우리는 마이클 Heymann 감사 하 고 실리콘의 생산에 대 한 프랭크 Siedler 웨이퍼, 단백질 정화와 사이먼 Kretschmer에 핵심 시설 MPI-B와 레온 해 링 턴 원고에 대 한 의견.

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저자는 공개 없다.

우리는 설명 하는 프로토콜 평면에 MinCDE 자기 조직화의 생체 외에서 재구성 지원 지질 bilayers 및 지질 bilayer 적용 3 차원 구조, 막대 모양의 PDMS 마이크로 구조의 예를 사용 하 여. 이러한 분석에서 중요 한 데이터를 얻기 위해 제어에 가장 중요 한 요소는 단백질 및 막 품질.
단백질, 단백질 품질을 보장 하기 위해 질량 SDS 페이지와 질량 분석을 사용 하 여 확인 한다. 또한, 그것은 단백질은 가용성과 하지 집계 분석 젤 여과 또는 동적 산란을 사용 하 여 확인 되어야 한다. 젤 여과 단백질의 모든 집계 분수를 제거 하려면 사용할 수 있습니다. 주의 깊은 pH 조정 및 추가 된 뉴클레오티드의 품질은 매우 중요, 단백질 비 조정 또는 부분적으로 저하 된 뉴클레오티드의 추가 주식 또는 자체 조직 분석 실험 단백질 활동, 따라서 폐지를 제거 하기에 충분 자기 조직입니다.
단백질 품질, 옆 막 품질이 가장 중요 한, 그리고 부적 절 한 막 형성은 가장 종종 결함이 자기 조직과 artefactual 표면 구조의 기원에 대 한 원인.
처음으로 프로토콜을 수행할 때 낮은 어 금 니 비율에서 Atto-655-마약 등 DiI 레이블이 지질 (0.05%)를 포함 하 여 지원된 지질 bilayers를 도움이 됩니다. 따라서 속성 및 막의 품질 수 판단 직접. FRAP를 사용 하 여 막의 유동성 평가 될 수 있다. 서 있을 것입니다 중 하나 너무 많은 소포, 아니 유체 막 또는 아무 막, 떨어져 세척 되는 경우 또한, 하나 직접는 SLB의 세척의 품질을 평가할 수 있습니다. 오픈 챔버 접근 방식은 엄격 하 게, 막 씻어 수 그리고 그러므로 또한 소포는 SLB의 표면에 고정을 제거 하. SUV 크기와 크기 분포를 사용 하 여 도움이 될 수는 청소와 화란 지원 표면 및 올바른 크기의대 수의 유체 및 균질 성 지원된 지질 bilayers는 얻기 위해 가장 중요 한 요인 동적 빛 비 산. 좁은 크기 분포에 대 한 그들을 sonicating 보다는 소포를 압출 하는 것이 좋습니다. 다른 방법 청소 coverslips, 강한 기초, 기본 세제, 또는 coverslips를 사용 하 여 직접 물으로 rinsing 후 치료 예를 들어, 응용 프로그램 및 지질 혼합물에 따라 좋은 결과 얻을 수 있습니다.
여기, 오픈 실에서 평면 지원된 지질 bilayers에 생체 외에서 재구성에 제시 된 프로토콜의 첫 번째 절반 표면 TIRF 현미경30, FRAP 같은 광학 microscopies 위한 렌더링의 이점이 있다 분석6,34, 원자 힘 현미경 검사 법26같은 표면 감지기 기술을 추적 단일 입자. 큰 균질 지역 정의 된 농도에서 더 나은 통계 수 있습니다. 또한 오픈 챔버 접근 단백질 농도 및 구성 요소 추가, 따라서 적정 단일 챔버20에 단백질 농도를 허용에 대 한 신속 하 고 간단한 추가 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 분석 결과 또한 FtsZ22,35, ZipA22 또는 공상 단백질 FtsZ YFP MTS10,35같은 다른 세균성 divisome 구성 요소를 추가 하 여 확장할 수 있습니다.
다른 그룹 분 시스템에는 생체 외에서오픈 챔버17,,1819대신 사용 흐름-셀 재구성에 유사한 접근 방식을 갔다. 흐름 세포 특정 이점이 있다, 특히 때 완전히 동봉 된 3D 환경 필요한18흐름17,,1923 의 영향 인지 MinCDE 패턴에 막 구성23 조사, 또는 단백질 패턴 제한 조건19단백질에서 관찰 될 경우. 그럼에도 불구 하 고, 분자 농도의 로컬 제어는 더 어렵습니다. 막 단백질 구성 요소, 특히 마음에 의하여 강하게 바인딩할 그들은 먼저18,19발생. 우리의 경험에서는, 단백질은 자주 튜브, 후미, 주사기 및 다른 미세 부품 비 특정 바인딩 전시. 따라서, 지방 단백질 농도 다 입력된 농도18 를 또한19다른 사람에 의해 관찰로 입구와 출구 사이 막에 다른 단백질 패턴의 다양 한 결과 흐름 셀의 길이에 따라 달라.
프로토콜의 절반 여기, 막대 모양의 마이크로 구조 다시 지질 적용 패턴된 지원에 오픈 챔버 방식을 사용 하 여에서 생체 외에서 재구성에 제시 된 두 번째 bilayers vivo에서 단백질 동작의 단순한 모방에 대 한 허용 비록 단백질 농도 정밀 하 게 제어 버퍼 제거 손실입니다. Note는 MinDE의 파장은 대략 1 개의 크기 순서 때문에 더 큰 생체 외에서 vivo에서 막대 모양의 microcompartments는 또한 1 개의 크기 순서 더 큰 (10 x 30 µ m) 막대 모양의 대장균 보다에 대 한 셀.
전반적으로,이 프로토콜 단백질 농도, 막 속성, 버퍼 구성 등 모든 조건 정밀 하 게 제어할 수 있습니다. 3 차원 구조적된 지원 사용 vivo에서 복잡 한 마이크로 장비에 대 한 필요 없이 행동을 흉내 낸 공간 감 금에서 공부를 반응이 있습니다.

