>İlk faiz birincil antikor titre ve en uygun miktarda kullanın. Serum (asit sıvı) RNase büyük miktarda içerebilir olarak saflaştırılmış IgG, kullandığınızdan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip (çözüm dış yüzey hücreleri) etiketli mikroskop slaytlar yerleştirin ve nemli kağıt havlu ile konteyner içine slaytlar hareket. Kabarcıklar tanıtmak değil dikkatli olun. Kapsayıcı plastik wrap ile dış kapak. Konteyner 37 ° C için 1 h için bir kuluçka içine taşıyın.</li>
	<li>Bir balık yıkama arabellek (2 x serum sodyum sitrat tampon (SSC) (son), % 10 formamide, % 90 DEPC dH2O) hazırlayın.</li>
	<li>2 x hibridizasyon arabellek hazırlamak (4 x SSC, % 20 dextran sülfat).</li>
	<li>İkincil antikor ve balık intron sonda arabellek hazırlamak (2 hibridizasyon arabellek (son 1 x Hyb arabellek) x 20 µL, fırıncı mayası 4 µL tRNA (son %10), formamide (son %10), intron K-Rta sonda 4 µL (son 125 nM), 0.8 ikincil antikor, DEPC dH2 µg O kadar 40 µL). Gerekli her slayt için reçete çarpın.</li>
	<li>Kuluçka sonra hücreleri 3 kez DEPC PBS 5 min için 6 iyi plaka ile yıkayın.</li>
	<li>Balık yıkama arabellek 5 min için 3 kez yıkayın. Coverslip balık-yıkama arabellekte karışımı ikincisi antikor ve intron sonda (Adım 4.7) hazırlama bitiş kadar tutun.</li>
	<li>Temiz cam slaytlar için birincil antikor kuluçka hibridizasyon için kullanılan.</li>
	<li>40 µL ikincil antikor ve her bir cam slayt üzerine solüsyon içeren balık intron sondası yerleştirin.</li>
	<li>Slayda hücrelerle coverslips kabarcıklar tanıtmak için dikkatli olmanız hücre yüzü aşağı bakacak şekilde arabellek üstüne yerleştirin.</li>
	<li>Nemli kağıt havlu ile plastik bir kap içine slaytlar altına yerleştirin. İlk plastik wrap ve sonra alüminyum folyo plastik kapta sarın.</li>
	<li>Kapsayıcı için 16-24 h 37 ° C'de slaytlar ile kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra dikkatlice coverslip cam slayt kenarından slayt ve geri yukarı dönük olacak şekilde 6 iyi tabak içine koymak ve balık-yıkama arabellekte 3 kere 6 iyi plaka 5 min için hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>2 kere 2 içeren hücreleri yıkama x SSC.</li>
	<li>DAPI (1:1, 000) 2 ekleyin x SSC ve oda sıcaklığında 5 min için oturmak için izin verir.</li>
	<li>2 kere 2 içeren hücreleri yıkama x SSC.</li>
	<li>Hibridizasyon için kullanılan cam slaytlar temiz ve çözüm cam slaytlar üzerine montaj 10 µL ekleyin.</li>
	<li>Coverslips yüzü aşağı montaj çözümü üzerine yerleştirin. Kabarcıklar tanıtmak değil dikkatli olun.</li>
	<li>Laboratuvar doku ile yavaşça hücreleri ezmeye değil dikkatli olmak aşırı montaj çözüm çıkarın.</li>
	<li>Tırnak cilası kullanarak, coverslips kenarında geniş bir tabaka uygulayın ve kurumasını sağlar.</li>
	<li>Floresans mikroskobu gerçekleştirmek için devam edin.</li>
</ol>5. 3D Floresans mikroskobu
Not: protokoller floresan mikroskop sistem kullanılan türü ile değişir iken, aşağıdaki adımları en uygun görüntü verilerini nicel analiz edinimi sağlamak için yardımcı olacaktır.
<ol><li>Sabit örnekleri pretreat ve anti-fade medya floresan photobleaching görüntüleme sırasında geciktirmek için mount.</li>
	<li>Tüm cep telefonu (veya hücre çekirdeği)-ebilmek esir alma yüksek kalite hedefi (örneğin bir 60 X 1,42 N.A petrol-daldırma lens), alan bakış açısı içinde kullanın.</li>
	<li>Pozlama parametreleri (örneğin, uyarma güç, pozlama süresi) pozitif ve negatif kontrol örnekleri kullanarak her Floresans renk kanalı için ayarlayın. Floresans görüntüleri elde etmek. Not: yalnızca bir floresan etiketi pozitif kontrol örnekleri de renk kanalları arasında "çapraz karışma" düzeyini belirlemek için kullanılmalıdır. Görüntüleme sabit hücre numuneler için Floresans uyarma güç (biraz daha uzun pozlama süreleri ile) photobleaching en aza indirmek için azaltılabilir.</li>
	<li>Görüntüleme protokolü kurulduktan sonra aynı pozlama parametreleri bir çalışmada tüm örnekleri için tutarlı korumak — böylece görüntü verilerini doğru bir şekilde analiz ve karşılaştırıldığında.</li>
