Name: in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

Michael Heymann teşekkür ediyoruz ve Frank Siedler üretiminin silikon gofret, çekirdek tesis MPI-B için protein saflaştırma ve Simon Kretschmer yardım ve Leon Harrington el yazması üzerine yorumlar için.

<ol>
	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli.">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li><li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics.">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li><li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli.">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li><li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures.">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li><li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli:+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid.">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li><li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+Escherichia+coli:+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site.">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems.">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949 (2014).</li><li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes.">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+biological+surfaces:+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria.">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li><li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MipZ,+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter.">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li><li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation.">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758 (2014).</li><li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo.">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes.">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li><li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins.">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li><li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers.">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271 (2016).</li><li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz bir protokol MinCDE kendi kendine organizasyon üzerinde düzlemsel vitro sulandırma lipid bilayers desteklenen ve lipid içinde 3D yapılar, bilayer kaplı çubuk şeklinde PDMS microstructures örneği kullanarak anlatmıştık. Bu deneyleri değerli verilerini elde etmek için protein ve membran kalite kontrolü için en önemli faktörler bulunmaktadır.
Protein, protein bir kalite için kitle-var doğruladı SDS-sayfa ve kütle spektrometresi kullanılarak. Ayrıca, bu proteinler analitik jel filtrasyon veya dinamik ışık saçılma kullanarak çözünür ve değil toplanmış olduğunu doğrulanması gerekir. Jel filtrasyon proteinler toplanan herhangi bir kısmını kaldırmak için kullanılabilir. Dikkatli pH ayarlama ve eklenen nükleotit kalitesi kritik, Sigara ayarlanacağını veya kısmen bozulmuş nükleotit protein ek olarak hisse senedi veya kendiliğinden organize deneyleri protein etkinlik, bu nedenle kaldırılması ortadan kaldırmak için yeterli kendi kendine organizasyon.
Protein kalite, yanındaki membran kalite en kritik ve uygunsuz membran oluşumu en sık arızalı kendi kendine organizasyon ve artefactual yüzey yapıların kökeni için nedenidir.
Protokolü ilk kez gerçekleştirilirken, sınav-655-uyuşturucu veya dıı gibi etiketli lipidler düşük molar oranlarda (% 0.05) dahil olmak üzere tarafından desteklenen lipid bilayers etiket yararlıdır. Böylece özellikleri ve membran kalitesini doğrudan karar olabilir. Sıkı bağlamak kullanarak, membran akışkanlık tespit edilebilir. Bu yıkanmış Eğer orada da çok fazla veziküller, hiçbir sıvı membran veya hiçbir membran, olacak gibi Ayrıca, bir doğrudan SLB, yıkama kalitesini değerlendirir. Titizlikle membran, yıkamak için açık odası yaklaşım sağlar ve bu nedenle de SLB yüzeye yapışmasını veziküller kaldırmak için. Temizlik ve hydrophilicity destek yüzeyi ve doğru boyut ve SUvs polimerlerin bilayers olan sıvı ve homojen desteklenen lipid elde etmek için en önemli faktörler SUV boyutu ve boyut dağılımı kullanarak kontrol etmek yardımcı olabilir dinamik ışık saçılma. Dar boyutu dağıtımları için onları sonicating yerine veziküller yükseltme öneririz. Temizlik coverslips, Örneğin, tedavi güçlü bazlar, temel deterjanlar veya doğrudan su ile durulama sonra coverslips kullanarak diğer yöntemleri iyi, uygulama ve lipid karışımı bağlı olarak sonuçlar verebilir.
Burada, vitro sulandırma düzlemsel desteklenen lipid bilayers açık odalarında, üzerinde sunulan Protokolü ilk yarısında yüzey optik microscopies, TIRF mikroskobu gibi30, sıkı bağlamak için erişilebilir oluşturma avantajına sahiptir analiz6, tek-parçacık34yanı sıra atomik kuvvet mikroskobu26gibi yüzey araştırma teknikleri izleme. Büyük homojen alan tanımlı konsantrasyonlarda daha iyi istatistikleri sağlar. Ayrıca açık odası yaklaşım tam olarak protein konsantrasyonu ve bir hızlı ve basit ek bileşenlerinin dolayısıyla protein konsantrasyonu tek odası20titre için izin daha fazla kontrol sağlar. Tahlil FtsZ22,35, ZipA22 veya chimeric protein FtsZ-YFP-MTS10,35gibi diğer bakteriyel divisome bileşenler tarafından genişletilebilir.
Diğer gruplar Min sistem vitro, ama kullanımı akış hücre yerine bir açık odası17,18,19başlamaktan için benzer bir yaklaşım almıştır. Akış-hücreleri belirli avantajları, özellikle gerekli18, akış17,19,23 etkisi tamamen kapalı bir 3D çevre veya membran kompozisyon23 MinCDE desenleri olduğunda var araştırdık, ya da koşullar19sınırlama protein altında uyması gereken protein desenler vardır. Yine de, yerel moleküler konsantrasyonları kontrolünü daha zordur. Protein bileşenleri, özellikle zihin, güçlü membran için bağlama karşılaştıkları ilk18,19. Deneyim, proteinler sık non-spesifik bağlama boru, giriş, şırınga ve diğer mikrosıvısal parçalar için sergi. Bu nedenle, yerel protein konsantrasyonları ve giriş konsantrasyonları18 farklı de akışı hücre gibi başkaları tarafından19farklı protein kalıpları arasındaki giriş ve çıkış, zar üzerinde çeşitli sonuçlanan, uzunluğu değişir.
Protokol yarısı burada, çubuk şeklinde microstructures lipid tarafından örtülü bir desenli desteği üzerinde açık odası yaklaşımı yeniden kullanarak vitro rekonstitüsyon sunulan ikinci bilayers sağlar vivo içinde protein davranış basit bir taklit için protein konsantrasyonları üzerinde kesin denetim arabellek kaldırma nedeniyle kayıp olmasına rağmen. Dalga boyu fayans bir büyüklük sırasında olduğundan daha büyük vitro vivo içinde daha çubuk şeklinde microcompartments vardır bir büyüklük daha büyük (10 x 30 µm) bir çubuk şeklinde E. coli daha hakkında da hücre olduğunu unutmayın.
Genel olarak, bu iletişim kuralı protein konsantrasyonu, arabellek oluşturma ve membran özellikleri dahil olmak üzere tüm koşullar hassas kontrol için izin verir. 3D yapılandırılmış destekler kullanımı kayma hapsi, in vivo davranış karmaşık Havacilik ekipman için gerek kalmadan taklit altında incelenecektir tepki sağlar.

Zamanmekansal desenleri doğada çok hücreli ve hücresel düzeyde, morfogenez düzenlenmiş hücre bölünmesi1,2üzerinden her iki karmaşık görevleri düzenleyen temel alır. Tepki-difüzyon sistemleri bu kalıpları kurulmasında önemli bir rol oynamaktadır, ama hala iyi anlaşılır. Başlıca örneklerinden bir tepki-difüzyon ve en iyi karakterize biyolojik sistemleri defa Escherichia coli MinCDE sistem3,4,5,6,7biridir. MinCDE sistemi gelecek bölümü site olarak hücre ortasına belirlemek için E. coli Kutbunda hücre için hücre Kutbu'ndan olsun. Bu sistem ATPaz zihin, benim ve kayma tepki matris8olarak membran protein aktive ATPaz dayanmaktadır. MinC desen oluşumu mekanizmasının bir parçası değil, ama gerçek fonksiyonel aracı: bir inhibitörü ana divisome protein FtsZ5,6. MinC akla bağlar ve bu nedenle salınım hücre kutuplarda maksimal ve hücrenin ortasında, en az bir saat ortalama olarak protein konsantrasyonu degrade sonuçlanan sadece FtsZ midcell9,10 polimerize izin izler . MinCDE sistem bakteri2, kronolojik zamanmekansal kuruluşta hücre düzenleme ve konumlandırma ve protein kompleksleri11 ve plazmidlerin12 taşınması için anahtarıdır Walker A ATPases daha büyük ailesinin bir parçasıdır bölümü13 kromozom segregasyon ve14. Dolayısıyla, MinCDE tepki-difüzyon sistem sadece bir arketipik tepki-difüzyon sistemini temsil eder, ama aynı zamanda bakteri kronolojik zamanmekansal kuruluşta için önemi nedeniyle dikkat çekti.
Genellikle protein ve gen silme manipülasyon sonucu olarak hücre bölünmesi kusur MinCDE sistemi içinde vivo detaylı fonksiyonel çalışmaları karmaşıktır. Ayrıca, membran kompozisyon veya sitozol in vivo özelliklerinin çok zorlu değişiyor15,16. Sistem ve faktörler etkileyen değişiklikler içinde önemli bir işlevi hücre bölünmesi olarak rahatsız ettiysem cep karmaşık ortamı içinde daha çok yorumlamak zordur. Biz ve diğerleri bu nedenle bir vitro sulandırma yaklaşım, sistemin çekirdek bileşenlerinin azaltarak çevirdiler: zihin, benim, bir enerji kaynağı olarak ATP ve desteklenen lipid bilayer bir reaksiyon matris6,17, olarak 18. bir yaşam hücrenin ayrıntılı Karmaşıklık olmadan kendi kendine organizasyon mekanizmasının soruşturma için bu tabandan tavana bir yaklaşım sağlar. Genellikle bir büyüklük vivo içindebüyük hakkında böyle bir dalga boyu ile de olsa yüzey seyahat proteinler formu6 ve desenler17,19 bu koşullar altında diğer tür dalgalar. Desen oluşumu etkileyen tüm yönleri üzerinde tam denetim bir açık odası kullanımı kolaylaştırır: protein konsantrasyonları6, protein özellikleri20, membran kompozisyon10, arabellek oluşturma ve ATP konsantrasyonu 6yanı sıra ajanlar21 ve diğer divisome proteinler22kalabalık gibi diğer faktörler eklenmesi. Buna karşılık, bir akış hücreli18,19,23 MinCDE sisteminde vitro sulandırma akışı17,23, protein etkisini araştırmak için kullanılabilir Sınırlayıcı koşullar19, membran kompozisyon19 ve tam 3D doğumdan18 protein desenleri, ama tam bir denetim protein/bileşen konsantrasyon ve sıralı bileşen ek çok daha karmaşık işler.
Bu açık odası kullanarak, aynı zamanda hangi tarafından bir nasıl geometrik sınırları etkisi desen oluşumu21, son zamanlarda bir fenomen sonda düzlemsel lipid bilayers destek desenli de incelenen vivo içinde bakteri kullanarak microstructures7kalıplanmış. Ayrıca benim nasıl tanımlanmış mutasyonların araştırmak için bu tahlil etkiler desen oluşumu sistem20çalıştırmaya başladık. Ayrıca, aynı temel tahlil biçimi nasıl desen oluşumu bir azobenzene-çapraz mayın peptid tahlil içine tanıtımı ve TIRF mikroskobu24ile düşsel ışık tarafından kontrol edilebilir araştırmak için istihdam edilmiştir.
Fayans modeli çoğaltmak için oluşumu vivo vitro sistem, doğumdan anahtardı gözlenen, bulduk. Desteklenen lipid bilayer ile kaplı büyük dalga boyu fayans vitro (10 x 30 µm) için ayarlanmış boyutları ile microcompartments, çubuk şeklinde kullanarak sulandırma fayans pole pole salınımlar ve protein degrade oluşumu izin 10,25. Bu tahlil desteklenen lipid bilayers üstündeki açık kalan çubuk şeklinde microcompartments birkaç yüz çoğaltmalarını içerir desenli PDMS substrat üzerine yatırılır. Bu, açık bir odasında tepki ayarlanabilir ve daha sonra arabellek microcompartments, böylece küçük bir birim için tepki hapsetmesi RIM için indirilir. Olsa bile bu bölmeleri bir tarafta bir hava-tampon arabirimi ve bu nedenle bir tam 3D doğumdan membran tarafından temsil etmemektedir, protein dynamics in vivo salınımlarını10,25taklit. Tam 3D hapsi için karşılaştırıldığında, çok benzer gösteren18sonuçlar, açık microstructures tahlil nispeten basit ve kolay işlemek ve özel Havacilik ekipman ile donatılmış değil laboratuvarlar tarafından da gerçekleştirilebilir ve Temiz Oda imkanları.
Burada, MinCDE desen oluşumu için tüm bileşenleri ve kolay erişim denetimi tarafından optik mikroskobu ve minor ile sağlar bir açık odası kullanarak lipid bilayers vitro desteklenen başlamaktan için deneysel bir protokol mevcut değişiklikler, aynı zamanda yüzey-soruşturma teknikleri26için adapte olduğunu. Düzlemsel desteklenen lipid bilayers yanında, biz de ne kadar protein hapsi olabilir göstermek basit desenli desteklenen lipid bilayers PDMS microstructures çubuk şeklinde kullanarak elde. Bu deneyleri MinCDE sistemi için en iyi duruma getirilmiş olsa da ayrıca FtsZ27 veya en az aktin korteks28gibi membran ile benzer bir şekilde etkileşim diğer protein sistemlerine aktarılabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt trihydrate</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glycerol 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS crosslinker</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 and #63 both work well</td></tr><tr><td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td>used only for PDMS microstructures</td></tr><tr><td>0.5 ml reaction tube</td><td>Eppendorf</td><td>&amp;nbsp;0030123301</td><td></td></tr><tr><td>culture flask 2L</td><td>Corning</td><td>e.g. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 or 66330</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated protein purification system: &amp;Auml;kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>e.g. Model 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 mixer</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner Zepto</td><td>Diener electronic</td><td></td><td>use oxygen as process gas</td></tr><tr><td>positive displacement pipettes</td><td>Brand</td><td></td><td>Transferpettor models with glass tips</td></tr><tr><td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

Hücreleri temel kronolojik zamanmekansal organizasyonu, bir çok yönünü tepki-difüzyon türü sistemleri tarafından yönetilir. Vitro sulandırma böyle sistemleri sağlar mümkün olmaz onların temel mekanizmaları ayrıntılı çalışmalar için içinde vivo. Burada, hangi hücrenin ortasında hücre bölünmesi septum konumlandırır Escherichia coli, MinCDE sisteminin vitro sulandırma için bir protokol sağlar. Tahlil sadece kendi kendine organizasyon için gereken bileşenleri yani bir membran iki protein zihin ve maden ve enerji ATP şeklinde sağlamak için tasarlanmıştır. Bu nedenle bir açık tepki odası üzerinde desteklenen lipid bilayer kuruldu bir coverslip imal. Açık tasarım odasının lipid bilayer en uygun hazırlanması ve toplu içerik kontrollü manipülasyon sağlar. İki protein, zihin ve benim yanı sıra ATP, sonra membran üzerinde toplu cilt içine eklenir. Görüntüleme TIRF mikroskobu hem ve tasarım destekler confocal, geniş alanlı olarak birçok optik microscopies mümkündür. Protokol bir varyasyon lipid bilayer desenli bir desteğinde PDMS microstructures hücre şeklinde cam yerine üzerinde oluşturulur. Bu bölmeler kenarında toplu çözüm düşürücü tepki daha küçük bir kompartımanda içine alır ve in vivo salınım davranışını taklit izin sınırları sağlar. Birlikte ele alındığında, biz MinCDE sistemi ile ve kayma hapsi, olmadan reconstitute için protokolleri araştırmacılar tam konsantrasyon aralıkları ve diğer faktörler eklenmesi gibi desen oluşumu etkileyen tüm özelliklerini yönetmeniz için izin tarif ya da proteinler ve sistematik olarak nispeten basit deneysel ayarı sistem karmaşıklığı artırmak için.

Bizim protokol sonrası protein saflaştırma Min proteinler yeterli saflık verim. Bir referans olarak, zihin, zihin, benim ve MinC fluorescently etiketli SDS-sayfa görüntüsünü resim 1 sağlar. Fayans kendi kendine organizasyon tahlil desteklenen lipid sigara desenli bilayers üzerinde gerçekleştirmek için yordam tek tek adımları Şekil 2' de açıklanmıştır. Bu iletişim kuralını kullanan, düzenli fayans yüzey dalgaları seyahat odası (Şekil 3) görülebilir. Dalga boyunu biraz odası içinde değişir, ancak genel olarak desen benzer. (Bkz. Şekil 3 c) UV tutkal formunda cama daha farklı özellikleri var gibi membran yüzey gibi odası kenarlarını nicel karşılaştırmalar için kullanılmamalıdır. Seyahat yüzey dalgaları yayılma yönünde (Şekil 3B) boyunca yoğunluk komplo tarafından çözümlenebilir. Floresans yaylalar oldukça hızlı öncü--dan belgili tanımlık sallamak ve keskin firar kenarında azalır unutmayın, maden floresans zihin dalga başından beri hemen hemen doğrusal olarak artar ve onun en büyük zihin sonra firar kenarında eriştiği nerede o belirgin6düşüyor.
Protein kalitesi yanında, desteklenen lipid bilayers kalitesini en MinCDE bir düzenli kendi kendine organizasyon için önemlidir. Bir yandan membran çok aşırı derecede yıkanır veya temel yüzey temizlenir ve böylece güçlü kullanılıyorsa, membran içinde delikler oluşabilir (Şekil 6A, üst). Öte yandan membran düzgün yıkanmış değil veya temel yüzey temizliği/hydrophilized değil, veziküller membran için sopa veya membran akışkanlık tehlikeye girer (Şekil 6A, alt). Düz-se bile değil gibi belirgin gibi membran etiketli lipidler üzerinden doğrudan gözlem zaman, bu sorunların da zihin floresans sinyalini gibi desenleri değil düzenli ve floresan maxima içinde homojen değil ama "delik" içerir tespit edilebilir veya parlak noktalar Şekil 6Aorta masası gösterildiği gibi.
Çubuk şeklinde PDMS microstructures içinde fayans kendi kendine organizasyon için yordamı Şekil 4' te özetlenmiştir. Proteinler ve yağlar yeniden kullanılabilir gibi düzenli olarak yapılmasını planlamıştı, birkaç protokol adımları uygulamanız gerekmez. Sigara desenli yüzeyler üzerinde yüzey temizlenir ve (plazma temizleme tarafından) hydrophilized, desteklenen lipid bilayer PDMS üzerinde oluşturulur ve kendi kendine organizasyon tahlil 200 µL hacmindeki kurmak gibi. Uygun bir membran oluşturmuştur ve fayans membran üzerinde kendi kendini düzenler denetlemek için odaları görüntüsü. Uygun bir membran yüzey dalgaları arasında bireysel microstructures PDMS yüzeyinde düzenli seyahat fayans formlar oluşturulmuştur ve dalgalar serbestçe mümkün olduğunca da microstructures alt kısmında kendi kendine organize zaman tüm hareket membran kaplı yüzey (Şekil 5A). Tamamen kuru olmalıdır arabellek kaldırıldıktan sonra yüzey bölmeleri arasında herhangi bir yayılıyor fayans modelleri (5B rakam), gösterecektir değil. Fayans modelleri hala hareket ediyor, daha fazla arabellek kaldırılması gerekiyor. Proteinler şimdi çubuk şeklinde microcompartments membran kaplı PDMS ve hava üst arabirimde hangi onlar kendi kendine organize edecek (Şekil 5C) tarafından sınırlı. Bu koşullar altında iki protein Şekil 5 diçinde gösterildiği gibi kutup kutup salınım gerçekleştirebilir. Bir kısmını zihin ve benim her zaman membran bağlı olduğu gibi Ayrıca arabellek kaldırma sırasında arabellek çıkarıldıktan sonra konsantrasyonları konsantrasyonları giriş için karşılaştırılabilir değildir. Arabellek kaldırma önce desen konumunu bağlı olarak bu etkisi nedeniyle konsantrasyonları arasındaki bireysel microstructures aynı coverslip üzerinde de değişir. Silikon Gofret üretim veya PDMS kalıplama silikon gofret üzerinden analiz (Şekil 6B) için kullanılamaz eksik microstructures neden olabilir. Ayrıca, arabellek nedeniyle kaldırma microstructures işlemi sırasında kuru ve bu nedenle, daha fazla çözümleme (Şekil 6B) tutulmalıdır. Sonuç olarak microstructures bir odasında sadece bir kısmını istenen pole pole salınımlar gösterir. Microstructures protein dinamiklerini analiz etmek için bir kymograph tüm yapısı (Şekil 5E) üzerinde bir seçim çizerek elde edilebilir. MinCDE salınım pole pole, MinC ve zihin zaman ortalama bir konsantrasyon gradyan yuvası kutuplarda maksimum konsantrasyon ve en az konsantrasyon ile bölme (Şekil 5F) ortasında gösterecektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Şekil 1: SDS-sayfa protein purifications nihai ürünler gösteriliyor. O'nun-zihin (33.3 kDa), O'nun-eGFP-US (60.1 kDa), O'nun-mRuby3-US (59.9 kDa), O'nun-MinE (13,9 kDa) ve O'nun MinC (28,3 kDa) sırada gösterilir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Şekil 2: işlem akışı Diyagram tek tek adımları gösteren ve zamanlama üzerinde desteklenen lipid sigara desenli bilayers (adım 1-6) kendi kendine bir organizasyon için protokolün. Kesikli kutuları şu iki seçenekten birini temizlemek için kullanılabilir gösterir. Daireler tarafından işaretlenmiş oklar nerede protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başladı gösterir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Şekil 3: fayans tahlil tarafından confocal mikroskobu Imaging. A) düzenli Min sarmal, hangi dalga yayılma hızı, yoğunluk arsa ve hız ölçümleri elde edilebilir. Kullanılan konsantrasyonları: 0.6 µM, zihin (% 30 eGFP-MinD) 1.8 O'nun µM madeni (% 30 O'nun-maden-Alexa647) B) örnek normalleştirilmiş yoğunluğu Arsa bölge için işaretlenmiş A'ya C) tüm tahlil odası genel bakış (ölçek çubuğu: 1 mm, olarak aynı protein konsantrasyonları yukarıda). Her iki yönde de hedef desenler görülebilir dönüm spiraller. Büyütülmüş bölgesi nasıl dalga kalıpları UV uyuşmuşhalde farklılık gösterir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Şekil 4: işlem akışı Diyagram tek tek adımları gösteren ve zamanlama çubuk şeklinde microstructures (adım 1-5, 7, 8) içinde kendi kendine organizasyon için protokolün. Gri kutuları nereye ürünleri yeniden kullanılabilir merdivenlerinde protokolü üzerinden desteklenen lipid sigara desenli bilayers gösterir. Daireler tarafından işaretlenmiş oklar nerede protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başladı gösterir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Şekil 5: fayans için temsil edici sonuçlar desen çubuk şeklinde PDMS microcompartments oluşumu. A) fayans kendi kendine organize yüzey dalgaları seyahat oluşturan PDMS yüzeyinde (1 µM MinD (% 30 EGFP-zihin), 2 µM benim ve 2.5 mM ATP). B) sonra arabellek microstructures yüksekliğe indirilir, protein kendi kendine organizasyon düzlemsel yüzey microcompartments arasında durur. C) şematik bir çubuk şeklinde microcompartment. D) fayans pole pole salınımlarını arabellek çıkarıldıktan sonra temsilcisi görüntüler. E) D içinde gösterilen vurgulanan hattı boyunca titreşimler Kymograph). F) görüntü ve profil-serisi D içinde gösterildiği zaman ortalama floresans yoğunluk) açıkça maksimal microcompartment Polonyalılar ve bölme orta, en az protein degrade gösterilen. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Şekil 6: negatif deneysel sonuçlar örnekleri. A) aşırı yıkanmış membranlar birikir delik, suboptimal. sivilce ürünleri ve lipit kompozisyonları veziküller yapışmasını için kurşun iken. İki merkezi panelleri sorunları ve nasıl onlar Min salınımlarını gözlemleyerek zaman görünür hale gelir bir arada göstermek. Membranlar ile % 0.05 etiketli Atto655-DOPE. (ölçek çubukları: 50 µm) B) üst panel: kurudu microcompartments çok fazla arabellek kaldırma veya arabellek zaman içinde buharlaşır neden olabilir. Alt paneli: eksik bölmeleri Gofret üretim veya PDMS döküm sırasında oluşmuş. (ölçek çubukları: 30 µm) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 1: Plazmid harita onun zihin için. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 2: Plazmid harita His-EGFP-US için. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 3: Plazmid harita His-mRuby3-US için. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 4: Plazmid harita benim onun için. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 5: Plazmid harita MinC onun için. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 6: Microcompartments çubuk şeklinde silikon gofret için CAD dosyası. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

12.1K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Biochemistry. Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Video: In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biyokimya

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Biyomühendislik

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Lipid Membranlar Üzerinde Işık Kontrollü Tersinir Protein Deseni

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Yazar Spotlight: Yapay Hücresel Sistemlerde Tersinir Modelleme için Fotoğraf Değiştirilebilir Protein Alımı

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için