אנו מודים היימן מיכאל, פרנק Siedler לייצור סיליקון ואפלים הליבה מתקן MPI-B לסיוע בסיימון Kretschmer וטיהור חלבונים ו ליאון הרינגטון להערות על כתב היד.

<ol>
	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli.">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li><li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics.">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li><li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli.">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li><li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures.">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li><li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli:+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid.">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li><li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+Escherichia+coli:+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site.">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems.">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949 (2014).</li><li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes.">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+biological+surfaces:+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria.">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li><li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MipZ,+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter.">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li><li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation.">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758 (2014).</li><li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo.">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes.">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li><li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins.">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li><li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers.">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271 (2016).</li><li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

תארנו פרוטוקול למפת במבחנה MinCDE לביצוע ארגון-עצמי על גרפים מישוריים נתמך השומנים bilayers, בהשומנים bilayer מכוסה מבנים תלת-ממד, באמצעות הדוגמה של מוט בצורת מזערים PDMS. על מנת לקבל נתונים יקרי ערך מן מבחני האלה, הם הגורמים החשובים ביותר כדי לשלוט חלבון ואיכות ממברנה.
כדי להבטיח איכות חלבון, חלבון המוני צריך להיות מאושרות מרחביות-דף באמצעות ספקטרומטר מסה. יתר על כן, כדאי לוודא כי החלבונים הם מסיסים ובחלקם לא צבור, באמצעות סינון ג'ל אנליטית או פיזור אור דינאמי. סינון ג'ל יכול לשמש כדי להסיר כל שבר צבורים של חלבונים. התאמת חומציות זהיר והאיכות של נוקלאוטידים נוסף הוא קריטי, כמו התוספת של נוקלאוטיד לא מנוכים או חלקית מפורק לחלבון מניות או מבחני התארגנות עצמית היא מספיקה כדי לחסל את פעילות החלבון, לכן המבטלת ארגון עצמי.
לצד איכות חלבון, ממברנה איכות הוא הקריטי ביותר, היווצרות קרום לא תקין הוא לרוב הסיבה לביצוע ארגון-עצמי פגום, המקור של מבנים משטח artefactual.
בעת ביצוע הפרוטוקול בפעם הראשונה, זה עוזר לה תווית bilayers את השומנים הנתמכות על-ידי הכללת שומנים שכותרתו כמו אטו-655-סמים או DiI-אחוזי טוחנת נמוך (0.05%). ובכך המאפיינים ואת האיכות של הקרום יכולה להישפט ישירות. באמצעות FRAP, הנזילות של הקרום יכול להיות מוערך. יתר על כן, אחד ישירות יכול להעריך את האיכות של שטיפה של סאט גלובל, כמו שם תהיה שלפוחית רבים מדי, אין ממברנה נוזלית או קרום אין בכלל, אם זה נשטף. הגישה קאמרית פתוחה מאפשרת לרחוץ בקפדנות הממברנה, ומכאן גם להסרת שלפוחית זה דבוקים על פני השטח של סאט גלובל. הגורמים המכריעים עבור קבלת נוזלית ואחידה השומנים הנתמכים הם bilayers ניקוי hydrophilicity של פני השטח תמיכה, בגודל הנכון והומוגניות סולעומת זה יכול להיות מועיל לבדוק את גודל שטח ושימוש התפלגות גודל פיזור אור דינאמי. עבור הפצות גודל צרה, אנו ממליצים הבלטת ממד השלפוחיות המוגלתיות ולא sonicating אותם. שיטות אחרות של ניקוי coverslips, למשל, טיפולים עם בסיסים חזקים, חומרי ניקוי בסיסי, או משתמש coverslips ישירות לאחר שטיפה עם מים, תניב תוצאות טובות, בהתאם התערובת יישום, שומנים בדם.
המחצית הראשונה של פרוטוקול המובאים כאן, במבחנה שיחזור על השומנים נתמך מישורי bilayers בתאי פתוח, יש את היתרון של עיבוד פני השטח נגיש עבור microscopies אופטי, כגון מיקרוסקופ TIRF30, FRAP ניתוח6, יחיד-חלקיקים מעקב34, כמו גם טכניקות בדיקה משטח כגון מיקרוסקופ כוח אטומי26. באזור הומוגנית הגדול מאפשר סטטיסטיקה טובה יותר בריכוזים מוגדרים. יתר על כן הגישה קאמרית פתוח מאפשר לשלוט במדויק ריכוז חלבון לבין תוספת מהירה ופשוטה של עוד רכיבים, ומכאן המתיר כדי titrate ריכוז חלבון יחיד קאמרית20. ניתן להרחיב את הבדיקה גם באמצעות תוספת של רכיבים אחרים divisome חיידקיים כגון22,FtsZ35, ZipA22 או ה10,FtsZ-YFP-MTS חלבון chimeric35.
קבוצות אחרות לקחו בגישה דומה כדי לשחזר את Min מערכת במבחנה, אבל שימוש זרימה-תא במקום18,17,תא פתוח19. זרימה-תאים יש יתרונות מסוימים, בפרט כאשר סביבה תלת-ממד מלא סגור הוא הצורך18, השפעת זרימת17,19,23 או קומפוזיציה ממברנה23 על דפוסי MinCDE חקר, או אם חלבון דפוסי להיות שנצפו תחת חלבון הגבלת תנאים19. למרות זאת, בקרה מקומית של ריכוזים מולקולרית קשה יותר. מרכיבי חלבון, בעיקר המוח, בחוזקה לאגד הקרום הם פוגשים לראשונה18,19. מניסיוננו, החלבונים לעתים קרובות להציג שאינם ספציפיים איגוד אבובים, פתחי הכניסה, מזרקים, חלקים אחרים microfluidic. לכן, ריכוז חלבון המקומי נבדלים ריכוזים קלט18 ו גם להשתנות לאורך של הזרימה-התא, וכתוצאה מכך מגוון של דפוסי חלבונים שונים על קרום בין כניסת ו שקע, כפי שנצפה על ידי אחרים19.
השני מחצית הפרוטוקול המובאים כאן, את הכינון במבחנה במוט בצורת מזערים מחדש באמצעות גישה פתוחה קאמרית על תמיכה בדוגמת מכוסה על ידי השומנים bilayers מאפשר לחקות פשוטה ההתנהגות חלבון ' ויוו למרות שליטה מדויקת ריכוז חלבון אובד עקב הסרת מאגר. שימו לב כי בגלל אורך הגל של גבירתי הוא סדר גודל אחד גדול במבחנה ויוו microcompartments מוט בצורת נמצאים גם על אחד בסדר גודל גדול יותר (10 x 30 מיקרומטר) מאשר מוט בצורת e. coli תא.
בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר שליטה מדויקת של כל התנאים, לרבות ריכוז חלבון, מאגר הרכב ומאפייני ממברנה. השימוש תומך 3D מובנה מאפשר התגובה שילמדו תחת כליאה המרחבי, מחקה התנהגות ויוו ללא צורך מיקרופלואידיקה מורכבים ציוד.