	<li>Sonrası edinme görüntü işleme ve 3D yeniden gerçekleştirin. K-Rta transkript RNA-balık sinyal (kırmızı), LANA molekülleri ayirt (yeşil) ve nükleer Kromatin DAPI (mavi) ile lekeli (uygun olduğunda) tanımlayın. Not: K-Rta ve LANA co kümelenmiş olan hücre çekirdeği bölgelerinde böylece viral transkripsiyon fabrika ve çoğaltma karmaşık ile ilişkili olduğu düşünülmektedir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Laat, W., Grosveld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grosveld+Spatial+organization+of+gene+expression:+the+active+chromatin+hub.">Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub.</a> Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics:+implications+for+nuclear+architecture+and+gene+expression.">Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression.</a> Science. 291 (5505), 843-847 (2001).</li><li>Bernardi, R., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+dynamics+and+functions+of+promyelocytic+leukaemia+nuclear+bodies.">Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).</li><li>Cioce, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies:+a+long+history+of+discovery.">Cajal bodies: a long history of discovery.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).</li><li>Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+nucleolus.">The multifunctional nucleolus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).</li><li>Sutherland, H., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factories:+gene+expression+in+unions.">Transcription factories: gene expression in unions.</a> Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li><li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> J Virol. 91 (11), (2017).</li><li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma:+listening+to+human+biology+and+medicine.">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).</li><li>Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma+and+its+associated+herpesvirus.">Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus.</a> Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).</li><li>Campbell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferase+1-directed+methylation+of+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+latency-associated+nuclear+antigen.">Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen.</a> J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).</li><li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation.">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30 (2012).</li><li>Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+diversity+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus.">Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).</li><li>Osborne, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc+dynamically+and+preferentially+relocates+to+a+transcription+factory+occupied+by+Igh.">Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh.</a> PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly(A)+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression.">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).</li><li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+JMJD2A+regulates+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+replication+and+is+targeted+by+a+viral+transcriptional+factor.">Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor.</a> J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).</li><li>McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+efficiency+of+phorbol+ester-induced+lytic+reactivation+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+during+S+phase.">Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase.</a> J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).</li><li>Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+cycle+switches+of+oncogenic+human+gammaherpesviruses.">Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses.</a> Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).</li><li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation.">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30 (2012).</li></ol>

Yazarlar bu yazının hiçbir mali bağları ya da rakip çakışmaları çıkarları var.

Sıra dışı durumlar karşılamak için değiştirilebilir Protokolü bazı yönleri vardır. Fiksasyon ve permeabilization arabellekleri seçiminde de değiştirilebilir. Fiksasyon arabellekleri için paraformaldehyde da etkilidir ve etanol permeabilization için kullanılabilir.
Şoklama formaldehit ile glisin PBS formaldehit sığır serum albumin (BSA) yokluğunda antikorlar devre dışı bırakmasını engeller, ancak coverslips iyice yeterli yıkanır,-ebilmek var olmak Kaptan glisin P...

Çekirdek kronolojik zamanmekansal organizasyonu hassas bir şekilde ayarlanmış gen ekspresyonu ökaryotlarda oransal olarak önemli bir rol oynar giderek netlik kazanmıştır. Çoğu doku belirli genler üzerinde birçok kromozomlar dağıtılır ve koordine bir şekilde1belirli uyaranlara yanıt için zaman uyumlu olarak düzenlenmiş olması gerekir. Hücreleri aktif Kromatin hub'lar (ACH) genleri ve CIS düzenleyici bileşenleri belirli nükleer alanı1buluşturan bir yolu olarak oluşturun.
Bu da tarafından çeşitli çalışmalar çekirdeği çok yoğun ve yapışkan görünse de, biyolojik olarak aktif molekülleri çekirdeği oldukça hızlı bir şekilde Difüzyon2erişebilen olduğunu kanıtlanmıştır. Sonucu olarak kısa ömürlü bu özellik, çoğu DNA bağlayıcı proteinler 'için son derece uyumlu ve çok yönlü çekirdek2sağlayan nükleer alanda etrafında kendi yollarını duygu site Bağlayıcısı için site bağlayıcısı üzerinden atlama'.
Biomolecules çekirdeği içinde bu dinamik davranış rağmen nükleer membran gibi organları (ama bunlarla sınırlı olmamak üzere) çekirdekçik, Cajal organları ve promyelötik lösemi nükleer organları (PML-NB) hala mevcut. Bu yapıları birlikte3,4,5 tutun proteinler (PML-NB) çeşitli mekanizmalar tandem DNA yineler (çekirdekçik), rRNA (çekirdekçik) ve Cajal aytac (organları) veya PML gibi yapısal proteinler gibi geçer . Bu yapılar ve diğer cemaat transkripsiyon fabrikalar gibi sadece gerekli bileşenleri yerel konsantrasyonu artırmak, ancak aynı zamanda proteinler ve nükleik asitler sonuçta oluşturmak için bunları içinde kompozisyon düzenleyen iskele olarak hizmet bir verimli hücresel işlevler6için merkezi bir sitedeki.
Nerede ve ne zaman nükleer yapılar formu epigenetik eğitim araştırmacılar için bilgi hazinesi sağlar görselleştirme. Viroloji açısından bakıldığında, KSHV gibi gizlice enfekte virüsler reaktivasyonu önemli ölçüde çekirdeği Peyzaj ve dağıtım nükleer enzimlerin transkripsiyon öncelikle hücresel genlerin viral genler için sonuçta kaydırmaya değiştirir için tamamen işlevsel viral döl7,8üretmek. KSHV viral gen ifadesi kolaylaştırmak için hücresel gen ifade makine nasıl işlemek? Bu bilgileri ayrıca zamansal hücresel gen düzenleyici mekanizmaları ışık.
Diğer herpesviruses gibi KSHV litik çoğaltma ve gecikme süresi olarak adlandırılan iki ömürleri vardır. Gecikme süresi ilişkili genlerin9,10dışında KSHV öncelikle içinde hangi en-in onun viral gen ifade susturulması, gecikme süresi aşamasında yer alır. KSHV üretir gecikme süresi sırasında gecikme süresi yapısal viral genom bağlar ve insan kromozom11viral Kromatin tethers nükleer antijen (LANA), ilişkili. Viral genom ile LANA'ın samimi ilişki nedeniyle IFA ve DAPI leke ve viral episomes ile ilgili olarak ana bilgisayar Kromatin nerede olduğunu bulmak için kullanmak mümkündür.