Spatiotemporal 패턴 자연, 다세포과 세포 수준에, 통제 세포 분열1,2morphogenesis에서 복잡 한 작업을 모두 조절에 필수적입니다. 반응 유포 시스템 이러한 패턴을 수립에 중요 한 역할 하지만 아직도 잘 이해 된다. 반응 유포 시스템 그리고 최고의 특징이 생물학적 시스템의 대표적인 사례는 지금까지 대장균 MinCDE 시스템3,,45,6,7입니다. MinCDE 시스템 대장균 미래 사단 사이트로 셀의 가운데를 확인 하기 위해 장 대 셀에 셀 극에서 진동. 이 시스템은 ATPase 마음, 광산, 및 공간 반응 매트릭스8로 막 단백질을 활성화 ATPase 기반으로 합니다. MinC는 패턴 형성 메커니즘의 일부 이지만 실제 기능 에이전트: 주요 divisome 단백질 FtsZ5,6의 억제제. MinC 마음에 바인딩하고 따라서 다음과 같이 진동, 셀에서 최대한 이며 셀 중간에 최소한의 시간 평균 단백질 농도 기온 변화도 결과로 midcell9,10에서 유해를 FtsZ 허용 . MinCDE 시스템 위치를 수송 하는 단백질 복합물11 및 플라스 미드12 와 셀을 규제에 대 한 박테리아2, spatiotemporal 조직에 중요 워커 A ATPases의 가족의 일부입니다. 부문13 와 염색체 분리14. 따라서, MinCDE 반응 확산 시스템 뿐만 아니라 원형 반응-보급 시스템 나타내지만 또한 박테리아에 spatiotemporal 조직에 대 한 그것의 관련성 때문에 관심을 끌었다 있다.
MinCDE 시스템에는 vivo에서 의 상세한 기능 연구는 복잡 한, 단백질 및 유전자 삭제의 조작 일반적으로 세포 분열 결함 발생. 또한, 막 구성 또는 vivo에서 cytosol의 속성을 변경 하는 것은 매우 도전적인15,16. 시스템 및 요소에 영향을 미치는 변경 경우 세포 분열으로 같은 필수적인 기능에 방해 되는 셀의 복잡 한 환경에서 더욱 그렇게 해석 하는 하드 있다. 우리와 다른 그러므로 아닙니다 생체 외에서 재구성 접근, 시스템의 핵심 구성 요소에 감소: 마음, 에너지 원으로 ATP와 반응 매트릭스6,17, 로 지원된 지질 bilayer 내 18.이 상향식 접근 방식을 자세히 복잡 하지 않고 살아있는 세포의 자기 조직화의 메커니즘을 수 있습니다. 여행 표면 단백질 양식 파도6 와 다른 종류 패턴17,19 이러한 조건 하에서 파장으로는 비보에보다 큰 크기에 대 한 일반적으로 이기는 하지만. 개방 챔버를 사용 하 여 용이 하 게 정밀 하 게 제어할 패턴 형성에 영향을 미치는 모든 측면: 단백질 농도6, 단백질 속성20, 막 구성10, 버퍼 구성, 및 ATP 농도 6, 뿐만 아니라 대리인21 와 다른 divisome 단백질22를 크롤 링 하는 등 다른 요인의 추가. 비교에서는, 흐름 셀18,,1923 에 MinCDE 시스템의 생체 외에서 재구성 프로브 흐름17,23, 단백질의 영향을 사용할 수 있습니다. 제한 조건19, 막 구성19 와 단백질 패턴에 풀 3D 감18 하지만 단백질/구성 요소 농도 및 순차적 구성 요소 또한 훨씬 더 복잡 한 컨트롤을 렌더링 합니다.
우리는 하나 어떻게 기하학적 경계 영향 패턴 형성21, 최근에 현상을 프로브 수 있습니다 평면 지질 bilayers의 지원 또한 모방이 오픈 챔버를 사용 하 여, 또한 조사 되어 vivo에서 박테리아를 사용 하 여 마이크로 구조7으로 성형. 우리 또한이 분석 결과 내에서 어떻게 정의 된 돌연변이 조사 시스템20의 영향을 패턴 형성 고용. 또한, 동일한 기본적인 분석 결과 형식 빛, 분석 결과에 아조 가교 된 광산 펩 티 드를 소개 하 고 TIRF 현미경24이미징 패턴 형성을 제어 하는 방법은 조사 하 고용 하고있다.