ייתכן דפוסי חיוניים בטבע, ויסות משימות מורכבות ברמה multicellular וסלולריות, מן מורפוגנזה מוסדר חלוקת התא1,2. התגובה דיפוזיה מערכות יש תפקיד חשוב בהקמת הדפוסים הללו, אבל הם עדיין לא מובנים היטב. דוגמה ומופת מערכת התגובה דיפוזיה לבין מערכת ביולוגית מאופיין בצורה הטובה ביותר עד כה הוא Escherichia coli MinCDE מערכת3,4,5,6,7. מערכת MinCDE מתנדנד מהקוטב תא לקוטב תא ב e. coli כדי לקבוע באמצע של התא כאתר חטיבת בעתיד. מערכת זו מבוססת על המוח ATPase, ATPase הפעלת חלבון שלי, ושל הקרום כמו מטריקס המרחבי תגובה8. MinC אינה חלק ממנגנון היווצרות תבנית, אלא הוא סוכן תפקודית בפועל: מעכב של החלבון העיקרי divisome FtsZ5,6. MinC נקשר לי בראש וזה ולכן עוקב אחר תנודות, וכתוצאה מכך הדרגתי ריכוז חלבון זמן ממוצע מקסימלי בקטבים תא, מינימלי באמצע התא, המאפשר רק FtsZ פולימריזציה midcell9,10 . מערכת MinCDE היא חלק ממשפחת גדול יותר של ווקר A ATPases כי הם המפתח לארגון ייתכן חיידקים2, מיצוב, הובלת חלבון מתחמי11 ו פלסמידים12 ולשם וויסות תא חטיבת13 ו כרומוזום סגרגציה14. לפיכך, מערכת התגובה דיפוזיה MinCDE מייצג מערכת ריאקציה ארכיטיפי-דיפוזיה אלא גם משכה תשומת לב בגלל להתאמתו של הארגון ייתכן בחיידקים.
מחקרים פונקציונלי מפורט של ה MinCDE מערכת ויוו הם מסובכים, מניפולציה של חלבונים ו ג'ין מחיקה התוצאה בדרך כלל פגמים חלוקת התא. יתר על כן, שינוי בהרכב הממברנה או את המאפיינים של ה ציטוזול ויוו הוא מאוד מאתגר15,16. שינויים במערכת והשפעה על גורמים שקשה לפרש בסביבה מורכבת של התא, אפילו יותר אם זה מופר ב פעולה הכרחית כמו חלוקת התא. אנחנו ואחרים ולכן פנו גישה למפת במבחנה , צמצום המערכת רכיבי הליבה שלה: המוח, שלי, ATP כמקור אנרגיה, ליפידית נתמך כמו התגובה מטריקס6,17, 18. גישה מלמטה למעלה זו מאפשרת לחקור את המנגנון של ארגון עצמי בפירוט ללא המורכבות של תא חי. הטופס חלבונים נסיעה משטח גלים6 וסוגים אחרים של דפוסי17,,19 , בתנאים אלה, אמנם עם אורך גל זה בדרך כלל בערך גודל גדול יותר ויוו. השימוש של חדר פתוח מאפשר בקרה מדויקת על כל האספקטים המשפיעים על היווצרות תבנית: ריכוז חלבון6, מאפייני חלבון20, ממברנה קומפוזיציה10, מאגר הרכב וריכוז ATP 6, וכן תוספת של גורמים אחרים כמו הצפיפות סוכנים21 ו- חלבונים אחרים divisome22. לשם השוואה, הכינון במבחנה של מערכת MinCDE19,18,תאים זרימה23 יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של17,זרימה23, חלבון הגבלת תנאים19, ממברנה קומפוזיציה19 ו 3D מלא כליאה18 על דפוסי חלבון, אבל רינדור פקד המדויק של ריכוז חלבון/רכיב, רציפים רכיב תוספת הרבה יותר מסובך.
באמצעות החדר פתוח הזה, אנחנו גם בדוגמת התמיכה של bilayers השומנים מישורי שבו אחד יכול לחקור איך גיאומטרי גבולות ההשפעה דפוס היווצרות21, תופעה בעלת לאחרונה גם היה ובדוקים ויוו באמצעות חיידקים יצוק לתוך מזערים7. אנחנו גם מועסקים זה וזמינותו לחקור כיצד מוגדרים מוטציות בגן שלי תבנית משפיעים על היווצרות מערכת20. יתר על כן, כבר מועסקים באותו פורמט בסיסי assay לחקור איך היווצרות דפוס יכול להיות נשלט על ידי אור, ידביקו פפטיד מכרה של תפור azobenzene וזמינותו, והדמיה עם מיקרוסקופ TIRF24.
מצאנו את זה, כדי לשכפל את התבנית גבירתי היווצרות נצפתה ויוו בבידוד מערכת, במבחנה היה מפתח. באמצעות מוט בצורת microcompartments, עם מידות מותאמות אורך הגל גדולה יותר של גבירתי במבחנה (10 x 30 מיקרומטר), לבושות עם שכבה ליפידית הנתמכות מותר את בנייתו מחדש של תנודות הקוטב-כדי-מוט גבירתי ויצירת חלבונים מעבר צבע 10,25. ב- assay הזה, bilayers השומנים נתמך מופקדים על מצע PDMS בדוגמת המכיל מספר מאה העתקים של microcompartments מוט בצורת שנותרו פתוחים על גבי. על ידי זה, התגובה ניתן להגדיר בחדר פתוח ולאחר מכן המאגר הוא הוריד את שפת microcompartments, ובכך מגבילה את התגובה לאמצעי אחסון קטן. למרות תאים אלה יש ממשק האוויר-מאגר בצד אחד, ולכן אינם מייצגים ריתוק 3D מלא על ידי קרום, הדינמיקה חלבון חיקה ויוו תנודות10,25. בהשוואה כליאה 3D מלא, אשר מראה דומה מאוד תוצאות18, וזמינותו מזערים פתוחה היא יחסית פשוטה וקלה כדי להתמודד עם, יכול להתבצע גם על ידי מעבדות כי אינם מצוידים ציוד מיקרופלואידיקה מיוחדים, מתקני החדר נקי.
כאן, אנו מציגים טיפול נסיוני לשחזר MinCDE דפוס היווצרות על תמיכה השומנים bilayers במבחנה באמצעות חדר פתוח המאפשר שליטה על כל רכיבי וגישה נוחה על ידי מיקרוסקופ אופטי ו, עם קטין שינויים, גם היא יכולת הסתגלות עבור השטח-בדיקה טכניקות26. ליד bilayers מישורי השומנים הנתמכים, אנו גם מראים איך כליאה חלבון יכול להיות מושגת באמצעות פשוטה השומנים נתמך בדוגמת bilayers על מוט בצורת מזערים PDMS. מבחני האלה, למרות ממוטב עבור מערכת MinCDE, ניתן גם להעביר למערכות אחרות חלבון המקיימים אינטראקציה באופן דומה עם הקרום, כגון FtsZ27 או של אקטין מינימלית קורטקס28.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt trihydrate</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glycerol 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS crosslinker</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 and #63 both work well</td></tr><tr><td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td>used only for PDMS microstructures</td></tr><tr><td>0.5 ml reaction tube</td><td>Eppendorf</td><td>&amp;nbsp;0030123301</td><td></td></tr><tr><td>culture flask 2L</td><td>Corning</td><td>e.g. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 or 66330</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated protein purification system: &amp;Auml;kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>e.g. Model 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 mixer</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner Zepto</td><td>Diener electronic</td><td></td><td>use oxygen as process gas</td></tr><tr><td>positive displacement pipettes</td><td>Brand</td><td></td><td>Transferpettor models with glass tips</td></tr><tr><td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

היבטים רבים של הארגון ייתכן הבסיסית של תאים נשלטים על ידי מערכות סוג התגובה דיפוזיה. במבחנה הכינון של מערכות כאלה מאפשר לימודים מפורטת מנגנוני הבסיסית שלהם, אשר לא יהיה ריאלי ויוו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול את במבחנה בנייתו מחדש של המערכת MinCDE של Escherichia coli, אשר עמדות מחצה חלוקת התא באמצע תא. וזמינותו נועד לספק רק את הרכיבים הנחוצים לביצוע ארגון-עצמי, דהיינו קרום, את שני החלבונים המוח ואת שלי, ושל אנרגיה בצורת ATP. אנחנו ולכן לפברק תא התגובה פתוח על coverslip, שבו נוצרת שכבה ליפידית הנתמכות. עיצוב החדר פתוח מאפשר הכנת ליפידית האופטימלית ומניפולציה מבוקרת של התוכן בצובר. שני החלבונים, המוח שלי, וכן ATP, יתווספו לאחר מכן לתוך האחסון בצובר מעל הקרום. הדמיה אפשרי על ידי רבים microscopies אופטי, עיצוב תומך קונאפוקלית, שדה רחב ומיקרוסקופ TIRF כאחד. וריאציה של הפרוטוקול, ליפידית נוצר על תמיכה בדוגמת, בצורת תא מזערים PDMS, במקום זכוכית. הנמכת הפתרון בתפזורת על החישוק של תאים אלה יקיף את התגובה בתא קטן יותר ומספק גבולות המאפשרים מחקה התנהגות ויוו מתנדנדות. יחדיו, נתאר פרוטוקולים כדי לשקם את המערכת MinCDE עם וללא כליאה המרחבי, ומאפשר לחוקרים דווקא לשלוט בכל ההיבטים המשפיעים על היווצרות תבנית, כגון ריכוז טווחים או גורמים אחרים או חלבונים, ולהגדיל באופן שיטתי מערכת המורכבות הגדרת נסיוני יחסית פשוטה.

טיהור חלבון הפרוטוקול שלנו אמור להניב מינימום חלבונים של טוהר נאותה. כאסמכתא, איור 1 מספק תמונה מרחביות-דף של המוח, fluorescently מתויג המוח שלי, מינק. השלבים בודדים של ההליך לביצוע assay ארגון עצמי של גבירתי על השומנים נתמכים שאינם בדוגמת bilayers מתוארים באיור2. באמצעות פרוטוקול זה, גבירתי רגיל בנסיעות גלי המשטח יכול להיות שנצפו ברחבי החדר (איור 3). אורך הגל יכול להשתנות מעט בתוך החדר, אך באופן כללי תבניות דומות. קצות החדר צריך לא לשמש להשוואות כמותיות, ממברנות כי הטופס על הדבק UV נראה שיש לה מאפיינים שונים מאשר על הזכוכית על פני השטח (ראה איור 3C). ניתן לנתח את גלי המשטח הנוסע ידי עוצמת לאורך כיוון התפשטות (איור 3B). תוך המוח פלורסצנטיות מישורים די מהר מ בחוד החנית של הגל, ואז יורדת בחדות בקצה נגרר, זריחה שלי מגביר באופן ליניארי כמעט מההתחלה של גל המוח ומגיע המקסימאלית שלה אחרי המוח בקצה נגרר, איפה זה נופל במידה ניכרת6.
חלבון איכותי, האיכות של bilayers השומנים נתמך נמצא הקריטי ביותר עבור ארגון עצמי רגיל של MinCDE. מצד אחד אם הקרום נשטף גם יתר על המידה או המשטח שמתחת מנקים את ובכך טעונה בכוח רב מדי, חורים יכולים ליצור ממברנה (איור 6A, העליון). לעומת זאת אם הקרום לא נשטף כראוי או השטח המשמש כבסיס אינו מנקה/hydrophilized, שלפוחית ידבק הקרום או נזילות ממברנה ייחשף (איור 6A, התחתון). אפילו לא כמו לכאורה כמו בעת התבוננות קרום ישירות באמצעות ליפידים שכותרתו, בעיות אלו ניתן לזהות גם האות פלורסצנטיות המוח, כמו דפוסי אינם קבועים זריחה ב- מקסימה אינה הומוגנית אלא מכיל "חורים" או נקודות האור כפי שמוצג בחלונית האמצעית של איור 6A.
עבור הארגון עצמית גבירתי מוט בצורת מזערים PDMS ההליך מסוכם באיור4. פרוטוקול מספר שלבים לא צריך להיות חוזרות ונשנות, כמו חלבונים ושומנים הניתנים לשימוש חוזר. כאילו על שאינם בדוגמת מצעים, המצע הוא ניקה hydrophilized (על-ידי ניקוי פלזמה), ליפידית הנתמכות נוצר ב- PDMS ואת וזמינותו ארגון עצמי מוגדר באמצעי אחסון של 200 µL. כדי לבדוק כי קרום נאות הקימה ומארגן גבירתי עצמית על הקרום, עם תמונה של הצ'יימברס. כאשר קרום נאות נוצר, גבירתי טפסים רגיל בנסיעות גלי המשטח על פני PDMS בין מזערים בודדים עצמי מארגן גם בתחתית מזערים הגלים יכול באופן חופשי תעבור את כל השטח מכוסה קרום (איור 5A). לאחר הסרת מאגר, פני השטח בין התאים צריך לא להראות כל דפוסי גבירתי כציוד (איור 5B), כמו שזה צריך להיות יבש לחלוטין. אם גבירתי דפוסי עדיין זז, מאגר נוסף צריך להיות מוסר. החלבונים עכשיו מרותק microcompartments מוט בצורת PDMS את קרום לבושת ועל ידי אוויר על הממשק העליונה (איור 5C), שבו הם יארגן עצמית. בתנאים אלה שני החלבונים ניתן לבצע תנודות הקוטב-כדי-מוט כפי שמוצג באיור 5D. כמו חלק של המוח ושלי הוא תמיד מאוגד-ממברנה, גם במהלך הסרת מאגר, ריכוז לאחר הסרת מאגר אינם דומים קלט ריכוזים. בשל אפקט זה ריכוז גם משתנות בין מזערים בודדים על coverslip אותו כפי שהם תלויים המיקום של הדפוסים לפני הסרת מאגר. ייצור פרוסות הסיליקון או PDMS לכייר מ כשהפחד סיליקון יכול לגרום מזערים שלם לא יכול לשמש לניתוח (איור 6B). יתר על כן, עקב המאגר להסרת מזערים עלולה להתייבש בתהליך, לפיכך, לא להיות כלולים ניתוח נוסף (איור 6B). כתוצאה מכך רק שבריר מזערים בתא אחד מראה תנודות הקוטב-כדי-העמוד הרצוי. כדי לנתח חלבון דינאמיקה של מזערים, kymograph ניתן להשיג על ידי ציור מבחר מעל המבנה כולו (איור 5E). בעת MinCDE נעים מן הקוטב-אל-עמוד, מינק והנפש יציג הדרגתי ריכוז זמן ממוצע עם ריכוז מרבי בקטבים תא וריכוז מינימלי באמצע התא (איור 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> איור 1: מרחביות-דף מציג את המוצרים הסופיים של חלבון purifications. מדעתו (33.3 kDa), eGFP-מדעתו (60.1 kDa), mRuby3-מדעתו (59.9 kDa), שלו-שלי (13.9 kDa) שלו-מינק (28.3 kDa) מוצגים לפי סדר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> איור 2: זרימת תהליך דיאגרמה מציג את השלבים בודדים והתזמון של הפרוטוקול עבור ארגון עצמי על השומנים נתמכים שאינם בדוגמת bilayers (שלבים 1-6). תיבות מקווקווים מציינים כי אחת מתוך שתי אפשרויות אלה יכולים לשמש לניקוי. חיצים מסומן על ידי חוגים מציינים היכן הפרוטוקול ניתן להשהות, חודשה מאוחר יותר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> איור 3: הדמיה של גבירתי assay מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית- A) מין רגיל ספירלה, באיזה מהירות התפשטות הגל, עוצמת מגרש, מהירות ניתן לקבל מדידות. ריכוזים בשימוש: מיקרומטר 0.6 אכפת לך (30% eGFP-נפש), מיקרומטר 1.8 שלו-שלי (30% שלו-שלי-Alexa647) B) למשל מגרש בעוצמה מנורמלת עבור האזור המסומן בא C) סקירה של הקאמרית assay כולו (סרגל קנה מידה: 1 מ מ, באותו ריכוז חלבון כמו לעיל). ספירלות הפיכת הכיוונים כמו גם דפוסי היעד יכול להיות שנצפו. האזור המוגדל מראה כיצד תבניות גל שונה ב- UV-הדבק. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> איור 4: זרימת תהליך דיאגרמה מציג את השלבים בודדים והתזמון של הפרוטוקול עבור ארגון עצמי של מוט בצורת מזערים (שלבים 1-5, 7, 8). תיבות אפורים מציינים היכן המוצרים הניתנים לשימוש חוזר של צעדים הפרוטוקול על השומנים נתמכים שאינם בדוגמת bilayers. חיצים מסומן על ידי חוגים מציינים היכן הפרוטוקול ניתן להשהות, חודשה מאוחר יותר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> איור 5: תוצאות נציג גבירתי דפוס-צורה מוט בצורת microcompartments PDMS. A) גבירתי לארגן עצמית על פני PDMS להרכיב נוסע גלי המשטח (1 מיקרומטר אכפת (30% EGFP-נפש), 2 מיקרומטר שלי ושל 2.5 מ מ ATP). B) לאחר המאגר הוא הוריד את הגובה של מזערים, ארגון עצמי חלבון עוצר על משטח מישורי בין microcompartments. C) סכמטי של microcompartment בצורת מוט אחד. D) להחליפן בתמונות של גבירתי תנודות הקוטב-אל-עמוד לאחר הסרת מאגר. E) Kymograph של תנודות לאורך הקו המסומן מוצג ברה). F) תמונה ופרופיל של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע של הזמן-סדרת שמוצג D) מציג בבירור את המילוי ההדרגתי של חלבון מקסימלי-microcompartment הפולנים, מינימלי-התיכון תא. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> איור 6: דוגמאות של תוצאות שליליות ניסיוני. A) יתר שטף ממברנות לצבור חורים, בזמן ההכנות שלפוחית שיוצרת ויצירות השומנים להוביל דבק שלפוחית. הלוחות מרכז שני מציגים שילוב של בעיות וגם איך הם הופכים גלויים, כאשר תנודות Min. ממברנות היו בלוחיות 0.05% Atto655-סמים. (גודל ברים: 50 מיקרומטר) B) הדף פאנל: התייבש microcompartments יכולה להיגרם על ידי הסרת מאגר מדי, או כאשר המאגר מתאדה לאורך זמן. פאנל התחתונה: תאים לא שלמים יכולים להיווצר במהלך ייצור פרוסות או דפוס PDMS. (גודל ברים: 30 מיקרומטר) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
קובץ משלים 1: מפת פלסמיד מדעתו. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
קובץ משלים 2: פלסמיד מפת EGFP-מדעתו. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
קובץ משלים 3: פלסמיד מפת mRuby3-מדעתו. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הקבצים המשלימים 4: מפת פלסמיד שלו-שלי. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הקבצים המשלימים 5: מפת פלסמיד MinC שלו. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הקבצים המשלימים 6: קובץ ה-CAD עבור סיליקון וופל של מוט בצורת microcompartments. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

אנו מספקים פרוטוקול עבור במבחנה מבחני ארגון עצמי של המוח, שלי ליפידית הנתמכות בחדר פתוח. בנוסף, אנו נתאר כיצד הקף וזמינותו של לבושת השומנים microcompartments PDMS לחקות ויוו תנאים על ידי תגובת כליאה.

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

12.1K Views.  Max Planck Institute of Biochemistry. אנו מספקים פרוטוקול עבור במבחנה מבחני ארגון עצמי של המוח, שלי ליפידית הנתמכות בחדר פתוח. בנוסף, אנו נתאר כיצד הקף וזמינותו של לבושת השומנים microcompartments PDMS לחקות ויוו תנאים על ידי תגובת כליאה.

Video: In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Bioengineering

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

דפוס חלבון הפיך מבוקר אור על קרומי שומנים

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

מחבר זרקור: צילום גיוס חלבונים הניתנים להחלפה לדפוסים הפיכים במערכות תאיות מלאכותיות

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים