Ringraziamo Michael Heymann e Frank Siedler per la produzione di silicio wafer, Core Facility MPI-B per gli interventi nella purificazione della proteina e Simon Kretschmer e Leon Harrington per commenti sul manoscritto.

<ol>
	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli.">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li><li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics.">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li><li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli.">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li><li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures.">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li><li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli:+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid.">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li><li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+Escherichia+coli:+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site.">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems.">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949 (2014).</li><li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes.">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+biological+surfaces:+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria.">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li><li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MipZ,+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter.">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li><li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation.">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758 (2014).</li><li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo.">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes.">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li><li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins.">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li><li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers.">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271 (2016).</li><li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo descritto un protocollo per la ricostituzione in vitro di MinCDE auto-organizzazione su facce planari supportato lipidici e lipidici a doppio strato coperto strutture 3D, utilizzando l'esempio di asta-a forma di microstrutture PDMS. Al fine di ottenere dati importanti da queste analisi, i fattori più importanti da controllare sono qualità della proteina e della membrana.
Per garantire la qualità delle proteine, proteine massa dovrebbe essere confermato mediante SDS-PAGE e spettrometria di massa. Inoltre, occorre verificare che le proteine siano solubili e non aggregati, mediante cromatografia analitica o la dispersione della luce dinamica. Gel filtrazione può essere utilizzato per rimuovere qualsiasi frazione di aggregati di proteine. Regolazione del pH attenzione e qualità di nucleotidi aggiunto è critica, come l'aggiunta di nucleotidi non rettificati o parzialmente degradato alla proteina scorte o auto-organizzanti saggi è sufficiente ad eliminare l'attività della proteina, quindi abolizione auto-organizzazione.
Accanto alla qualità delle proteine, qualità di membrana è più critica e formazione impropria della membrana è più spesso la causa per difettosi auto-organizzazione e l'origine delle strutture superficiali artefactual.
Quando si esegue il protocollo per la prima volta, è utile etichettare i lipidici supportati includendo lipidi etichettati come Atto-655-DOPE o DiI a basse percentuali di molare (0,05%). Quindi la proprietà e la qualità della membrana può essere giudicati direttamente. Utilizzando FRAP, la fluidità della membrana può essere valutata. Inoltre, uno può valutare direttamente la qualità del lavaggio dei SLB, come ci può essere troppo molte vescicole, nessuna membrana fluida o nessuna membrana affatto, se esso è stato lavato. L'approccio di camera aperta permette di lavare rigorosamente la membrana e quindi anche per rimuovere le vescicole che stanno attaccando sulla superficie di SLB. I fattori più importanti per l'ottenimento del lipido supportato fluido e omogeneo doppii strati sono la pulizia e l'idrofilia della superficie di appoggio e la corretta dimensione e omogeneità di SUvs può essere utile controllare la dimensione del SUV e dimensioni distribuzione utilizzando diffusione dinamica della luce. Per distribuzioni di dimensione stretta, consigliamo le vescicole di espulsione, piuttosto che sonicating li. Altri metodi di pulizia vetrini coprioggetti, ad esempio, trattamenti con basi forti, detergenti base o utilizzando vetrini coprioggetti direttamente dopo il risciacquo con acqua, possono produrre buoni risultati, a seconda della miscela del lipido e di applicazione.
La prima metà del protocollo presentato qui, la ricostituzione in vitro su lipidici supportati planare in aperta chambers, ha il vantaggio di rendere la superficie accessibile per microscopie ottiche, ad esempio TIRF microscopia30, FRAP analisi6, singola particella34, come pure la sonda per superfici tecniche quali la microscopia di forza atomica26di rilevamento. La grande area omogenea consente migliori statistiche alle concentrazioni definite. L'approccio di camera aperta permette inoltre di controllare con precisione la concentrazione nella proteina e una rapida e semplice aggiunta di ulteriori componenti, permettendo quindi a titolare di concentrazione nella proteina in una singola camera20. Il dosaggio può essere espanso con aggiunta di altri componenti batteriche divisome come FtsZ22,35, ZipA22 o la proteina chimerica FtsZ-YFP-MTS10,35.
Altri gruppi hanno adottato un approccio simile per ricostituire il Min sistema in vitro, ma utilizzare una cella di flusso invece di una camera aperta17,18,19. Le cellule di flusso sono determinati vantaggi, in particolare quando un ambiente 3D completamente chiuso è necessario18, l'influenza di flusso17,19,23 o membrana composizione23 modelli di MinCDE è studiato, o se pattern proteici devono essere osservati sotto proteina limitando condizioni19. Tuttavia, il controllo locale delle concentrazioni molecolari è più difficile. Componenti proteiche, soprattutto la mente, si legano fortemente alla membrana incontrano prima18,19. Nella nostra esperienza, le proteine esibiscono frequentemente legame non specifico alla tubazione, insenature, siringhe e altre parti di microfluidica. Quindi, le concentrazioni di proteina locale differiscono da concentrazioni ingresso18 e variano anche sopra la lunghezza della cella di flusso, causando una varietà di modelli differenti della proteina sulla membrana tra ingresso e uscita, come osservato da altri19.
La seconda metà del protocollo presentato qui, la ricostituzione in vitro in asta-a forma di microstrutture ri-utilizzando l'approccio di camera aperta su un supporto modellato coperto da lipidi bilayer permette per un semplice mimo di comportamento di proteina in vivo anche se un controllo preciso sulla concentrazione proteica viene perso a causa di rimozione del tampone. Si noti che perché la lunghezza d'onda di MinDE è circa un ordine di grandezza più grandi in vitro che in vivo l'asta-a forma di microcompartments sono anche circa un ordine di grandezza più grandi (10 x 30 µm) rispetto a un asta-a forma di e. coli di cella.
Nel complesso, questo protocollo consente il controllo preciso di tutte le condizioni compreso concentrazione proteica, buffer composizione e proprietà della membrana. L'utilizzo di supporti strutturati 3D consente la reazione essere studiato sotto confinamento spaziale, che imita il comportamento in vivo senza la necessità di apparecchiature complesse microfluidica.