우리는, MinDE 패턴을 복제 하기 위해 형성 관찰 vivo에 는 체 외에서 시스템, 감 금 했다 키 발견. MinDE 극-극 진동 및 단백질 그라데이션 형성 의 재구성을 허용 지원된 지질 bilayer와 입은 MinDE에서 생체 외에서 (10 x 30 µ m)의 더 큰 파장을 조정 하는 크기와 막대 모양의 microcompartments를 사용 하 여 10,25. 이 분석 결과에 지원된 지질 bilayers는 위에 열려 있는 막대 모양 microcompartments의 몇 백 복제본을 포함 하는 꽃무늬 PDMS 기판에 입금 됩니다. 이것에 의해, 반응 챔버를 오픈에서 설정할 수 있습니다 그리고 이후에 버퍼 microcompartments, 그로 인하여 수감 작은 볼륨에 대 한 반응의 가장자리를 인하 됩니다. 이러한 구획 한쪽에 어 버퍼 인터페이스 있고 따라서 막 풀 3D 감 변하지 않습니다, 비록 단백질 역학 유사 진동10,25 vivo에서 . 풀 3D 감 금에 비해 매우 유사 하 게 보여 주는 결과18, 오픈 마이크로 구조 분석 결과 비교적 간단 하 고 쉽게 처리 하 고 또한 하지 전문된 마이크로 장비를 갖춘 실험실에 의해 수행할 수 있습니다 및 클린 룸 시설입니다.
여기, 우리 현재 MinCDE 패턴 형성에 지질 bilayers에서 지원 체 외에서 광학 현미경에 의해 그리고, 미성년자의 모든 구성 요소와 쉽게 액세스 제어 허용 하는 오픈 챔버를 사용 하 여 재구성 하는 실험 프로토콜 수정, 표면 조사 기법26에 대 한 적응도. 평면 지원된 지질 bilayers 옆 우리는 또한 단백질 감 수 어떻게 표시 막대 모양의 PDMS 마이크로 구조에 간단한 패턴된 지원된 지질 bilayers를 사용 하 여 얻을. 이 분석 실험, 비록 MinCDE 시스템에 최적화 된 옮겨질 수 있다 또한 FtsZ27 등 최소한의 걸 피28막과 유사한 방식으로 상호 작용 하는 다른 단백질 시스템.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt trihydrate</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glycerol 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS crosslinker</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 and #63 both work well</td></tr><tr><td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td>used only for PDMS microstructures</td></tr><tr><td>0.5 ml reaction tube</td><td>Eppendorf</td><td>&amp;nbsp;0030123301</td><td></td></tr><tr><td>culture flask 2L</td><td>Corning</td><td>e.g. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 or 66330</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated protein purification system: &amp;Auml;kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>e.g. Model 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 mixer</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner Zepto</td><td>Diener electronic</td><td></td><td>use oxygen as process gas</td></tr><tr><td>positive displacement pipettes</td><td>Brand</td><td></td><td>Transferpettor models with glass tips</td></tr><tr><td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

셀의 기본 spatiotemporal 조직의 여러 측면 반응 유포 형식 시스템에 의해 규율 됩니다. 이러한 시스템의 재구성 생체 외에서 가능 하지 않을 것 이라고 그들의 기본 메커니즘의 상세한 연구에 대 한 허용 vivo에서. 여기, 우리는 생체 외에서 의 대장균, 셀 중간에는 세포 분열 심장 MinCDE 시스템의 재구성에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 분석 결과 구성 요소만 자기 조직에 필요한 즉 막, 두 단백질 마음 및 광산 및 ATP의 형태로 에너지를 공급 하도록 설계 되었습니다. 우리는 그러므로 지원된 지질 bilayer 형성 되는 coverslip에 오픈 반응 챔버를 조작. 챔버의 오픈 디자인 지질 bilayer의 최적의 준비 및 대량 콘텐츠 제어 조작에 대 한 수 있습니다. 두 단백질, 마음 및 광산,으로 ATP, 다음 막 위에 대량 볼륨에 추가 됩니다. 영상은 디자인 지원 confocal, 넓은 필드와 비슷하게 TIRF 현미경으로 많은 광학 microscopies에 의해 가능 하다. 프로토콜의 변이에서 지질 bilayer는 셀 모양의 PDMS 마이크로 구조, 유리 대신에 패턴된 지원에 형성 된다. 이 구획의 가장자리에 대량 해결책을 낮추는 작은 구획에는 반응의 포함 하 고 vivo에서 진동 동작의 흉내 낸 수 있는 경계를 제공 합니다. 함께 찍은, 우리 설명 MinCDE 시스템 모두와 함께 공간 감 금 없이 다시 구성할 프로토콜 연구원은 정확 하 게 농도 범위 등 다른 요인의 추가 패턴 형성에 영향을 미치는 모든 측면을 제어할 수 있도록 또는 단백질, 그리고 체계적으로 비교적 간단한 실험 설치 프로그램에서 시스템의 복잡성을 증가.

