Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Proteinhandels über nukleare und zytoplasmatische Translokation in einem System zu beantworten, in dem keine Lichtbildgebung verfügbar ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie als allgemeines Protokoll für die Untersuchung der zeitlichen Proteinbewegung angewendet werden kann, ohne Lichtbildgebung zu verwenden. 20 bis 24 Stunden vor der Virusinfektion Samen 5 mal 10 an die 4 menschlichen embryonalen Lunge oder HEL Faserstrahlzellen pro Brunnen auf einem vier gut 11 Millimeter gestaffelten Gleit und Wachstumsmedium für die nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid.
Es ist wichtig, die Rutsche gründlich zu schaukeln, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten und gleichzeitig darauf zu achten, dass das Kulturmedium nicht verschüttet wird. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Überräube, so dass die 70 bis 80 Prozent konfluenten Kulturen mit Medium 199, die 410 Plaque-bildende Einheiten pro Zelle enthalten, und legen Sie die Rutsche bei 37 Grad Celsius mit Schütteln, für eine Stunde. Am Ende der Inkubation die Überstande durch ein frisches Wachstumsmedium ersetzen und die Zellen für die entsprechende experimentelle Infektionsperiode in den Inkubator zurückbringen.
Für immunfluoreszierende Färbung der virusinfizierten Zellen, waschen Sie die Zellen schnell dreimal mit PBS. Gefolgt von einer acht- bis zehnminütigen Inkubation in 200 Mikrolitern von vier Prozent Paraformaldehyd in PBS pro Brunnen. Am Ende der Fixierung die Zellen dreimal mit 200 Mikroliter PBS pro Waschgang waschen und die Zellen mit 100 Mikrolitern 0,2 Prozent nichtionisches Tensid pro Brunnen fünf bis zehn Minuten durchdringen.
Waschen Sie die permeabilisierten Zellen dreimal in PBS, wie gezeigt, und fügen Sie 200 Mikroliter Blockierpuffer zu jedem Brunnen für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen die entsprechende Konzentration des primären, von Interesse sind, für eine zweistündige Raumtemperaturinkubation hinzu. Entfernen Sie am Ende der Inkubation alle ungebundenen Primärantikörper mit drei, zehnminütigen Waschungen in einem frischen Sperrpuffer, und fügen Sie jedem Bohrkörper einen geeigneten sekundären Antikörper für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu, die vor Licht geschützt ist.
Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation dreimal in einem Blockierpuffer, gefolgt von einer Wäsche in PBS, und fügen Sie jedem Brunnen einen Tropfen Antifade-Montagemedium hinzu, der mit DAPI ergänzt wird. Dann legen Sie einen Deckelrutschen über die Rutsche und versiegeln Sie die Abdeckneigung mit transparentem Nagellack. Durch den sanften Druck bei der Montage des Abdeckschlupfs werden überschüssige Montagemittel entfernt, was dazu beiträgt, die Erfassung hochwertiger Bilder sicherzustellen.
Wählen Sie für die konfokale Abbildung der beschrifteten, infizierten Zellen den entsprechenden sekundären Antikörper und die DAPI-Wellenlängen aus, und legen Sie das Bildformat auf 1, 024 x 1, 024 Pixel mit einer durchschnittlichen Linie von acht an. Dann bildn jeder gut auf der Vier-Well-Folie unter dem 100x Objektiv. Für das Zählen einer großen Anzahl von Zellen erhalten Sie fünf bis zehn Bilder aus aufeinander folgenden Feldern im gleichen Brunnen unter dem 40-fachen Ziel.
Um die kern- und zytoplasmatische Verteilung von ICP0 zu analysieren, öffnen Sie das Projekt in der konfokalen Anwendungssoftware und wählen Sie ein Bild aus. Öffnen Sie die Registerkarte Menge, und wählen Sie im Menü Extras Interessenbereiche sortieren aus. Wählen Sie Linie zeichnen aus, und zeichnen Sie eine Längslinie über die zu analysierende Zelle.
Es erscheint ein Histogramm, das die Fluoreszenzintensität entlang der Linie sowohl für das Protein von Interesse als auch für DAPI anzeigt. Basierend auf der Hintergrundfärbung, richten Sie einen konstanten Schwellenwert für die Intensität des Proteins von Interesse für die Analyse der subzellulären Verteilung des Proteins in jedem Experiment. Liegt das Proteinsignal im Durchschnitt unter dem Schwellenwert im Kernbereich, liegt aber über dem Schwellenwert über der DAPI-Grenze, kategorisieren Sie das Proteinsignal als überwiegend innerhalb des Zytoplasmas.
Wenn das Proteinsignal über dem Schwellenwert im gesamten Kern und jenseits der Grenze des DAPI-Signals liegt, gruppieren Sie das Proteinsignal als Kern plus zytoplasmatische Lokalisation. Wenn das Proteinsignal über dem Schwellenwert im Kern liegt, aber im Durchschnitt unter dem Schwellenwert außerhalb der Grenze der DAPI-Signalgruppe liegt, gruppieren sie das Proteinsignal als nukleare Lokalisierung. Schließlich tabellieren Sie mehr als 200 infizierte Zellen aus jeder Probe zu unterschiedlichen Infektionszeitpunkten und zeichnen Sie die Daten in einem Balkendiagramm auf, um die Bewegung des Proteins von Interesse im Laufe der Zeit zu veranschaulichen.
Wie gezeigt, erleichtert diese Methode die Analyse der kern-zytoplasmatischen Translokation von Proteinen von Interesse. Beispielsweise ändert sich die virusuläre Zellprotein-Null oder die subzelluläre ICP0-Verteilung im Verlauf einer Virusinfektion. Um die Elemente zu verstehen, die für den ICP0-Handel während der Infektion erforderlich sind, können ICP0-Bewegungen in Wild Type und Mutant Type Herpes Simplex Virus 1-infizierten Zellen in verschiedenen Infektionsphasen verfolgt werden, was die Bewertung der subzellulären Verteilung von ICP0 an verschiedenen Zeitpunkten der Infektion ermöglicht.
Es ist wichtig, daran zu denken, monolayer Kulturen zu verwenden, damit die Virionen gleichen Zugang zu den Zellen haben und die Vielfalt der Infektion gemäß dem Virustitel zu normalisieren, so dass das Infektionsverlauf zwischen und innerhalb von Viren vergleichbar ist. Nach jeder Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen Biologie und Zellvirologie, um die Proteinbewegung zu erforschen, indem sie die zeitlichen subzellulären Lokalisationen von Proteinen von Interesse innerhalb einer Zellpopulation untersuchten.
