Bu yöntem, HIV provirüslerinin ve farklı hücre tiplerinin genetik bileşiminin belirlenmesi gibi HIV alanındaki temel soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Özellikle genetik olarak bozulmamış ve potansiyel olarak çoğaltma yetkin olanların belirlenmesi. Bu tekniğin en önemli avantajları bize tek HIV enfekte hücrelerden tam uzunlukta HIV provirüsler yakın yükseltmek ve daha sonra yeni nesil sıralama bu dizi sağlar.
Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tüm arabellekleri hazırlayın. Bir hücre peleti edinin ve milyon hücre başına 100 mikrolitre lysis tampon ekleyin. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın.
Hücreleri bir saat boyunca 55 santigrat derecede bir termal döngüde kuluçkaya yatırArak ve sonra 15 dakika boyunca 85 santigrat derece ekleyerek lyse. Tek HIV-1 DNA provirüsleri yükseltmek başlamak için metin protokolü tablo birinde listelenen ilk tur PCR için reaktifler karıştırın. 96 kuyu PCR plakasında 85 kuyuya 38 mikrolitre ekleyin ve bu plakayı PCR 1 olarak etiketlayın.
Bundan sonra, PCR 1 plakasını genomik DNA ilavesi için belirlenen açık bir alana taşıyın. Tris hidroklorür kullanarak genomik DNA'yı 1'den 3'e 1'den 81'e kadar bir oranda seyrelterek her seyreltmenin 45 mikrolitresini hazırlayın. Her numuneye iki mikrolitre seyreltilmiş genomik DNA ve her negatif kontrol kuyusu için iki mikrolitre tris hidroklorür ekleyin.
Pozitif kontrol kuyusu dışında tüm plakayı kapatın. Daha sonra, pozitif kontrolün eklenmesi için belirlenmiş bir alana geçin. İlgili kuyuya pozitif kontrol iki mikrolitre ekleyin ve sonra tamamen plaka mühür.
PrC 1 plakasını kısa bir süre döndürmek ve kuyuların kenarlarından kalan tüm içerikleri aşağı çekmek için bir PCR plaka spinner kullanın. METIN protokolünde belirtildiği gibi, PCR 1 plakasını termal döngüde çalıştırın. Daha sonra, birinci tabloda listelenen ikinci pcr turu için reaktifleri karıştırın.
Yeni bir 96 iyi PCR plaka 85 kuyubu PCR 2 karışımı 28 mikrolitre ekleyin. Bu plakayı PCR 2 olarak etiketlayın. Bir plaka spinner kullanarak, kısaca kuyuların kenarlarından herhangi bir kalıntı içeriği aşağı çekmek için PCR 1 plaka spin.
Bu plakanın her kuyusu için tris hidroklorür 80 mikrolitre ekleyin. Bundan sonra, PCR 1 plakasının her kuyudan PCR 2 plakalı ilgili kuyulara iki mikrolitre aktarmak için mutli kanallı pipet kullanın. PCR 2 plakasını açık yapışkan lı sargı ile kapatın.
PcR 2 plakasını plaka spinner'ında kısaca döndürün. Bu arada, eksi 20 santigrat derece uzun süreli depolama için bir ısı sızdırmazlık filmi ile PCR 1 plaka mühür. PCR 2 plakasını metin protokolünde belirtildiği gibi bir termal döngüde çalıştırın.
Sonra kısaca kuyuların kenarlarından herhangi bir kalıntı içeriği aşağı çekmek için PCR 2 plaka spin. Çok kanallı pipet kullanarak, her kuyuya 60 mikrolitre tris hidroklorür ekleyin. Daha sonra, iki 48 iyi prekast yüzde bir eterlik bromür içeren agarose jeller üzerinde her kuyunun 15 mikrolitre çalıştırın.
Güçlendirilmiş ürünü ve yaklaşık boyutlarını içeren kuyuları belirleyin ve jel görüntüsünü kaydedin. Bundan sonra, kuyuların en fazla yüzde 30'unun güçlendirilmiş ürün için pozitif olmadığı seyreltme belirleyin. İlk olarak, PCR 2 plakayı kısa bir süre döndürmek ve kuyuların kenarlarından kalan tüm içerikleri aşağı çekmek için bir plaka döndürücü kullanın.
Güçlendirilmiş ürün içeren kuyulardan 40 mikrolitreyi yeni bir 96 kuyu midi plakanın ilgili kuyularına aktarın. Daha sonra, manyetik boncukları oda sıcaklığına getirmeyi ve yüzde 80 etanoliçeren taze bir çözüm hazırlamayı sağlayacak manyetik yem bazlı bir arınma kiti hazırlayın. Boncuklar oda sıcaklığına ulaştıktan sonra iyice askıya alındıklarından emin olmak için onları.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, midi plakaher kuyuda amplifiye ürün 40 mikrolitre boncuk 40 mikrolitre ekleyin. 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak karıştırın. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.