단백질 정화 우리의 프로토콜에 따라 적절 한 순도의 분 단백질 항복 한다. 참고로, 그림 1 붙일 마음, 광산, 그리고 MinC 이라는 마음의 SDS 페이지 이미지를 제공 합니다. 꽃무늬 비 지원된 지질 bilayers에 MinDE 자기 조직 분석 결과 수행 하는 절차의 각 단계는 그림 2에 설명 되어 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 표면 파를 여행 하는 일반 MinDE 챔버 (그림 3)에 걸쳐 관찰할 수 있습니다. 파장은 챔버 내에서 약간 다를 수 있습니다 하지만 일반적 패턴 유사. 챔버의 가장자리 형태 UV 접착제에는 유리에 보다 다른 특성을가지고 것 막 표면 ( 그림 3C참조)으로 양적 비교를 위해 사용할 수 없습니다. (그림 3B) 전파 방향에 따라 강도 그려서 여행 표면 파를 분석할 수 있습니다. 마음 형광 파의 앞 가장자리에서 오히려 빨리 정점 다음 후행 가장자리에서 급격히 감소, 동안 광산 형광 마음 물결의 시작부터 거의 선형으로 증가 하 고 후행 가장자리에 마음 후 최대에 도달 어디 그것 6현저 하 게 떨어져 떨어진다.
단백질 품질 옆 지원된 지질 bilayers의 품질이 MinCDE의 일반 자기 조직에 대 한 가장 중요 합니다. 한 손으로 막 너무 지나치게 씻어 또는 기본 표면 청소 되었고 따라서 너무 강하게 충전, 구멍 형성할 수 있습니다 멤브레인 (그림 6A, 상단). 다른 한편으로 막 제대로 세척 되지 또는 기본 표면 청소/hydrophilized 하지 않습니다, 경우 소포 막에 붙어 것입니다 또는 막 유동성 위험 해질 것 이다 (그림 6A, 하단). 비록 하지으로 명백한 레이블이 지질 통해 직접 막 관찰 하는 경우 이러한 문제 수 또한 검출 될 마음 형광 신호에서 패턴은 일반 고는 맥시 마에 형광 균일 하지만 "구멍"를 포함 하거나 그림 6A의 중간 패널에 표시 된 밝은 명소.
막대 모양의 PDMS 마이크로 구조에서 MinDE 자기 조직에 대 한 절차는 그림 4에 요약 됩니다. 몇 가지 프로토콜 단계 필요가 없습니다 반복 될 것으로 단백질과 지질을 다시 사용할 수 있습니다. 처럼 비 패턴이 기판에 기판 청소 (플라즈마-청소)에 의해 hydrophilized, 지원된 지질 bilayer는 PDMS에 형성 되 고 자기 조직 분석 결과 200 µ L의 볼륨에 설정 되어. 적절 한 막 형성 하고있다 MinDE 자체 막에 구성 확인에 실은 몇 군데. 적절 한 막 형성 되었습니다, MinDE 양식 일반 개별 마이크로 구조 사이 PDMS의 표면에 표면 파를 여행 하 고 또한 자체 구성 마이크로 구조는의 밑에 파도 자유롭게 할 수 있는 전체를 통해 이동 막으로 덮인 표면 (그림 5A). 버퍼 제거 후, 구획 사이 표면 해야 보여주지 전파 MinDE 패턴 (그림 5B), 그것은 완전히 건조 되어야 합니다. MinDE 패턴은 여전히 이동, 더 많은 버퍼를 제거 해야 합니다. 막 입은 PDMS와 상위 인터페이스 (그림 5C), 있는 그들은 자기 조직에 공기 단백질은 이제 막대 모양 microcompartments에 국한 됩니다. 이러한 조건 하에서 두 가지 단백질 그림 5D와 같이 극-극 진동 수행할 수 있습니다. 마음과 나의 일부분은 항상 막 도약, 또한 버퍼 제거 하는 동안 버퍼 제거 후 농도 없습니다 입력 농도 비교. 이 효과 농도 또한 다 같은 coverslip에 개별 마이크로 구조 사이 그들은 버퍼 제거 하기 전에 패턴의 위치에 따라. 실리콘 웨이퍼 생산 또는 실리콘 웨이퍼에서 PDMS 조형 분석 (그림 6B)에 대 한 사용할 수 없는 불완전 한 마이크로 구조에서 발생할 수 있습니다. 또한, 버퍼 때문 제거 마이크로 구조 그리고 과정에서 건조 수 있습니다 따라서, 추가 분석 (그림 6B)에서 제외 해야 합니다. 결과적으로 한 챔버에 마이크로 구조의 일부 분 일 뿐인 원하는 극-극 진동 보여줍니다. 단백질은 마이크로 구조 역학을 분석 하는 kymograph는 전체 구조 (그림 5E) 선택 여 얻어질 수 있다. 때 MinCDE 극-극에서 흔들 리 다, MinC와 마음 구획 (그림 5F) 중간 구획에서 최대 농도와 최소 농도 시간 평균 농도 그라데이션 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> 그림 1: 단백질 담긴의 최종 제품을 보여주는 SDS 페이지. 그의 마음 (33.3 kDa), 그의 eGFP 마음 (60.1 kDa), 그의 mRuby3 마음 (59.9 kDa), 그의 광산 (13.9 kDa)와 그의 MinC (28.3 kDa) 순서로 표시 됩니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> 그림 2: 개별 단계와 비 꽃무늬 지원된 지질 bilayers (1-6 단계)에 자기 조직에 대 한 프로토콜의 타이밍 프로세스 흐름 다이어그램. 점선된 상자 청소를 위해 사용할 수 있습니다 이러한 두 가지 옵션 중 하나를 나타냅니다. 원으로 표시 된 화살표는 프로토콜을 일시 중지 하 고 나중에 다시 시작할 수 있습니다 어디를 나타냅니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> 그림 3: confocal 현미경 검사 법에 의해 MinDE 분석 결과의 이미징. A) 일반 분 나선형, 어떤 파 전파 속도, 강도 플롯 및 속도 측정을 얻을 수 있습니다. 사용 농도: 0.6 µ M (30 %eGFP-마음), 마음이 1.8 µ M 그의-광산 (30% 그의-광산-Alexa647) B) 지역에 대 한 예제에서는 정규화 된 강도 음모 a에서 표시 C) 전체 시험 챔버의 개요 (눈금 막대: 1mm로 동일한 단백질 농도 위). 뿐만 아니라 대상 패턴을 관찰할 수 있다 어느 방향으로 돌고 나선. 확대 지역 웨이브 패턴 UV 접착제에 다 하는 방법을 보여 줍니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> 그림 4: 개별 단계와 막대 모양의 마이크로 구조 (단계 1-5, 7, 8)에서 자기 조직에 대 한 프로토콜의 타이밍 프로세스 흐름 다이어그램. 회색 상자 단계 제품을 다시 사용할 수 있는 프로토콜에서 비 꽃무늬 지원된 지질 bilayers에 나타냅니다. 원으로 표시 된 화살표는 프로토콜을 일시 중지 하 고 나중에 다시 시작할 수 있습니다 어디를 나타냅니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> 그림 5: MinDE에 대 한 결과 대표적인 패턴 막대 모양의 PDMS microcompartments에 형성. A) MinDE 표면 파도 여행 형성 PDMS의 표면에 자체 구성 (1 µ M 마음 (30 %EGFP-마음), 2 µ M 내와 2.5 m m ATP). B) 단백질 자체 조직에서 microcompartments 사이의 평면 표면에 중지 후 버퍼는 마이크로 구조의 높이를 낮 췄 다. C) 1 개의 막대 모양 microcompartment의 도식. D) MinDE 극-극 진동 버퍼 제거 후의 대표 이미지. E) D에 표시 된 강조 표시 된 줄을 따라 진동의 Kymograph). F) 이미지와 프로필 D에 표시 된 시계열의 평균 형광 강도의) 명확 하 게 보여주는 microcompartment 기둥에 최대한 고 구획 중에서 최소한의 단백질 그라데이션. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> 그림 6: 부정적인 실험 결과의 예. A) 차선 소포 준비 및 지질 구성 소포 튀어나와 이어질 동안 지나치게 씻어 막 구멍, 축적. 두 센터 패널 모두 문제 하 고 어떻게 그들이 분 진동 관찰의 조합을 표시 합니다. 막 0.05%로 표시 했다 Atto655-마약. (바 규모: 50 µ m) B) 상단 패널: 밖으로 건조 microcompartments 너무 많은 버퍼 제거 하거나 버퍼 시간 동안 증발 하는 때 발생할 수 있습니다. 하단 패널: 불완전 한 구획 웨이퍼 생산 또는 PDMS 성형 동안 형성 될 수 있다. (바 규모: 30 µ m) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 1: 그의 마음에 대 한 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2: 그의 EGFP 마음에 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 3: 그의 mRuby3 마음에 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 4: 그의 광산에 대 한 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 5: 그의 MinC에 플라스 미드 맵입니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 6: 막대 모양 microcompartments의 실리콘 웨이퍼에 대 한 CAD 파일입니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

12.1K 조회수.  Max Planck Institute of Biochemistry. 우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

생체공학

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

지질막의 광 제어 가역적 단백질 패터닝

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

저자 스포트라이트: 인공 세포 시스템에서 가역적 패터닝을 위한 Photo Switchable Protein Recruitment

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

요약

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비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성