Name: in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
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Agradecemos a Michael Heymann e Frank Siedler para produção de silício wafers, Core Facility MPI-B para obter assistência na purificação de proteínas e Simon Kretschmer e Leon Harrington para comentários sobre o manuscrito.

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	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli.">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li><li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics.">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li><li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli.">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li><li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures.">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li><li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli:+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid.">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li><li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+Escherichia+coli:+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site.">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems.">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949 (2014).</li><li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes.">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+biological+surfaces:+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria.">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li><li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MipZ,+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter.">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li><li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation.">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758 (2014).</li><li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo.">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes.">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li><li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins.">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li><li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers.">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271 (2016).</li><li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Descrevemos um protocolo para a reconstituição em vitro de auto-organização MinCDE em planar suportadas bilayers do lipid e em lipídios BICAMADA coberto estruturas 3D, usando o exemplo de microestruturas PDMS de forma cilíndrica. A fim de obter dados valiosos destes ensaios, os fatores mais importantes para o controle são proteínas e membrana de qualidade.
Para garantir a qualidade da proteína, proteína em massa deve ser confirmada usando SDS-PAGE e espectrometria de massa. Além disso, deve ser verificado que as proteínas são solúveis e não agregados, usando analítico gel filtração ou difusão dinâmica da luz. Filtração de gel pode ser usada para remover qualquer fração de agregados de proteínas. Ajuste do pH cuidado e qualidade de nucleotídeos adicionados é crítico, como a adição de nucleótidos não-ajustadas ou parcialmente degradados à proteína estoques ou ensaios de auto-organização é suficiente para eliminar a atividade da proteína, abolindo, portanto auto-organização.
Ao lado da qualidade de proteína, qualidade da membrana é mais crítica e formação inadequada da membrana é frequentemente a causa para a auto-organização defeituosa e a origem das estruturas de superfície artefactual.
Ao executar o protocolo pela primeira vez, é útil rotular os bilayers do lipid suportados, incluindo lipídios rotulados como Atto-655-DOPE ou DiI em baixas percentagens de molares (0.05%). Assim, as propriedades e a qualidade da membrana podem ser julgados diretamente. Usando o FRAP, a fluidez da membrana pode ser avaliada. Além disso, um diretamente pode avaliar a qualidade da lavagem do SLB, pois lá será demais vesículas, sem membrana fluida ou sem membrana, se ele foi lavado. A abordagem de câmara aberta permite lavar rigorosamente a membrana e, portanto, também para remover as vesículas que estão furando na superfície do SLB. Os fatores mais cruciais para a obtenção de fluido e homogénea com suporte lipid bilayers são a limpeza e a Hidrofilia da superfície de apoio e o tamanho correto e homogeneidade de SUvs pode ser útil verificar o tamanho SUV e distribuição de tamanho usando Difusão dinâmica da luz. Para distribuições de tamanho estreito, recomendamos expulsando as vesículas ao invés de sonicating-los. Outros métodos de limpeza de lamelas, por exemplo, tratamentos com bases fortes, detergentes básicos ou usando lamelas diretamente após a lavagem com água, podem produzir bons resultados, dependendo da mistura do aplicativo e lipídios.
A primeira metade do protocolo apresentado aqui, em vitro reconstituição na bilayers planar lipid suportados nas câmaras de aberto, tem a vantagem de renderização da superfície acessível para microscopies ópticas, tais como TIRF microscopia30, FRAP análise6,34, bem como técnicas de sonda de superfície tais como a microscopia de força atômica26de rastreamento único-partícula. A grande área homogênea permite melhores estatísticas em concentrações definidas. Além da abordagem câmara aberta permite para controlar com precisão a concentração de proteína e uma adição rápida e simples de mais componentes, permitindo, portanto, para dosear a concentração de proteína em uma única câmara de20. O ensaio também pode ser expandido através da adição de outros componentes, divisome bacteriana como FtsZ22,35, ZipA22 ou o quimérico proteína FtsZ-YFP-MTS10,35.
Outros grupos têm tido uma abordagem similar para reconstituir o Min sistema em vitro, mas o uso de um fluxo de células em vez de uma câmara aberta17,18,19. Fluxo-as células têm certas vantagens, em especial quando um ambiente 3D totalmente fechado é necessário18, a influência do fluxo17,19,23 ou membrana composição23 sobre os padrões de MinCDE investigado, ou se os padrões de proteína devem ser observados sob proteína limitar condições19. No entanto, o controle local das concentrações moleculares é mais difícil. Componentes de proteínas, especialmente a mente, fortemente ligam à membrana encontram primeiro18,19. Em nossa experiência, as proteínas frequentemente exibem inespecificas de tubulação, enseadas, seringas e outras partes de microfluidic. Daí, as concentrações de proteína locais diferem das concentrações de entrada18 e também variam ao longo do comprimento da célula-fluxo, resultando em uma variedade de padrões diferentes de proteína na membrana entre entrada e saída, como observado por outros19.
A segunda metade do protocolo apresentado aqui, a reconstituição em vitro em microestruturas de forma cilíndrica, re-utilizando a abordagem de câmara aberta num suporte modelado coberto por lipídios bilayers permite uma simples mímica de comportamento de proteína na vivo controle preciso sobre as concentrações de proteína, embora seja perdido devido à remoção de tampão. Observe que porque o comprimento de onda de MinDE é sobre uma ordem de magnitude maior em vitro do que in vivo as microcompartments em forma de haste são também sobre uma ordem de magnitude maior (10 x 30 µm) do que uma haste em forma de e. coli célula.
Em geral, este protocolo permite o controle preciso de todas as condições, incluindo a concentração de proteína, composição de tampão e propriedades da membrana. O uso do 3D suporta estruturada permite que a reação a ser estudado sob confinamento espacial, imitando o comportamento na vivo sem a necessidade de equipamento de microfluídica complexo.