Reticoli spatiotemporal sono essenziali nella natura, che regolano attività complesse a livello pluricellulare e cellulare, da morfogenesi a divisione cellulare regolamentati1,2. Sistemi di reazione-diffusione svolgono un ruolo importante nella creazione di questi modelli, ma sono ancora non ben compreso. Un primo esempio di un sistema di reazione-diffusione e il miglior sistema biologico caratterizzato finora è l'Escherichia coli MinCDE sistema3,4,5,6,7. Il sistema di MinCDE oscilla dal Polo di cella al Polo di cella in e. coli per determinare la metà della cella come il sito di futura Divisione. Questo sistema si basa sulla mente dell'atpasi, l'atpasi proteina d'attivazione, miniera e la membrana come una reazione spaziale matrice8. MinC non fa parte del meccanismo di formazione del modello, ma è l'effettivo agente funzionale: un inibitore della divisome principale proteina FtsZ5,6. MinC si lega alla mente e quindi segue le oscillazioni, risultante in un gradiente di concentrazione di tempo-mediata della proteina che è massima ai poli della cellula e minima al centro delle cellule, consentendo solo FtsZ a polimerizzare a midcell9,10 . Il sistema di MinCDE è parte della più grande famiglia di Walker A ATPases che sono fondamentali per l'organizzazione spazio-temporale in batteri2, per il posizionamento e trasporto della proteina complessi11 e plasmidi12 e per la regolazione delle cellule Divisione13 e cromosoma segregazione14. Quindi, il sistema di reazione-diffusione di MinCDE non solo rappresenta un sistema di reazione-diffusione archetipico, ma ha anche attirato l'attenzione per la sua importanza per l'organizzazione spazio-temporale nei batteri.
Studi dettagliati funzionali del MinCDE sistema in vivo sono complicati, come manipolazione dell'omissione del gene e proteine in genere causare difetti di divisione cellulare. Inoltre, cambiando la composizione della membrana o le proprietà del citosol in vivo è molto impegnativo15,16. Modifiche al sistema e fattori che sono difficili da interpretare nel complesso ambiente della cellula, ancor di più se è disturbato in una funzione così essenziale come la divisione cellulare. Noi ed altri abbiamo quindi girato per un approccio in vitro la ricostituzione, riducendo il sistema ai relativi componenti di base: mente, miniera, trifosfato di adenosina come fonte di energia e il doppio strato lipidico supportati come una reazione matrice6,17, 18. questo approccio bottom-up permette di sondare il meccanismo di auto-organizzazione in dettaglio senza la complessità di una cellula vivente. La forma di proteine viaggiando superficie onde6 e altri tipi di modelli17,19 in queste condizioni, anche se con una lunghezza d'onda che è di solito circa un ordine di grandezza maggiore di in vivo. L'uso di una camera aperta facilita un controllo preciso su tutti gli aspetti che influenzano la formazione di pattern: proteina concentrazioni6, proteina proprietà20, membrana composizione10, buffer composizione e concentrazione di ATP 6, anche con aggiunta di altri fattori quali affollamento agenti21 e altre proteine di divisome22. In confronto, la ricostituzione in vitro del sistema MinCDE in una cella di flusso18,19,23 può essere utilizzata per l'influenza del flusso17,23, proteina della sonda limitando le condizioni19, membrana composizione19 e confinamento 3D18 il pattern proteico, ma esegue il rendering di un controllo esatto del componente proteica/concentrazione e inoltre componente sequenziale molto più complicato.
