Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM092993) den SHO hibe tarafından desteklenen, Ulusal Bilim Vakfı (NSF KARİYER Ödülü ve DBI 0.964.216), Donanma Araştırma Bürosu (ONR) Genç Araştırmacı Programı ve Biyoteknoloji Minnesota Ortaklık Ödülü ve Tıbbi Genomik. Cihaz fabrikasyon Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı aracılığıyla NSF destek alan Minnesota Üniversitesi NANO Merkezi (NFC), gerçekleştirildi. Bu çalışma aynı zamanda Sağlık (NS048357, R21 NS073684), Ulusal Multipl Skleroz Derneği (CA1060A11), Applebaum, Hilton, Peterson ve Sanford Vakıflar ve McNeilus ailenin National Institutes MR için hibe tarafından desteklenmiştir. Yazarlar taramalı elektron mikroskobu ile yardım için illüstrasyonlar ve Shailabh Kaya ile yardım için Hyungsoon Im teşekkür etmek istiyorum.

Microwell Dizi Yüzey 1. Mikro ve <ol><li> Termal olarak yetiştirilen oksit 100 nm olan bir 4 inç silikon gofret ile başlayın. </li><li> 30 saniye boyunca 4,000 rpm&#39;de gofret SPR-955 0.7 photoresist&#39;i Spin. </li><li> 90 saniye boyunca 115 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde pişirilir. </li><li> Photoresist&#39;i Açığa. <ol><li> Dizi, bir 2 mm x 2 mm alanı kapsayan bir 3 um süresi ile bir altıgen dizide düzenlenmiş 1 um delikler yaratacak bir maske kullanın. </li><li> 6 mm adım büyüklüğü ve 200 mJ / cm 2 &#39;lik bir pozlama kullanan bir i-hat step in gofret Açığa. </li></ol></li><li> 90 saniye boyunca 115 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde pişirilir. </li><li> 90 saniyelik bir geliştirme toplam süresi için gofret CD-26 2 birikintileri yatırmak için bir spin geliştirici kullanarak geliştirin. </li><li> N 2 ile ultra saf DI su ve kuru ile iyice durulayın. </li><li> Ar 50 sccm&#39;lik, CF 4 25 sccm&#39;lik ve CHF 3 flo 50 sccm&#39;lik ile 6 dakika boyunca bir reaktif iyon etcher in oksit etch75 mTorr basıncında kanat. </li><li> C4 F 8 63 sccm&#39;lik, SF 6 27 sccm&#39;lik, Ar 40 sccm&#39;lik ve O 2 14 mTorr basıncında akan 10 sccm&#39;lik ile 2 dakika boyunca bir ICP derin açması reaktif iyon etcher olarak silikon etch. </li><li> Karşı kaldırmak için aseton, metanol ve izopropanol içinde durulayın. </li><li> H 2 SO 4 banyosu içinde yer: H 2 O 2 01:01 yüzeyi temizlemek için 10 dakika karıştırıldı. </li><li> N 2 ile ultra saf DI su ve kuru ile iyice durulayın. </li><li> 250 ° C&#39;de atomik tabaka birikimi ile Al 2 1.080 Å O 3 yatırınız </li></ol> Poli 2.. Hazırlama (dimetilsiloksan) Çekçek <ol><li> Mümkünse, bir temiz oda çalışır. Aksi mümkün temiz ortamda çalışmak. </li><li> ≥ 13 mm saplı bir plastik Petri çanak (veya başka temiz tek bir kap) edinin. </li><li> Bu yemeğin içinde, 50 g PDMS bas ardından, 5 gr PDMS sertleştirme ajanı dökmeke maddesi (ya da çoğunlukla Petri kabı dolduracak 1:10 şey). Bir kullanılıp atılabilir plastik bir pipet ya da çubuk ile iyice karıştırın. </li><li> Kabarcıkları karışımı (yaklaşık 30 dakika) üzerinden gelinceye kadar vakum uygulanarak, bir vakum hattı olan bir bölme içerisinde karışık PDMS yerleştirerek kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Zaten Petri kabındaki, hava kabarcıklarının