Sonra, bir manyetik stand için plaka aktarın ve iki dakika dinlenmeye bırakın. Bundan sonra, kaldırmak ve supernatant atın. Plaka hala standında, her kuyuya yüzde 80 etanol çözeltisi iki yüz mikrolitre ekleyerek boncukyı yıkayın.
30 saniye boyunca oda sıcaklığında kuluçka ve sonra kaldırmak ve supernatant atın. Bu yıkama işlemini etanol eklemekten supernatant'ı atmaya kadar bir kez tekrarlayın. Çok kanallı pipet kullanarak herhangi bir aşırı etanol kaldırın.
Boncuklar 15 dakika kurusun. Bundan sonra, plakayı standdan çıkarın. Her kuyuya 30 mikrolitre elütion tamponu ekleyin ve 10 kez hafifçe borulandırarak karıştırın.
İki dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Plakayı manyetik standa geri yerleştirin ve iki dakika dinlendirin. Çok kanallı pipet kullanarak, 25 mikrolitre süpernatantı yeni bir 96 kuyu PCR plakanın ilgili kuyularına aktarın.
Ardından, her güçlendirilmiş DNA ürününün yaklaşık konsantrasyonunun belirlenmesi ve kaydedilmesi için bir spektrum fotometre kullanın. Bir çift iplikli DNA sayısallaştırma kiti ayarlayın ve steril DNA'sız suda bir kez tampon seyreltin. Düz bir alt doku kültür plakası boş kuyuların uygun sayıda tampon 99 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra, üç boş kuyuya yüz mikrolitre arabellek ekleyin. Ölçülecek her güçlendirilmiş ürün için her kuyu içeren tampon için triplicate saflaştırılmış DNA bir mikrolitre ekleyin. Seyreltik lambda çift iplikçikli DNA 10 mikrolitre başına iki nanogram dan sıfır nanogram mikrolitre başına standartları hazırlamak için.
Üç kuyuya her çift iplikçikli DNA standardının yüz mikrolitresini ekleyin. Floresan boyayı tamponla 1-200 arasında seyreltin. Hızlı bir şekilde bir örnek, boş veya standart içeren her kuyuya yüz mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı boru ile karıştırın.
Bundan sonra, ışık ile temas önlemek için folyo ile plaka kapağı. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, floresan emisyon kaydedin. Her örnekte çift iplikçikli DNA konsantrasyonu belirlemek için kaydedilen ölçümleri kullanın.
Daha sonra her saflaştırılmış ürünü suyla seyreltin ve mikrolitre başına 2 nanogram sıfır noktası konsantrasyonuna kadar seyreltin. İç içe PCR'yi takiben, güçlendirilmiş ürünler yüzde bir agarose jel üzerinde çalıştırılır. PCR'nin ilk kalitesi kontroller incelenmekle belirlenebilir.
Güçlendirilmiş ürün içeren negatif kontroller kontaminasyonu ve güçlendirilmiş ürün içermeyen pozitif kontroller yetersiz amplifikasyonu gösterir. Sadece tek amplifiye provirüsler içeren son noktada seyreltme çalışan kuyular sıralama için kabul edilir. Bu aşamada farklı uzunluklarda birden fazla güçlendirilmiş provirüs içeren kuyular görselleştirilebilse de, sıralama için seçilmemelidir.
De novo montajı için, biraraya getirilen kontiglerin kalitesi yeterli derinlik ve eşitlik için değerlendirilebilir. Karışık popülasyonlar da düzensiz kapsama varlığı ile bu aşamada tespit edilebilir. Bir katılımcıdan izole edilen dizilerin görsel gösterimi, dizilerinin yüzde 97'sinin kusurlu olduğunu gösterir.
Efektör ve geçiş belleğinde bulunan bozulmamış diziler ile CD4 pozitif T hücreleri. Bu prosedürü denerken, sadece limitli seyreltme de elde edilen güçlendirilmiş ürünlerin, yani kuyuların en fazla yüzde 30'unun pozitif olduğu, tek bir provirüs içerdiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, güçlendirilmiş ürünler HIV provirüslerin genetik bileşimibelirlemek için sıralanabilir.
Bu teknik, gelişiminden sonra, HIV alanında araştırmacılar ın genetik olarak bozulmamış HIV provirüslerinin ve tedavi gören hastalardaki farklı hücre tiplerinin dağılımını keşfetmelerinin ve genetik olarak bozulmamış ve potansiyel olarak replikasyona uygun provirüslerin nerede saklandığını belirlemelerinin önünü açmıştır. HIV enfekte hücrelerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve uygun kişisel koruyucu ekipman takmak ve sertifikalı bir laboratuvarda çalışmak gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.