Spatiotemporal padrões são essenciais na natureza, regulação de tarefas complexas no nível celular e multicelular, da morfogênese regulamentado divisão celular1,2. Sistemas de reação-difusão desempenham um papel importante no estabelecimento desses padrões, mas são ainda não bem compreendidos. Um exemplo de um sistema de reação-difusão e o melhor sistema biológico caracterizado até agora é a Escherichia coli MinCDE sistema3,4,5,6,7. O sistema MinCDE oscila de polo de célula para polo de célula em Escherichia coli para determinar o meio da célula, como o site da divisão futura. Este sistema baseia-se na mente da ATPase, a activação da proteína, mina e a membrana como uma reação espacial matriz8ATPase. MinC não é parte do mecanismo de formação do teste padrão, mas é o agente funcional real: um inibidor da divisome principal proteína FtsZ5,6. MinC vincula-se à mente e, portanto, segue as oscilações, resultando em um gradiente de concentração de proteína a média de tempo que é máxima nos polos da célula e mínimas, quando no meio da célula, permitindo apenas FtsZ polimerizar em midcell9,10 . O sistema MinCDE é parte da maior família de Walker A ATPases que são fundamentais para a organização spatiotemporal em bactérias2, de posicionamento e transporte de proteína complexos11 e plasmídeos12 e para a regulação da célula Divisão13 cromossomo segregação e14. Portanto, o sistema de reação-difusão de MinCDE não só representa um sistema de reação-difusão arquetípica, mas também tem atraído a atenção por causa de sua relevância para a organização spatiotemporal em bactérias.
Estudos detalhados de funcionais do MinCDE sistema na vivo são complicados, como manipulação de exclusão proteínas e gene normalmente resultar em defeitos de divisão celular. Além disso, alterando a composição da membrana ou as propriedades do citosol na vivo é muito desafiador15,16. Mudanças para o sistema e influenciando fatores são difíceis de interpretar no complexo ambiente da célula, ainda mais se ele é meio louco em uma função tão essencial como a divisão celular. Nós e os outros têm, portanto, virou-se para uma abordagem reconstituição in vitro , reduzindo o sistema para seus componentes principais: mente, minha, ATP como fonte de energia e a bicamada lipídica com suporte como uma reação matriz6,17, 18. esta abordagem bottom-up permite sondar o mecanismo de auto-organização em detalhes sem a complexidade de uma célula viva. A forma de proteínas viajando superfície ondas6 e outros tipos de padrões de17,19 sob essas condições, embora com um comprimento de onda, que é geralmente sobre uma magnitude maior do que na vivo. O uso de uma câmara aberta facilita um controle preciso sobre todos os aspectos que influenciam a formação do teste padrão: as concentrações de proteína6, proteína propriedades20, membrana composição10, composição de tampão e concentração de ATP 6, bem como a adição de outros factores como apinhamento agentes21 e outras proteínas de divisome22. Em comparação, a reconstituição em vitro do sistema em uma pilha de fluxo18,19,23 MinCDE pode ser usada para investigar a influência do fluxo17,23, proteína limitar as condições19, membrana composição19 e confinamento 3D completo18 em padrões de proteína, mas processa um controle exato da concentração de proteína/componente e componente sequencial adição muito mais complicado.