Utilizzando questa camera aperta, abbiamo modellato anche il supporto dei planar lipidici mediante il quale uno può sondare come geometriche confini influenza modello formazione21, un fenomeno che ha recentemente stato anche studiato in vivo utilizzando batteri modellato in microstrutture7. Abbiamo impiegato anche questo test per studiare mutazioni come sono definite nella mia formazione di pattern di effetto del sistema20. Inoltre, lo stesso formato di base di analisi è stato impiegato per indagare come la formazione di pattern può essere controllato dalla luce, introducendo un peptide di miniera azobenzene-reticolato il dosaggio e di imaging con TIRF microscopia24.
Abbiamo trovato che, al fine di replicare il modello MinDE formazione osservata in vivo in un confinamento di sistema, in vitro è stata la chiave. Consentito l'utilizzo di asta-a forma di microcompartments, con dimensioni regolati alla lunghezza d'onda più grande di MinDE in vitro (10 x 30 µm), rivestito con un doppio strato lipidico supportati la ricostituzione delle oscillazioni di poli-poli MinDE e formazione di gradienti della proteina 10,25. In questa analisi, i lipidici supportati sono depositati su un substrato PDMS fantasia che contiene repliche diverse centinaia di microcompartments a forma di bastoncello che rimangono aperti in alto a sinistra. In questo modo, la reazione può essere impostata in una camera aperta, e successivamente il buffer viene abbassato al bordo del microcompartments, limitando quindi la reazione di un piccolo volume. Anche se questi scomparti hanno un'interfaccia aria-buffer su un lato e quindi non rappresentano un confinamento 3D completo di membrana, le dinamiche di proteina ha imitato in vivo oscillazioni10,25. Rispetto al confinamento 3D completo, che mostra molto simili risultati18, l'analisi di microstrutture aperto è relativamente semplice e facile da gestire e può essere eseguita anche da laboratori che non sono dotati di attrezzature specializzate microfluidica e Servizi in camera pulita.
Qui, presentiamo un protocollo sperimentale per la ricostituzione MinCDE formazione di pattern su supportato dei lipidi bilayer in vitro utilizzando una camera aperta che permette di controllare tutti i componenti e facile accesso mediante microscopia ottica e, con minore modifiche, inoltre è adattabile per tecniche di superficie-sonda26. Accanto a planare lipidici supportati, mostriamo anche come confinamento della proteina può essere ottenuto utilizzando lipidici supportati fantasia semplice su asta-a forma di microstrutture PDMS. Queste analisi, anche se ottimizzato per il sistema di MinCDE, possono essere trasferite anche ad altri sistemi di proteine che interagiscono in modo simile con la membrana, ad esempio FtsZ27 o una corteccia di actina minimo28.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt trihydrate</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glycerol 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS crosslinker</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 and #63 both work well</td></tr><tr><td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td>used only for PDMS microstructures</td></tr><tr><td>0.5 ml reaction tube</td><td>Eppendorf</td><td>&amp;nbsp;0030123301</td><td></td></tr><tr><td>culture flask 2L</td><td>Corning</td><td>e.g. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 or 66330</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated protein purification system: &amp;Auml;kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>e.g. Model 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 mixer</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner Zepto</td><td>Diener electronic</td><td></td><td>use oxygen as process gas</td></tr><tr><td>positive displacement pipettes</td><td>Brand</td><td></td><td>Transferpettor models with glass tips</td></tr><tr><td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

Molti aspetti dell'organizzazione spatiotemporal fondamentale delle cellule sono regolati dai sistemi del tipo di reazione-diffusione. In vitro la ricostituzione di tali sistemi permette per studi dettagliati dei loro meccanismi di fondo che non sarebbe fattibile in vivo. Qui, forniamo un protocollo per la ricostituzione in vitro del sistema MinCDE di Escherichia coli, che posiziona il setto di divisione delle cellule nel mezzo delle cellule. Il dosaggio è stato progettato per fornire solo i componenti necessari per l'auto-organizzazione, vale a dire una membrana, le due proteine mente e MinE ed energia sotto forma di ATP. Abbiamo pertanto fabbricare una camera di reazione aperta su un vetrino coprioggetti, su cui si forma un doppio strato lipidico supportati. Il design aperto della camera permette per la preparazione ottimale del bilayer del lipido e manipolazione controllata dei contenuti alla rinfusa. Le due proteine, mente e MinE, nonché ATP, vengono quindi aggiunti nel volume di massa sopra la membrana. La formazione immagine è possibile da molti microscopie ottiche, come i supporti di progettazione confocale, grandangolari e microscopia TIRF allo stesso modo. In una variante del protocollo, il doppio strato lipidico è formato su un supporto di fantasia, su microstrutture PDMS a forma di cellulare, invece di vetro. Abbassando la soluzione di massa fino all'orlo di questi comparti racchiude la reazione in un vano più piccolo e fornisce i confini che permettono che imita di in vivo comportamento oscillatorio. Presi insieme, descriviamo i protocolli per ricostituire il sistema MinCDE sia con che senza confinamento spaziale, consentendo ai ricercatori di controllare con precisione tutti gli aspetti che influenzano la formazione di pattern, ad esempio intervalli di concentrazione e l'aggiunta di altri fattori o proteine e sistematicamente aumentare la complessità del sistema in un relativamente semplice messa a punto sperimentale.

Purificazione della proteina seguendo il nostro protocollo dovrebbe produrre proteine Min di purezza adeguata. Come riferimento, la Figura 1 fornisce un'immagine di SDS-PAGE della mente, fluorescente etichettati mente, MinE e MinC. I singoli passaggi della procedura per eseguire un test di auto-organizzazione di MinDE su non-fantasia lipidici supportati sono descritti nella Figura 2. Usando questo protocollo, regolari MinDE viaggiare le onde di superficie possa essere osservati durante l'alloggiamento (Figura 3). La lunghezza d'onda può variare leggermente all'interno della camera, ma in generale i modelli sembrano simili. I bordi della camera non dovrebbero essere utilizzati per confronti quantitativi, come membrane che forma sulla colla UV sembra avere proprietà diverse rispetto sul vetro di superficie (vedere Figura 3). Le onde di superficie itinerante possono essere analizzate tracciando l'intensità lungo la direzione di propagazione (Figura 3B). Mentre mente fluorescenza altipiani piuttosto veloce dal bordo superiore dell'onda e quindi diminuisce bruscamente sul bordo d'uscita, miniera fluorescenza aumenta quasi linearmente dall'inizio dell'onda mente e raggiunge il suo massimo dopo mente sul bordo d'uscita, dove si si stacca nettamente6.
Accanto alla qualità delle proteine, la qualità della lipidici supportati è più critica per una regolare auto-organizzazione dei MinCDE. Da un lato se la membrana viene lavata troppo eccessivamente o la superficie sottostante è stata pulita e così addebitata troppo fortemente, possono formare fori nella membrana (Figura 6A, parte superiore). D'altra parte se la membrana non è lavata correttamente o la superficie sottostante non è pulita, idrolizzato, vescicole che si attaccano alla membrana o sarà compromessa la fluidità di membrana (Figura 6A, in basso). Anche se non così evidente come quando si osserva la membrana direttamente via con etichettati lipidi, questi problemi possono essere rilevati anche dal segnale di fluorescenza di mente, come modelli non sono regolari e la fluorescenza nei massimi non è omogenea ma contiene "buchi" o punti luminosi come mostrato nel pannello centrale della Figura 6A.
Per auto-l'organizzazione di MinDE in asta-a forma di microstrutture PDMS la procedura è riassunto nella Figura 4. Diversi passaggi di protocollo non devono essere ripetute, come proteine e lipidi possono essere riutilizzati. Come su substrati non-fantasia, il substrato viene pulito e idrolizzato (di pulizia al plasma), un doppio strato lipidico supportati è formata sul PDMS e il test di auto-organizzazione è impostato in un volume di 200 µ l. Per verificare che si è formata una membrana corretta e MinDE auto-organizza sulla membrana, gli alloggiamenti sono Imaging. Quando una membrana corretta è stata formata, MinDE forme regolari viaggio onde superficiali sulla superficie del PDMS tra le microstrutture individuali e anche auto-organizza in fondo le microstrutture come le onde possono liberamente muoversi sopra l'intero superficie ricoperta di membrana (Figura 5A). Dopo la rimozione del tampone, la superficie tra i comparti non dovrebbe mostrare alcun pattern MinDE moltiplicazione (figura 5B), come dovrebbe essere completamente asciutto. Se MinDE modelli sono ancora in movimento, più buffer deve essere rimosso. Le proteine sono ora confinate nel microcompartments a forma di bastoncino il PDMS rivestito di membrana ed aria sull'interfaccia superiore (Figura 5), in cui self organizzeranno. In queste condizioni le due proteine possono eseguire Polo-Polo oscillazioni come mostrato in Figura 5. Come una frazione della mente e la mia è sempre legata alla membrana, anche durante la rimozione del tampone, le concentrazioni dopo la rimozione del tampone non sono paragonabili a concentrazioni di input. A causa di questo effetto le concentrazioni variano anche tra singole microstrutture il coprivetrino stesso come essi dipendono dalla posizione dei modelli prima della rimozione del tampone. Produzione di wafer di silicio o PDMS stampaggio da wafer di silicio può causare microstrutture incomplete che non possono essere utilizzate per l'analisi (Figura 6B). Inoltre, a causa del buffer microstrutture di rimozione potrebbero asciugarsi durante il processo e quindi, dovrebbero essere esclusi dall'ulteriore analisi (Figura 6B). Di conseguenza solo una frazione di microstrutture in uno alloggiamento Mostra le oscillazioni di Polo-Polo desiderate. Per analizzare le dinamiche di proteina in microstrutture, un kymograph può essere ottenuta disegnando una selezione su tutta la struttura (Figura 5E). Quando MinCDE oscillare da Polo a Polo, MinC e mente mostrerà un gradiente di concentrazione mediato nel tempo con la massima concentrazione ai poli di vano e concentrazione minima al centro del vano (Figura 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figura 1: SDS-PAGE mostrando i prodotti finali di purificazioni proteina. Sua mente (33,3 kDa), His-eGFP-mente (60,1 kDa), His-mRuby3-mente (59,9 kDa), His-miniera (13,9 kDa) e His-MinC (28,3 kDa) sono mostrati in ordine. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figura 2: diagramma di flusso del processo mostrando i singoli passaggi e la tempistica del protocollo per un auto-organizzazione su lipidici con motivi non supportati (passi 1-6). Caselle tratteggiate indicano che una di queste due opzioni può essere utilizzata per la pulizia. Le frecce contrassegnate dai cerchi indicano dove il protocollo può essere sospesa e ripresa successivamente. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figura 3: Imaging di MinDE analisi mediante microscopia confocale a. A) a spirale regolare Min, da quale velocità di propagazione, la trama di intensità e la velocità possono essere ottenute misurazioni. Concentrazioni usate: 0,6 µM mente (30% eGFP-mente), 1,8 µM His-miniera (30% sua-miniera-Alexa647) B) esempio grafico di intensità normalizzata per la regione segnata in r. C) Panoramica della camera di dosaggio intero (barra della scala: 1mm, stesse concentrazioni di proteina come sopra). Spirali o senso di rotazione così come modelli di destinazione possono essere osservati. La regione ingrandita Mostra come onda modelli differiscono sulla UV-colla. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figura 4: diagramma di flusso del processo mostrando i singoli passaggi e la tempistica del protocollo per l'auto-organizzazione in asta-a forma di microstrutture (passi 1-5, 7, 8). Caselle grigie indicano passaggi dove i prodotti possono essere riutilizzati dal protocollo su lipidici con motivi non supportati. Le frecce contrassegnate dai cerchi indicano dove il protocollo può essere sospesa e ripresa successivamente. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figura 5: risultati rappresentativi per MinDE modello formazione in asta-a forma di microcompartments PDMS. A) MinDE auto-organizzarsi sulla superficie del PDMS formando onde di superficie in viaggio (1 µM mente (30% EGFP-mente), 2 µM miniera e 2,5 mM ATP). B) dopo il buffer è abbassato all'altezza di microstrutture, l'auto-organizzazione della proteina si interrompe sulla superficie planare tra il microcompartments. C) schematica di un asta-a forma di microcompartment. D) immagini rappresentative delle oscillazioni di poli-poli MinDE dopo la rimozione del tampone. E) Kymograph delle oscillazioni lungo la riga evidenziata indicata in D). F) immagine e il profilo dell'intensità di fluorescenza media della serie tempo mostrato nella D) mostrando chiaramente il gradiente della proteina che è massima ai poli microcompartment e minima al centro del vano. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figura 6: esempi di risultati sperimentali negativi. A) membrane over-lavate si accumulano fori, mentre preparazioni suboptimali della vescicola e composizioni lipidiche conducono ad attaccare le vescicole. I pannelli del due centro mostrano una combinazione di entrambi i problemi e come diventano visibili quando si osservano oscillazioni Min. Le membrane sono state etichettate con 0.05% Atto655-DOPE. (scala bar: 50 µm) B) pannello superiore: seccava microcompartments può essere causato da troppo rimozione di buffer o quando il buffer si volatilizza nel corso del tempo. Pannello di fondo: scomparti Incomplete possono formarsi durante la produzione di wafer o stampaggio PDMS. (scala bar: 30 µm) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementari 1: Mappa di plasmide per la sua mente. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 2: Mappa di plasmide per sua-EGFP-mente. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 3: Mappa di plasmide per sua-mRuby3-mente. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 4: Mappa di plasmide per la sua miniera. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 5: Mappa di plasmide per sua MinC. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 6: File CAD per wafer di silicio di microcompartments a forma di bastoncello. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Forniamo un protocollo per in vitro test di auto-organizzazione della mente e la mia su un doppio strato lipidico supportati in una camera aperta. Inoltre, descriviamo come racchiudere il dosaggio del lipido-clad PDMS microcompartments per simulare condizioni in vivo di confinamento di reazione.

In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

12.1K Views.  Max Planck Institute of Biochemistry. Forniamo un protocollo per in vitro test di auto-organizzazione della mente e la mia su un doppio strato lipidico supportati in una camera aperta. Inoltre, descriviamo come racchiudere il dosaggio del lipido-clad PDMS microcompartments per simulare condizioni in vivo di confinamento di reazione.

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Privo di detersivo ultraveloce ricostituzione delle proteine di membrana in lipidici utilizzando fusogena proteoliposomi complementari a carico.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Bioingegneria

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Una piattaforma di membrana modello per la ricostituzione delle dinamiche della membrana mitocondriale

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Formazione spontanea e riorganizzazione delle reti di Nanotube del lipido artificiale come un modello Bottom-Up per il reticolo endoplasmico

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Patterning proteico reversibile controllato dalla luce su membrane lipidiche

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Autore in primo piano: Reclutamento di proteine commutabili con foto per il patterning reversibile nei sistemi cellulari artificiali

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

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Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale