Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tráfico de proteínas sobre la translocación nuclear y citoplasma en un sistema en el que no se dispone de imágenes ligeras. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar como protocolo general para el estudio del movimiento de proteínas temporales sin involucrar imágenes ligeras. 20 a 24 horas antes de la semilla de la infección por virus 5 veces 10 a las 4 células de explosión de fibra embrionaria humana o hel por pozo en un cuatro pozos 11 milímetros escalonadas y medio de crecimiento para la incubación durante la noche a 37 grados Celsius con un cinco por ciento de dióxido de carbono.
Es importante mecer bien la diapositiva para asegurar una distribución uniforme de las células mientras se cuida para evitar derramar el medio de cultivo. Al día siguiente, reemplace los sobrenadantes para que los cultivos de 70 a 80 por ciento confluentes con Medio 199, que contienen 410 unidades formadoras de placas por célula, y coloque el portaobjetos a 37 grados Celsius con temblores, durante una hora. Al final de la incubación, sustituya los sobrenadantes por un medio de crecimiento fresco y devuelva las células a la incubadora durante el período de infección experimental adecuado.
Para la tinción inmunofluorescente de las células infectadas por el virus, lave rápidamente las células tres veces con PBS. Seguido de una incubación de ocho a diez minutos en 200 microlitros de paraformaldehído por cuatro por ciento en PBS por pozo. Al final de la fijación, lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS por lavado, y permeabilizar las células con 100 microlitros de 0.2 por ciento tensioactivo no iónico por pozo durante cinco a diez minutos.
Lave las células permeabilizadas tres veces en PBS como se ha demostrado, y agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo a cada pozo para una incubación de una hora a temperatura ambiente. A continuación, añada la concentración adecuada del anticuerpo primario de interés a cada pozo para una incubación de temperatura ambiente de dos horas. Al final de la incubación, retire cualquier anticuerpo primario no consolidado con tres lavados de diez minutos en un tampón de bloqueo fresco y agregue un anticuerpo secundario adecuado a cada pozo para una incubación de una hora a temperatura ambiente, protegido de la luz.
Al final de la incubación, lavar las células tres veces en un tampón de bloqueo como se ha demostrado, seguido de un lavado en PBS y añadir una gota de medio de montaje antifada complementado con DAPI a cada pocero. A continuación, coloque un resbalón de cubierta sobre la corredera y selle la pendiente de la cubierta con esmalte de uñas transparente. La aplicación de una presión suave durante el montaje del resbalón de la cubierta eliminará cualquier medio de montaje excesivo, lo que ayudará a garantizar la adquisición de imágenes de alta calidad.
Para imágenes confocales de las células infectadas etiquetadas, seleccione el anticuerpo secundario adecuado y las longitudes de onda DAPI, y establezca el formato de imagen en 1, 024 por 1, 024 píxeles con una línea media de ocho. A continuación, imagine cada pozo en la diapositiva de cuatro pozos bajo el objetivo de 100x. Para contar un gran número de celdas, obtenga de cinco a diez imágenes de campos consecutivos en el mismo pozo bajo el objetivo 40x.
Para analizar la distribución nuclear y citoplasma de ICP0, abra el proyecto en el software de aplicación confocal y seleccione una imagen. Abra la pestaña Cantidad y seleccione Ordenar regiones de interés en el menú Herramientas. Seleccione Trazar línea y dibuje una línea longitudinal a través de la celda que se va a analizar.
Aparecerá un histograma que muestra la intensidad de fluorescencia a lo largo de la línea tanto para la proteína de interés como para DAPI. Sobre la base de la tinción de fondo, establecer un umbral constante para la intensidad de la proteína de interés para el análisis de la distribución subcelular de la proteína en cada experimento. Si la señal proteica, en promedio, está por debajo del umbral en la región nuclear, pero está por encima del umbral más allá del límite de DAPI, clasifique la señal proteica como predominantemente ubicada dentro del citoplasma.
Si la señal proteica está por encima del umbral a lo largo del núcleo, y más allá del límite de la señal DAPI, agrupe la señal proteica como un núcleo más la localización citoplasmático. Si la señal proteica está por encima del umbral en el núcleo, pero en promedio está por debajo del umbral fuera del límite del grupo de señales DAPI, la señal de proteína como localización nuclear. Por último, tabula más de 200 células infectadas de cada muestra en diferentes puntos de tiempo de infección, y traza los datos en un gráfico de barras para ilustrar el movimiento de la proteína de interés a lo largo del tiempo.
Como se ha demostrado, este método facilita el análisis de la translocación nuclear a citoplasma de proteínas de interés. Por ejemplo, la proteína celular infectada cero o la distribución subcelular ICP0 cambian a medida que progresa una infección viral. Para entender los elementos necesarios para el tráfico de ICP0 durante la infección, los movimientos de ICP0 se pueden rastrear en células infectadas de tipo salvaje y virus de herpes simple de tipo mutante 1 en diferentes fases de infección, lo que permite la evaluación de la distribución subcelular de ICP0 en diferentes puntos de tiempo de infección.
Es importante recordar el uso de cultivos monocapa para que los viriones tengan el mismo acceso a las células y para normalizar la multiplicidad de infección de acuerdo con el título del virus para que la progresión de la infección sea comparable entre y dentro de los virus. Después de cada desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la biología y la virología celular exploraran el movimiento proteico mediante el estudio de las localizaciones subcelulares temporales de proteínas de interés dentro de una población celular.