oluşturulmasını önlemek Petri kabındaki PDMS, dökmek değilse. </li><li> 50 ° C (daha az bir süre için yüksek ısı de çalışıyor)&gt; bir ocak gecede Cure. </li><li> Temiz / yeni jilet ile, dikkatle mümkün olduğunca temiz üst yüzeyi tutarak, bir dikdörtgen parça, yaklaşık 2.5 x 2.5 cm kesti. Temiz bir forseps ile soyunuz. (Bu silecek sürecinde kullanılan kenar olacak) mümkün olduğunca keskin üst kenarına yapmak için, bir hareket jilet bastırarak bir kenarını (1.5 cm aşağı) keserek. </li><li> Daha sonra aseton, metanol, izopropil alkol, ve ultra saf DI su ile yıkayınız ve temiz, kuru bir nitrojen gazı ile darbe. Temiz bir Petri kabındaki saklayın. </li></ol> Veziküller 3. Hazırlanması <ol><li> Lipid stok 25 mg / ml yumurta fosfatidilkolin (PC) solüsyonları ve 1 mg / ml 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N toplayın - kloroform (lisamin rodamin B sülfonil) amonyum tuzu (Rho-DPPE) ve kloroform / metanol içinde monosialoganglioside GM1 bir 0.5 mg / ml stok çözeltisi (2:1 v / v). </li><li> Küçük bir cam şişe içinde 25 mg / ml PC 18.9 ul, 0.5 mg, 39.6 ul / ml GM1 ve 7.9 ul eklenmesi ile 97 mol% PC,% 2 mol GM1 ve 1 mol% Rho-DPPE sonuçlanan bir karışım yapmak 1 mg / cam şırıngalar kullanılarak ml Rho-DPPE. </li><li> Not:. Nair ve diğerleri, 25 için ek malzeme istenen herhangi bir bileşimin vezikülleri oluşturmak için gerekli lipitlerin miktarlarını hesaplamak için mükemmel bir özelleştirilebilir Excel içerir. </li><li> Bir vakumlu desikatör içinde şişe yerleştirin ve 6 saat için vakum altında şişeyi bırakarak çözücü çıkarın. </li><li> 0.1 &#39;lik bir sulu çözelti yapınM NaCl. Kurutulmuş lipid filmi içeren şişeye 0.1 M NaCl çözeltisinin 0.5 ml ilave edilir. </li><li> Sulu lipid karışım gece boyunca dinlenmeye bırakın. </li><li> Bir vezikül süspansiyonu oluşturmak için Kısaca girdap karışımı, daha sonra oda sıcaklığında bir banyo sonikatörü içinde 20 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır. </li><li> 100 nm gözenek boyutu olan bir polikarbonat membran ile vezikül süspansiyonunun Ekstrüze. Filtre 17X ile vezikül süspansiyonunun geçirin. </li><li> 4 ° C&#39;de bir cam şişe içinde çekilmiş veziküllerin saklayın </li></ol> Küresel Desteklenen lipit tabakalarının 4. Oluşumu <ol><li> 700 nm çaplı SiO 2 boncuk toplayın. Taneler, 1.4 x 10 11 boncuk / ml &#39;lik bir stok konsantrasyonu ile damıtılmış su içinde temin edilmektedir. </li><li> Bir 1.5 ml Eppendorf tüpü içinde 0.1 M NaCI 893 ul boncuk stok çözeltisinin 107 ul ekleyerek 1.5 x 10 10 boncuk / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile bir 1 ml boncuk süspansiyonu hazırlamak. </li><li> Iyi mi sağlamak için süspansiyon vorteksxed. </li><li> 20 dk sonra süpernatant atın için 1.700 x g&#39;de süspansiyon santrifüj. 0.1 M NaCI, 1 ml olarak boncuk yeniden süspanse edin. Iyice boncuk yıkamak için iki kez daha bu adımı tekrarlayın. </li><li> , SSLBs oluşturan bir 1.5 ml Eppendorf tüpü içinde 1 mg / ml vezikül süspansiyonunun 200 ul SiO 2 boncuk süspansiyonu 25 ul ekleyin. Vortex karışım, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bekletilir. Bu aşamada SSLB konsantrasyonu 1.7 x 10 9 SSLBs / ml olmalıdır. </li><li> SSLBs pellet haline getirmek için 20 dakika boyunca 1700 x g&#39;de santrifüjleyin. Pelet nedeniyle boncuklar üzerinde Rho-DPPE ile veziküllerin rüptürü pembe görünmelidir. </li><li> 225 | il fosfat tamponlu tuz (PBS), pH = 7.4 &#39;de tekrar süspansiyon süpernatan ve atın. Tekrar SSLB süspansiyon herhangi yırtılmamış veziküllerini kaldırmak için 4.6-4.7 adımları iki kez daha. </li></ol> SSLB Array 5. Meclisi <ol><li> 4-6 mikrofon ile dikdörtgen parçalar sonuçlanan mikro diziler Cleave gofretbirim başına Rowell diziler. </li><li> Vortex SSLB süspansiyonu karıştırmak, sonra her mikrowell dizideki SSLB süspansiyonu 10 ul yerleştirin. 1 saat dinlenme SSLBs yüzeyine yerleşmek için izin diye. </li><li> Sonra yavaşça sığ bir tabak içinde hazırlanmış bir PBS banyosunda daldırın, bir yıkama şişesinden PBS ile mikro dizi çip yıkayın. </li><li> Batık ise, yavaşça mikro dizi çip üzerinde PDMS silecek floş yerleştirin ve yavaşça mikro oyuk hareketsiz değil SSLBs kaldırmak için yüzeyi 5x boyunca kaydırın. </li><li> Kavrama hafifçe mikro dizi cımbız ile çip ve herhangi bir aşırı SSLBs kaldırmak için PBS banyosunda sallayın. </li><li> Çabuk silecek banyosundan çipi çıkarın ve daha sonra kullanmak kadar taze PBS banyosunda yerleştirin. Çipin üst yüzeyi SSLBs korumak için ıslak olduğundan emin olun. </li></ol> Not: Yukarıda tarif edilen montaj yöntemi fare beyin veya pho izole myelin parçacıkların gibi doğal zar parçacıklarının diziler yaratmak için kullanılabilirSiO 2 kordon destek olmadan spholipid veziküller. Bu çalışma Wittenberg et de ayrıntılı olarak tarif edilmiştir al. 21 ve temsili sonuçlar aşağıda gösterilmiştir. 6.. Kolera Toksin Bağlanma Deneyi <ol><li> PBS içinde sığır serum albümini (BSA) içinde bir 2 mg / ml çözeltisi hazırlayın. </li><li> 2 mg / ml BSA ile PBS içinde Alexa 488 ile konjuge edilmiş kolera toksini B-alt-biriminin istenen konsantrasyonuna sahip bir çözelti hazırlayın. </li><li> PBS banyosundan SSLB dizi çipini çıkarın ve silin bir laboratuvar ile PBS solüsyonu en uzak fitil. SSLB dizi sulu tutmak için çip üzerinde yeterli PBS bırakın. </li><li> Özel olmayan bağlanmasını önlemek için, 2 mg / ml SSLB dizi çip BSA çözeltisi 200 ul ekleyin. Nemlendirilmiş kutu içinde 1 saat bekletin. </li><li> Bir mikropipet ile, SSLB dizi çip üstünden çözeltisi 200 ul çıkarın. </li><li> SSLB dizi çip kolera toksin çözeltisi 200 ul ilave edin ve bir nemlendirilmiş kutu içinde 1 saat boyunca geri kalanı sağlar. </li><li> Yavaşça herhangi bağlanmamış kolera toksini kaldırmak için bir yıkama şişesinden PBS ile SSLB dizi çip yıkayın. </li><li> Bir laboratuvar kullanarak fitil uzak aşırı PBS silin. 24 mm x 40 mm kapak kayma ile kapak çip görüntüleme önce. </li><li> Filtre kullanarak dik bir mikroskop ile görüntü diziler ilgi floroforlar için uygun ayarlar. </li><li> ImageJ yazılım otomatik parçacık analiz fonksiyonunu kullanarak bir dizi bireysel SSLBs arasında floresan yoğunluğu analiz edin. </li><li> Belirli bir dizi üzerinde bulunan SSLBs yoğunluklarını özetlemek histogramlar içine bireysel SSLBs itibaren ortalama floresan yoğunlukları derlemek. </li></ol>

<ol>
	<li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery:+A+Historical+Perspective.">Drug discovery: A Historical Perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).</li><li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Membrane+Receptor+Screening+and+Analysis.">Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis.</a> J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).</li><li>Voskuhl, J., Ravoo, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Recognition+of+Bilayer+Besicles.">Molecular Recognition of Bilayer Besicles.</a> Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles:+Preparations+and+Applications.">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).</li><li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Supported+Lipid+Bilayers:+From+Biophysical+Studies+to+Sensor+Design.">Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design.</a> Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).</li><li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Steps+of+Supported+Bilayer+Formation+Probed+by+Single+Vesicle+Fluorescence+Assays.">Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays.</a> Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li><li>Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Mono-+and+Bilayer+Lipid+Membranes+on+Au+and+Hg.">Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg.</a> Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).</li><li>Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Coherent+anti-Stokes+Raman+Scattering+Imaging+of+Lipid+Distribution+in+Coexisting+Domains.">Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains.</a> Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).</li><li>Richter, R. P., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+Formation+of+Supported+Lipid+Bilayers+on+Mica:+A+Study+Combining+AFM,+QCM-D,+and+Ellipsometry.">Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry.</a> Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).</li><li>Dahlin, A., Z&#228;ch, M., Rindzevicius, T., K&#228;ll, M., Sutherland, D. S., H&#246;&#246;k, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Surface+Plasmon+Resonance+Sensing+of+Lipid-Membrane-Mediated+Biorecognition+Events.">Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).</li><li>Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+Lipid+Membranes+Analyzed+with+High-Resolution+Secondary+Ion+Mass+Spectrometry.">Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry.</a> Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).</li><li>Groves, J. T., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropattern+Formation+in+Supported+Lipid+Membranes.">Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes.</a> Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).</li><li>Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., V&#246;r&#246;s, J., Stadler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+and+Lipid+Bilayer+Arrays+Towards+Biosensing+Applications.">Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications.</a> Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).</li><li>Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+in+Studies+on+Immune+Cell+Adhesion+and+Communication.">Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication.</a> J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .</li><li>Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Phospholipid+Bilayer-Coated+Microchannels+for+On-Chip+Immunoassays.">Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays.</a> Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).</li><li>Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+Fluid+Lipid+Bilayers+on+Solid+Supports.">Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports.</a> Science. 275 (5300), 651-653 (1997).</li><li>Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+Composition+Arrays+of+Supported+Lipid+Bilayers+by+Microcontact+Printing.">Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing.</a> Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).</li><li>Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Photochemical+Patterning+and+Refunctionalization+of+Supported+Phospholipid+Bilayers.">Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).</li><li>Kelly, C. V., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofabrication+for+the+Analysis+and+Manipulation+of+Membranes.">Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).</li><li>Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Arrays+of+Submicron+Spherical+Supported+Lipid+Bilayers.">High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers.</a> Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).</li><li>Wittenberg, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+Assembly+of+Micro-+and+Nanoarrays+for+Sensing+with+Natural+Cell+Membranes.">Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes.</a> ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).</li><li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels.">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).</li><li>Kalyankar, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arraying+of+Intact+Liposomes+into+Chemically+Functionalized+Microwells.">Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells.</a> Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).</li><li>Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., H&#246;&#246;k, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Self-Assembly+of+Single+Lipid+Vesicles+in+Nanoplasmonic+Apertures+in+Gold.">Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold.</a> Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).</li><li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Patterned+Supported+Lipid+Membranes+to+Investigate+the+Role+of+Receptor+Organization+in+Intercellular+Signaling.">Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling.</a> Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).</li><li>Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+Binding+Affinity+and+Specificity+for+Gangliosides+Determined+by+Surface+Plasmon+Resonance.">Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance.</a> Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).</li><li>Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micrometer-Sized+Supported+Lipid+Bilayer+Arrays+for+Bacterial+Toxin+Binding+Studies+Through+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).</li><li>Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1+Clustering+Inhibits+Cholera+Toxin+Binding+in+Supported+Phospholipid+Membranes.">GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).</li><li>Gill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arrangement+of+Subunits+in+Cholera+Toxin.">The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin.</a> Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).</li><li>Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+Supported+Lipid+Bilayers+Containing+Monosialoganglioside+GM1:+A+QCM-D+and+FRAP+study.">Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study.</a> Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).</li><li>Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibre+Optic+Microarrays.">Fibre Optic Microarrays.</a> Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).</li><li>Bake, K. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Spectroscopic+Detections.">Multiplexed Spectroscopic Detections.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).</li><li>Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Monitoring+of+Lipid+Transfer+Between+Vesicles+and+Hybrid+Bilayers+on+Au+Nanoshells+Using+Surface+Enhanced+Raman+Scattering+(SERS).">Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).</a> Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).</li><li>Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Properties+of+Nanohole+Arrays+in+Metal-Dielectric+Double+Films+Prepared+by+Mask-on-Metal+Colloidal+Lithography.">Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography.</a> ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).</li><li>Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Plasma+Membrane+Compartmentalization+with+Patterned+Lipid+Bilayers.">Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Curved+Membranes+Recruit+Amphipathic+Helices+and+Protein+Anchoring+Motifs.">How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+G-Protein-Coupled+Receptors+in+Cell-Derived+Plasma+Membranes+Supported+on+Porous+Beads.">Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek hiçbir rakip mali çıkarları var.

Bu çalışmada, biz destekli lipid çift tabakaları ile kaplanmış tek dağılımlı SiO 2 boncuk lipid iki katmanlı ya da alt-tabaka yüzeyi üzerinde ligandların hedef için gerek kalmadan mikro diziler halinde dizilmiş olabilir ve diziler toksin lipid etkileşimleri belirlemek için kullanılabileceğini göstermektedir. CTx/GM1 bağlanması için hesaplanan ayrışma sabiti biz önceki bir raporla, literatürde değerlerin geniş bir eşitsizlik göz önüne alındığında, uygun bir şekilde kıya...

Lipid iki katmanlı membranlar doğada temel yapılardır. Hücresel zarlar, plazma ve organel membranlar yaşam için gerekli olan moleküller, bir dizi dahil lipid ikili katmandan oluşmaktadır. Birçok yaşamı sürdürme işlemleri hücrelerinin yüzeyinde meydana veya lipit iki katmanlı membran ile ilişkili moleküller aracılık eder. Aslında, birçok ilaç hedef işlemler veya moleküller 1,2 veya zarlarında bulunmaktadır. Bu tür zar analitik yüzeylerinde meydana gelen kimyasal reaksiyonlar veya kovalent olmayan bağlanma olaylar gibi süreçleri araştırılması gereklidir. Doğal membranlar sensörleri ile izole ve / veya arayüz zor olabilir çünkü, birçok araştırmacı, analitik çalışmaları yürütmek için basitleştirilmiş bir model zarları kullanır. Model membran sistemleri bir dizi nano boyutta 3,4 ile lipozomlara çapı mikron On ila yüzlerce olabilir dev veziküllerden kadar, literatürde tarif edilmiştir. Alternrin, katı destekler üzerinde biriken düzlemsel lipid çift, yani ikili lipid tabakalarıdır (SLBS), farklı yüzeylerin bir dizi oluşturulabilir ve yaygın olarak, biyo-fiziksel biyokimyasal ve analitik uygulamalarda 5 kullanılmaktadır desteklenir. Elektrik ya da optik malzeme ile birleştirilmesi SLBS farklı analitik tekniklerin kullanılması ile membran biyokimya ve biyofiziğin soruşturma sağlar. Floresan mikroskopi 6, elektrokimya 7, optik spektroskopi 8, taramalı prob mikroskopisi 9, yüzey plazmon rezonans 10 ve kütle spektrometresi 11 tüm SLBS yapısını ve özelliklerini incelemek için istihdam edilmiştir. SLB diziler multipleks 12,13 deneyleri için sensörler tasarımında ek bir esneklik sunar. Diğer uygulamalar bağışıklık hücrelerinin 14 arasında oluşan kavşak taklit etmek SLB diziler kullanın. SLB diziler için hazırlama yöntemleri microflu arasında değişmesineidic bitişik SLB yamalar arasındaki fiziksel engelleri istihdam olanlar için 15 yaklaşır. 16. Diğer gruplar baskı yöntemleri 17 kullandım, fotokimyasal desenlendirme 18 ve çeşitli nanoengineering SLB diziler oluşturmak için 19 yaklaşır. Bu kağıt ve ekteki videoda mikro oyuk 20&#39;nin sıralı diziler halinde SLB-kaplanmış boncuklar SiO 2 biriktirilmesiyle SLB dizileri oluşturmak için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz küresel desteklenen lipit tabakalarının (SSLBs) olarak SLB kaplı SiO 2 boncuklar bakın. Bu teknik, aynı zamanda, örneğin sonuçları göstermektedir başka doğal kaynaklardan 21, elde edilen fosfolipid vezikülleri ve biyomembranlarda dizileri oluşturulan önceki işin bir uzantısıdır. Biyomembran tanecikleri veya veziküller arraying için diğer yöntemler vesikül yüzeyi üzerinde bulunan tamamlayıcı bir ligand ile ortak yüzeyleri üzerinde belirli hedefleme ligandlarının kalıpları yararlanmıştır. Örnekleri arasında biyotin-içeriravidin dernek 22,23 ve DNA hibridizasyon şemaları 24. Bizim yaklaşım sadece gerekli hiçbir hedefleme veya tanıma kısımları ile bir mikro dizi gerektirir. SSLBs büyüklüğü düşük poli-disperitesineM sahip SiO 2 boncuk desteklerin, çapı ile tanımlanır. SSLB çapından biraz daha büyük için mikro çapını ayarlayarak, tek bir SSLB her kuyucuktan yerleşir. Bir poli (dimetilsiloksan) (PDMS) silecek sonra yüzeyinden mikro oyuk hareketsiz olmayan tüm SSLBs kaldırır. Mikro-ve elde edilen diziler SSLB 3 um merkez-merkez aralığında ve altıgen periyodik yüksek yoğunluklu (~ 10 5 SSLBs / mm 2) sahiptir. Seri olarak, farklı lipid bileşimlerle SSLBs biriktirilmesi ile, rasgele konumlandırılmış olan çok-bileşenli SSLBs diziler oluşturmak mümkündür. SSLB Dizilerin algılama yeteneğini göstermek için, SSLBs dahil bir Gangliozidleri (GM1) ile kolera toksini (CTx) etkileşimini kullanılır. Iledoğal zar partiküller, iki farklı hücre tiplerinden membran malzemesi ihtiva eden, çok-bileşenli dizilerde hücreye özel lipidler tespit etmek mümkün oldu.

<table><tbody><tr><td>4 inch silicon wafers</td><td>University Wafer</td><td>425</td><td></td></tr><tr><td>Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SPR955-CM</td><td></td></tr><tr><td>Shipley MICROPOSIT CD-26 developer</td><td>MicroChem</td><td>CD-26</td><td></td></tr><tr><td>i-line stepper</td><td>Canon</td><td>2500 i3 stepper</td><td></td></tr><tr><td>Vision 320 reactive ion etcher</td><td>Advanced Vacuum</td><td>Vision 320 RIE</td><td></td></tr><tr><td>Deep trench reactive ion etcher</td><td>Plasma Therm</td><td>SLR-770</td><td></td></tr><tr><td>Atomic layer depostion system</td><td>Cambridge NanoTech</td><td>Savannah</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Egg phosphatidylcholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C</td><td></td></tr><tr><td>Monosialoganglioside GM1</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860065P</td><td></td></tr><tr><td>Silica beads</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS03N/4666</td><td>Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.</td></tr><tr><td>Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>C-34775</td><td></td></tr><tr><td>Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>NL1326R</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Molecular Probes</td><td>T-3136</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf MiniSpin centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-401-09</td><td></td></tr></tbody></table>

formation of biomembrane microarrays with a squeegee-based assembly method

Lipid iki katmanlı membranlar hücrelerin plazma membranları formu ve hücre içi organellerin sınırlarını tanımlar. Doğada bu membranlar, lipidler, çok çeşitli heterojen karışımlarıdır zara bağlı proteinleri içeren ve karbonhidrat ile süslenmiştir. Bazı deneylerde, doğal membran olanlardan iki lipid tabakasının biyo-fiziksel ya da biyokimyasal özellikleri ayrılması için tercih edilir. Bu gibi durumlarda, dev vesiküller, lipozom ya da taşıyıcı lipid iki katmanlı (SLBS) gibi model sistemlerinin kullanımı gerektirir. SLBS Diziler uygulamaları algılamak ve hücre-hücre etkileşimleri taklit için özellikle çekicidir. Burada SLB dizileri oluşturmak için yeni bir yöntem tarif eder. Mikrondan daha küçük çaplı SiO 2 boncuk birinci küresel SLBS (SSLBs) oluşturmak için, lipid çift tabakaları ile kaplanmıştır. Boncuklar daha sonra mikro-fabrikasyon submikron çaplı mikro oyuk bir diziye yatırılır. Ayrılmayı ise hazırlama tekniği, alt-tabaka yüzeyini temizlemek için bir &quot;sileceği&quot; kullanmaktadırmikro oyuk içine yerleşmiş SSLBs arkasında g. Bu yöntem, mikro alt-tabakanın herhangi bir kimyasal modifikasyonu, ne de SSLB üzerinde herhangi bir hedefleme ligandı gerektirir. Kuyu çap tane çapı biraz daha büyük olmak için ayarlanmıştır çünkü Mikrodelikler tek boncuk tarafından işgal edilmiştir. Geri kalan boş kalır Tipik olarak, kuyuların daha fazla% 75, işgal edilmiştir. Tamponda SSLB diziler daha büyük bir haftadan uzun süreli stabilite gösterir. Biz gangliosid GM1 ile kolera toksini etkileşimlerini karakterize ile göstermek ki, SSLBs çok tip seri biriktirme ile tek bir dizi yerleştirilebilir ve bu diziler tespiti için de kullanılabilir. Ayrıca, hücresel kaynaklardan elde edilen boncuk destek ve biyomembranlarda olmayan fosfolipid vesiküller aynı yöntemle dizilmiş olabilir ve hücreye özel membran lipidleri tespit edilebileceğini göstermektedir.

SiO 2 boncuk fosfolipidler, floresan lipitler ve örneğin gangliosidler gibi diğer lipidler oluşan veziküllerin bir çözeltisi ile karıştırılmaktadır, Şekil 1a&#39;da şematik olarak gösterildiği gibi, veziküller, SSLBs oluşturmak üzere SiO 2 kordon yüzeyleri üzerinde kopma. SSLBs yıkandıktan sonra, SSLB çözeltisinin bir damlası bir mikro dizi yerleştirilir ve boncuklar yüzeyine yerleşmek için izin verilir. (Şekil 1B1), Şekil 1B2 göste...

Watch this Scientific Journal Video about Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method at JoVE.com

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır ve doğal zar parçacıkları hücre zarlarının özelliklerini yaklaşık ve analitik çeşitli stratejiler dahil edilmesi uygun sistemlerdir. Burada destekli lipid iki katmanlı kaplı SiO 2 boncuklar, fosfolipid vezikülleri ya da doğal zar parçacıklarının oluşan mikrodizileri hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

formation-biomembrane-microarrays-with-squeegee-based-assembly

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K Görüntüleme.  University of Minnesota.  Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır ve doğal zar parçacıkları hücre zarlarının özelliklerini yaklaşık ve analitik çeşitli stratejiler dahil edilmesi uygun sistemlerdir. Burada destekli lipid iki katmanlı kaplı SiO 2 boncuklar, fosfolipid vezikülleri ya da doğal zar parçacıklarının oluşan mikrodizileri hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir. 

Video: Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a guided material screening approach to identify sol-gel based materials that are suitable for producing three-dimensional protein microarrays. The approach first identifies materials that can be printed as microarrays, narrows down the number of materials by identifying those that are compatible with a given enzyme assay, and then hones in on optimal materials based on retention of maximum enzyme activity. This approach is applied to develop microarrays suitable for two different enzyme assays, one using acetylcholinesterase and the other using a set of four key kinases involved in cancer. In each case, it was possible to produce microarrays that could be used for quantitative small-molecule screening assays and production of dose-dependent inhibitor response curves. Importantly, the ability to screen many materials produced information on the types of materials that best suited both microarray production and retention of enzyme activity. The materials data provide insight into basic material requirements necessary for tailoring optimal, high-density sol-gel derived microarrays.

A guided material screening approach to develop sol-gel derived protein doped microarrays using an emerging pin-printing method of fabrication is described. This methodology is demonstrated through the development of acetylcholinesterase and multikinase microarrays, which are used for cost-effective small-molecule screening.

Kantitatif Sol-jel Türetilmiş Protein Mikroarray&#39;ler geliştirilmesi için Rehberli Malzeme Tarama Yaklaşım

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Kimya

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Biyomühendislik

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Üç boyutlu Hücre ekimi için Chip-ölçekli Yapı iskeleleri mikroimalat

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Biyoloji

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

Sıralı Capillarity destekli Montaj yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Deseni

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

Mühendislik

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Biyokimya

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Ölçeklenebilir gerilebilir, Çift kanal, mikrosıvısal Organ cips imalatı

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray'ler oluşumu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kantitatif Sol-jel Türetilmiş Protein Mikroarray'ler geliştirilmesi için Rehberli Malzeme Tarama Yaklaşım

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray'ler