KSHV reaktivasyonu tek episome düzeyinde ve derneğin diğer viral episomes virüslü bir hücre ile çalışmaya, aktif viral Kromatin situ transkripsiyonu bulmak için bir strateji kurulmuştur. Buna göre LANA ve RNAPII IFA intron RNA-balık ile bu KSHV K-Rta-anahtar viral protein intron bölge (tam sonda dizileri-ebilmek bulunmak Izumiya laboratuar en son yayın8') bağlamak RNA-balık probları oluşturarak kombine edilmiştir gerekli ve yeterli KSHV yeniden etkinleştirme-BT tanımlamak mümkün için transkripsiyon aslında alıyordu nerede8,11,12,13,14,15 yere . Bu intron RNA-balık tekniği araştırmacılar spliced ve sitoplazma16,17' ye ihraç hemen önce nerede mRNA sentezlenir görselleştirmenizi sağlar.
KSHV tarafından phorbol esterleri gibi 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) dahil olmak üzere çeşitli kimyasal uyaranlara yeniden etkinleştirilebilir ve Histon deacetylase inhibitörleri gibi sodyum bütrat, ayrıca KSHV overexpression tarafından yeniden etkinleştirmek için indüklenen viral transkripsiyon faktörü, K-Rta19. Araştırmacılar başarıyla yeniden etkinleştirme18inducing önce hücre döngüsü eşitleyerek KSHV reaktivasyonu verimliliği artmıştır. Böylece, bu belirli çalışmalar için hücreleri bir çift timidin blok (aşağıda açıklanan iletişim kuralı) kullanarak ve TPA ve Doksisiklin (Dox) ile kısa bir süre için inkübe senkronize. Bu deneylerde kullanılan hücre kültürünü cDNA klonlanmış ve K-Rta intron bölgenin içermez Doksisiklin indüklenebilir bir K-Rta kaset olduğundan Doxycyline kullanıldı. Yeniden etkinleştirmek mümkündür ancak KSHV kullanarak sadece K-Rta ifade indüklenen, çeşitli farklı biyokimyasal faktörler nedeniyle K-Rta ifade yalnız bir zayıf reaktivasyonu uyaranlara20olmaktadır araştırmacılar tarafından kanıtlanmıştır. Bunların hepsi birleştirerek ve uyuşturucu incubations kısa bir süre için sınırlayarak, bir güçlü ama aşırı yapay KSHV etkinleştirme görüntüleme için sağlanır.
LANA, RNAPII, etiketleme sonra K-Rta intron ve DNA olarak bu yazıda açıklanan, 3D Floresans görüntüleme widefield deconvolution mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı ile işlendikten sonra aktif viral episomes kayma dağılımını düzgün değerlendirilebilir. Bu tekniği kullanarak, etkin Kromatin hub'ları ve diğer nükleer yapıların oluşumu temel doğa ile ilgili sorular Merkezi okudu olabilir. Aynı viral episomes aynı düzenleyici elemanlarının işleyen tek bir hücreye sahip kronolojik zamanmekansal gen düzenleyici mekanizmaları anlayışı derinleştirmek için benzersiz araştırma aracı temsil edebilir.
Farklı zaman noktalarda sabit birden çok hücre örnekleri doğal olarak dinamik bir moleküler süreci karakterize görüntüleme bir floresan dağıtım ince ya da küçük ölçekli değişiklikleri tespit edilmemiş veya önemsiz kabul kısıtlamadır. Nadir örneğini her hücresinde gözlenen aynı ince değişiklik görüntüler sürece bu doğrudur. Böylece, aktif viral transkripsiyon ve diğer nükleer yapıların tam kronolojik zamanmekansal ilişki eleştirel sabit Imaging'i kullanma değerlendirilemez. Bu teknik sorunları ele almak üzere, viral episomes işaretlenmiş resim canlı hücreleri ve zaman içinde anahtar hücresel enzimler konumunu takip için en iyi yaklaşım olduğunu.

<table><tbody><tr><td>RPMI medium 1650 GlutaMAX</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Needs to be warmed to 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine (100x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Solution</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Butyrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>Corrosive, toxic, health hazard</td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-5758</td><td>Acute toxicity&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>Flammable, toxic</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>67-56-1</td><td>Flammable, toxic, health hazard</td></tr><tr><td>Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8</td><td>EMD Milipore</td><td>05-623</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleic acid, transfer from baker&amp;rsquo;s yeast (S. cerevisiae)&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9014-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Saline sodium citrate buffer 20x (SSC)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15557044</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>295876</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution</td><td>EMD Milipore</td><td>1916C093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;rsquo;,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>slowFade Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass 22x22</td><td>Matsunami</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>VoloCITY</td><td></td><td>3D imaging software</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr></tbody></table>

functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy

İyi genler kayma ve temporal düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu yöneten ayrılmaz bir parçası olduğu bilinmektedir. Sonuç olarak, nerede ve ne zaman transkripsiyon nükleer alanı içinde yer alıyor anlamak ve aynı hücre çekirdeği içinde enfekte episomes arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için çok değerli olduğunu. Burada, ayirt (IFA) ve RNA-balık olmuştur combinedto belirlemek aktif Kaposi sarkomu ilişkili herpesvirus (KSHV) episomes transkripsiyonu. KSHV gecikme süresi ilişkili nükleer antijen (LANA) Boyama tarafından viral episomes çekirdeği içinde bulunduğu bulmak mümkündür. Buna ek olarak, sadece verimli enfeksiyon sırasında ifade edilir, viral bir gen intron bölgesinin hedef için RNA-balık probları tasarlayarak doğmakta olan RNA transkript bulunabilir. Bu moleküler probları birleşimini kullanarak, büyük viral transkripsiyon fabrikalar Meclisi görselleştirmek ve mekansal düzenleme viral gen ekspresyonu KSHV yeniden etkinleştirme sırasında analiz etmek mümkündür. Anti-RNA polimeraz II antikor boyama dahil olarak, bir de RNA polimeraz II (RNAPII) toplama ve KSHV transkripsiyon yeniden etkinleştirme sırasında arasındaki ilişkiyi görselleştirebilirsiniz.

Biraz kısaltılmış bir protokol nerede BCBL-1 hücreler kullanıldı ve sadece LANA ve K-Rta RNA (şekil 1) lekeli gerçekleştirildi. Bu deney nerede viral episomes aktif transkripsiyonu ve hücre bir popülasyondaki KSHV reaktivasyonu bizi canlı tutan heterojen incelemek için bize izin verir. Şekil 1' deki bir ok ile belirtilen hücre içinde farklı K-Rta Floresans viral episomes (LANA ile işaretlenmiş) dağılımı uy...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Viral transkripsiyon fabrikalar hücresel RNA polimeraz II viral gen transkripsiyonu yeniden etkinleştirme sırasında artırmak için ile zenginleştirilmiş ayrık yapılardır. Burada, sitelerinden Aktif 3D nükleer alanda viral Kromatin ayirt boyama ve in situ RNA hibridizasyon kombinasyonu tarafından transkripsiyonu birini bulmak için bir yöntem açıklanmıştır.

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.0K Görüntüleme.  University of California, Davis. Viral transkripsiyon fabrikalar hücresel RNA polimeraz II viral gen transkripsiyonu yeniden etkinleştirme sırasında artırmak için ile zenginleştirilmiş ayrık yapılardır. Burada, sitelerinden Aktif 3D nükleer alanda viral Kromatin ayirt boyama ve in situ RNA hibridizasyon kombinasyonu tarafından transkripsiyonu birini bulmak için bir yöntem açıklanmıştır.

Video: Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Biyoloji

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

DNA Çift Telli Molalarda Transkripsiyonal Aktivitenin Canlı Hücre Görüntülemesi

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...