Usando esta câmara aberta, nós também modelado o apoio dos bilayers do lipid planar pelo qual um pode sondar como geométricos limites influência padrão formação21, um fenômeno que tem recentemente sido também investigados na vivo usando bactérias moldado em microestruturas7. Também utilizamos este ensaio para investigar as mutações como definidas no meu afeto padrão de formação do sistema20. Além disso, o mesmo formato básico do ensaio foi empregado para investigar como formação padrão pode ser controlada pela luz, apresentando um peptídeo de mina azobenzeno-quitosana para o ensaio e imagem latente com TIRF microscopia24.
Nós achamos que, a fim de replicar o padrão de MinDE formação observados na vivo em um confinamento de sistema, em vitro foi chave. Usar microcompartments de forma cilíndrica, com dimensões ajustadas para o maior comprimento de onda de MinDE em vitro (10 x 30 µm), folheados ou chapeados de uma bicamada lipídica com suporte permitiu a reconstituição das oscilações de polo a polo de MinDE e formação de gradiente de proteína 10,25. Neste ensaio, os bilayers do lipid suportados são depositados sobre um substrato PDMS padronizado que contém várias centenas réplicas de microcompartments de forma cilíndrica que permanecem abertos na parte superior. Por isso, a reação pode ser configurada numa câmara aberta, e posteriormente o buffer é abaixado até a borda do microcompartments, confinando, assim, a reação a um volume pequeno. Mesmo que estes compartimentos têm uma interface ar-tampão de um lado e, portanto, não representam um confinamento 3D por membrana, a dinâmica da proteína imitada no vivo oscilações10,25. Comparado ao confinamento totalmente 3D, que mostra muito semelhante resultados18, o ensaio aberto microestruturas é relativamente simples e fácil de manipular e também pode ser realizada por laboratórios que não estejam equipados com equipamentos especializados microfluídica e instalações de salas limpas.
Aqui, apresentamos um protocolo experimental para reconstituir MinCDE formação padrão em suporte lipid bilayers em vitro usando uma câmara aberta que permite o controle de todos os componentes e fácil acesso por microscopia óptica e, com menor modificações, também é adaptável para técnicas de superfície-sonda26. Ao lado de bilayers planar com suporte lipídico, mostramos também como o confinamento de proteína pode ser obtido usando bilayers simples estampados com suporte lipídico na forma de microestruturas PDMS. Estes ensaios, apesar de otimizado para o sistema de MinCDE, também podem ser transferidos para outros sistemas de proteínas que interagem de forma semelhante com a membrana, tais como FtsZ27 ou um mínimo de actina córtex28.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt trihydrate</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glycerol 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS crosslinker</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 and #63 both work well</td></tr><tr><td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td>used only for PDMS microstructures</td></tr><tr><td>0.5 ml reaction tube</td><td>Eppendorf</td><td>&amp;nbsp;0030123301</td><td></td></tr><tr><td>culture flask 2L</td><td>Corning</td><td>e.g. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 or 66330</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated protein purification system: &amp;Auml;kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>e.g. Model 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 mixer</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner Zepto</td><td>Diener electronic</td><td></td><td>use oxygen as process gas</td></tr><tr><td>positive displacement pipettes</td><td>Brand</td><td></td><td>Transferpettor models with glass tips</td></tr><tr><td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

Muitos aspectos da organização spatiotemporal fundamental das células são regidos por sistemas do tipo de reação-difusão. In vitro a reconstituição desses sistemas permite estudos detalhados de seus mecanismos subjacentes que não seria viáveis in vivo. Aqui, nós fornecemos um protocolo para a reconstituição em vitro do sistema MinCDE de Escherichia coli, que posiciona o septo de divisão celular no meio celular. O ensaio é projetado para fornecer apenas os componentes necessários para a auto-organização, ou seja uma membrana, as duas proteínas mente e minas e energia sob a forma de ATP. Nós, portanto, fabricar uma câmara de reação aberta sobre uma lamela, no qual é formada uma bicamada lipídica com suporte. O projeto aberto da câmara permite a preparação ideal da bicamada lipídica e manipulação controlada do conteúdo em massa. As duas proteínas, mente e minas, bem como ATP, é adicionado para o volume em massa acima da membrana. Imagem é possível por muitos microscopies ópticos, como o projeto suporta confocal, campo largo e microscopia TIRF igual. Em uma variação do protocolo, a bicamada lipídica é formada num suporte padronizado, na forma de célula microestruturas PDMS, em vez de vidro. Reduzindo a solução em massa até a borda desses compartimentos inclui a reação em um compartimento de menor e fornece os limites que permitem imitar na vivo comportamento oscilatório. Tomados em conjunto, descrevemos os protocolos para reconstituir o sistema de MinCDE com e sem confinamento espacial, permitindo que pesquisadores precisamente controlar todos os aspectos que influenciam a formação de padrão, tais como intervalos de concentração e adição de outros factores ou proteínas e sistematicamente aumentar a complexidade do sistema em uma instalação experimental relativamente simples.

Purificação de proteínas, a seguir o nosso protocolo deve produzir proteínas Min de pureza adequada. Como referência, a Figura 1 fornece uma imagem de SDS-PAGE da mente, fluorescente rotulados mente, meu e do MinC. Os passos individuais do procedimento para realizar um ensaio de auto-organização de MinDE em bilayers não-modelados com suporte lipídico são descritos na Figura 2. Usando este protocolo, MinDE regular superfície ondas viajantes pode ser observado em toda a câmara (Figura 3). O comprimento de onda pode variar ligeiramente dentro da câmara, mas em geral os padrões parecem. As bordas da câmara não devem ser usadas para comparações quantitativas, como membranas que forma sobre a cola UV parece ter propriedades diferentes do que no vidro de superfície (ver Figura 3). As ondas de superfície itinerantes podem ser analisadas através da representação gráfica da intensidade ao longo da direção de propagação (Figura 3B). Enquanto mente fluorescência platôs bastante rápido da borda esquerda da onda e em seguida, diminui acentuadamente à aresta de fuga, mina fluorescência aumenta quase linearmente, desde o início da onda de mente e atinge o seu máximo depois mente à aresta de fuga, onde ele cai acentuadamente6.
Ao lado de qualidade de proteínas, a qualidade do bilayers do lipid suportados é mais crítica para uma self-Organização regular de MinCDE. Por um lado se a membrana é lavada também excessivamente ou a superfície subjacente foi limpada e, portanto, carregada também fortemente, buracos podem formar na membrana (figura 6A, topo). Por outro lado, se a membrana não é lavada corretamente ou a superfície subjacente não é limpo/hydrophilized, vesículas vão ficar com a membrana ou a fluidez da membrana pode ser comprometida (figura 6A, inferior). Embora não tão evidente como ao observar a membrana diretamente via rotuladas lipídios, estes problemas também podem ser detectados do sinal de fluorescência da mente, como os padrões não são regulares e a fluorescência no maxima não é homogênea, mas contém "buracos" ou pontos brilhantes como mostrado no painel médio da figura 6A.
Para a auto-organização de MinDE, em forma de microestruturas PDMS, o procedimento está resumido na Figura 4. Várias etapas de protocolo não precisam ser repetidos, como proteínas e lipídios podem ser reutilizados. Como em substratos não-padronizada, o substrato é limpo e hydrophilized (por plasma-limpeza), uma com suporte lipídica é formada sobre o PDMS e o ensaio de auto-organização é criado em um volume de 200 µ l. Para verificar que formou-se uma membrana apropriada e MinDE Self organiza na membrana, são imagens de câmaras. Quando uma membrana apropriada foi formada, formas de MinDE regular superfície ondas viajantes na superfície dos PDMS entre as microestruturas individuais e auto organiza também na parte inferior das microestruturas como as ondas podem livremente mover ao longo de todo superfície coberta de membrana (Figura 5A). Após a remoção do tampão, a superfície entre os compartimentos não deve apresentar qualquer propagação padrões de MinDE (Figura 5B), como deve ser totalmente seco. Se os padrões de MinDE são ainda em movimento, mais reserva precisa ser removido. As proteínas estão confinadas na microcompartments em forma de haste pela membrana-folheados PDMS e pelo ar na interface superior (Figura 5), no qual eles Self organizará.... Nestas condições as duas proteínas podem realizar oscilações de polo a polo, conforme mostrado na Figura 5. Como uma fração da mente e o meu é sempre membrana-limite, também durante a remoção do tampão, as concentrações após a remoção do tampão não são comparáveis às concentrações de entrada. Devido a este efeito as concentrações variam também entre microestruturas individuais na mesma lamela como eles dependem da posição dos padrões antes da remoção do tampão. Produção de bolacha de silício ou moldagem de PDMS do wafer de silício pode resultar em microestruturas incompletas que não podem ser usadas para análise (Figura 6B). Além disso, devido ao buffer de microestruturas de remoção podem secar durante o processo e, portanto, devem ser excluídas mais de análise (Figura 6B). Como resultado, apenas uma fração das microestruturas em uma câmara mostra as oscilações de polo a polo desejadas. Para analisar a dinâmica da proteína nas microestruturas, um kymograph pode ser obtido por uma seleção de desenho ao longo de toda a estrutura (Figura 5E). Quando MinCDE oscilar de polo a polo, MinC e mente mostrará um gradiente de concentração-a média de tempo com concentração máxima nos polos do compartimento e concentração mínima no meio do compartimento (Figura 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figura 1: mostrando os produtos finais de purificação da proteína de SDS-PAGE. Sua mente (33,3 kDa), His-eGFP-mente (60.1 kDa), His-mRuby3-mente (59,9 kDa), sua mina (13.9 kDa) e His-MinC (28,3 kDa) são mostradas em ordem. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figura 2: diagrama de fluxo de processo, mostrando os passos individuais e sincronismo do protocolo para a auto-organização na bilayers não-modelados com suporte lipídico (passos 1-6). Caixas tracejadas indicam que uma destas duas opções pode ser usada para a limpeza. Setas marcadas por círculos indicam onde o protocolo pode ser pausado e retomado mais tarde. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figura 3: imagem do ensaio de MinDE por microscopia confocal. A) Min Regular espiral, do qual velocidade de propagação da onda, a trama de intensidade e velocidade as medições podem ser obtidas. Concentrações utilizadas: 0,6 µM se importa (30% eGFP-mente), 1,8 µM sua mina-(30% sua-mina-Alexa647) B) enredo de intensidade normalizada de exemplo para a região marcada em r. C) visão geral da câmara de ensaio inteiro (barra de escala: 1 mm, as concentrações de proteína mesmo como acima). Espirais, transformando qualquer direção, bem como padrões de destino podem ser observados. A região ampliada mostra como padrões de onda diferem na UV-cola. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figura 4: diagrama de fluxo de processo, mostrando os passos individuais e sincronismo do protocolo para auto-organização em microestruturas em forma de haste (passos 1-5, 7, 8). Caixas cinzentas indicam etapas onde os produtos podem ser reutilizados de protocolo na bilayers lipídico com suporte não-padronizada. Setas marcadas por círculos indicam onde o protocolo pode ser pausado e retomado mais tarde. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figura 5: formação em forma de PDMS microcompartments de padrão de resultados representativos para MinDE. A) MinDE se auto-organizar na superfície do PDMS formando ondas de superfície de viagem (se importa 1 µM (30% EGFP-mente), 2 µM meu e 2,5 mM ATP). B) após o buffer é reduzido para a altura das microestruturas, a auto-organização de proteína para na superfície planar entre o microcompartments. C) esquemático de um microcompartment de forma cilíndrica. D) imagens representativas das oscilações de polo a polo MinDE após a remoção do tampão. E) Kymograph das oscilações ao longo da linha realçada mostrada a D). F) imagem e perfil da intensidade média de fluorescência do tempo-série mostrada em D) mostrando claramente o gradiente de proteína que é máxima nos polos de microcompartment e mínima no meio do compartimento. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figura 6: exemplos de resultados experimentais negativos. A) membranas over lavadas acumulam buracos, enquanto preparações suboptimal vesículas e composições lipídicas levam a degola de vesículas. Os painéis de dois centro mostram uma combinação de ambos os problemas e como eles se tornam visíveis quando observar oscilações de Min. Membranas foram rotuladas com 0.05% Atto655-DOPE. (barras de escala: 50 µm) B) painel superior: secou microcompartments pode ser causado por demasiado remoção de tampão ou quando o buffer evapora ao longo do tempo. Painel inferior: compartimentos incompletos podem ser formados durante a produção da bolacha ou moldagem de PDMS. (barras de escala: 30 µm) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo complementar 1: Mapa do plasmídeo para sua mente. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 2: Mapa do plasmídeo para His-EGFP-mente. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 3: Mapa do plasmídeo para His-mRuby3-mente. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 4: Mapa do plasmídeo para sua mina. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 5: Mapa do plasmídeo para His-MinC. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 6: Arquivo CAD para wafer de silício de microcompartments de forma cilíndrica. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Nós fornecemos um protocolo para in vitro ensaios de auto-organização da mente e da minha em uma bicamada lipídica suportados numa câmara aberta. Além disso, descrevemos como delimitar o ensaio em lipídios-folheados microcompartments PDMS para imitar as condições na vivo por confinamento de reação.

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

12.1K visualizações.  Max Planck Institute of Biochemistry. Nós fornecemos um protocolo para in vitro ensaios de auto-organização da mente e da minha em uma bicamada lipídica suportados numa câmara aberta. Além disso, descrevemos como delimitar o ensaio em lipídios-folheados microcompartments PDMS para imitar as condições na vivo por confinamento de reação.

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formação de biomembrana Microarrays com um método de montagem baseada em Rodo

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Bioengenharia

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Uma plataforma de membrana modelo para reconstituir a dinâmica da membrana mitocondrial

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Formação espontânea e rearranjo das redes de nanotubo lipídica Artificial como um modelo de baixo para cima para o retículo endoplasmático

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Padrão de proteína reversível controlado por luz em membranas lipídicas

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Autor em destaque: Recrutamento de proteínas comutáveis por foto para padrões reversíveis em sistemas celulares artificiais

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

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Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal