Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ВИЧ, такие как определение генетического состава провирусов ВИЧ и различных типов клеток. Особенно выявления тех, которые генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентным. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет нам усилить почти всю длину ВИЧ-провирусов из одиночных ВИЧ-инфицированных клеток, а затем последовательности их следующего поколения секвенирования.
Для начала подготовьте все буферы, изложенные в текстовом протоколе. Получить клеточные гранулы и добавить сто микролитров буфера лиза на миллион клеток. Смешайте по трубе вверх и вниз.
Lyse клетки путем инкубации в тепловой циклер при 55 градусов по Цельсию в течение одного часа, а затем добавить 85 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Чтобы начать усиливать одиночные провирусы ДНК ВИЧ-1, смешайте реагенты для первого раунда ПЦР, перечисленных в таблице одного из текстовых протоколов. Добавьте 38 микролитров к 85 скважинам в 96 хорошо ПЦР пластины и этикетки этой пластины, как ПЦР 1.
После этого перемести пластину ПЦР-1 в четкую область, предназначенную для добавления геномной ДНК. Использование трис-гидрохлорида последовательно разбавляет геномную ДНК из соотношения один к трем в соотношении от одного до 81, убедившись, что подготовить 45 микролитров каждого разбавления. Добавьте два микролитров разбавленной геномной ДНК к каждому образцу хорошо и два микролитера трис гидрохлорида к каждому отрицательному контролю хорошо.
Печать всей пластины, за исключением положительного контроля хорошо. Затем переместись в область, предназначенную для добавления положительного контроля. Добавьте два микролитров положительного контроля в соответствующий колодец, а затем полностью запечатайте пластину.
Используйте спиннер пластины PCR, чтобы кратко вращать пластину PRC 1 и стягивать любое остаточное содержимое со стороны скважин. Запустите пластину PCR 1 в тепловом циклере, как указано в текстовом протоколе. Затем смешайте реагенты для второго раунда ПЦР, перечисленных в таблице 1.
Добавьте 28 микролитров этой смеси PCR 2 к 85 скважинам новой пластины ПЦР 96 скважин. Пометить эту пластину как PCR 2. Используя спиннер пластины, кратко спина ПЦР 1 пластины, чтобы вытащить любое остаточное содержимое со стороны скважин.
Добавьте 80 микролитров трис-гидрохлорида к каждой пластине. После этого используйте трубу из мутли-канала для переноса двух микролитров с каждой скважины ПЦР-1 в соответствующие скважины в пластине ПЦР-2. Печать пластины PCR 2 с четким клейкой пленкой.
Кратко закрутить пластину PCR 2 в пластине спиннера. Между тем, печать ПЦР 1 пластины с тепловой герметизации пленки для долгосрочного хранения при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Запустите пластину PCR 2 в тепловом циклере, как указано в текстовом протоколе.
Затем кратко спина ПЦР 2 пластины стащить любое остаточное содержимое со стороны скважин. Используя многоканарный пипетку, добавьте 60 микролитров трис-гидрохлорида к каждой колодец. Далее, запустить 15 микролитров каждой хорошо на двух 48 хорошо precast один процент агарозы гели, которые содержат бромид этидия.
Определите скважины, содержащие усиленный продукт и их приблизительные размеры, и сохраните изображение геля. После этого определите разбавление, при котором не более 30 процентов скважин являются положительными для усиленного продукта. Во-первых, используйте спиннер пластины, чтобы кратко вращать пластину PCR 2 и стягивать любое остаточное содержимое со стороны скважин.
Перенесите 40 микролитров из скважин, содержащих усиленный продукт, в соответствующие скважины новой пластины миди на 96 скважин. Далее, изготовить магнитный корм на основе очистки комплект убедившись, чтобы довести магнитные бусы до комнатной температуры и подготовить свежий раствор 80 процентов этанола. Как только шарики достигают вихря комнатной температуры их для того чтобы обеспечить что они тщательно resuspended.
Используя многоканарновую пипетку, добавьте 40 микролитров бисера в 40 микролитров усиленного продукта в каждом колодец миди пластины. Смешайте слегка трубы вверх и вниз 10 раз. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем перенесите пластину на магнитную подстоять и дайте ей отдохнуть в течение двух минут. После этого удалите и отбросьте супернатант. С пластины еще на стенде, мыть бисер, добавив двести микролитров 80 процентов этанола раствор для каждой хорошо.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 секунд, а затем удалить и отказаться от супернатанта. Повторите этот процесс мытья один раз от добавления этанола к отказу от супернатанта. С помощью многоканаловой пипетки удалите излишки этанола.
Дайте бисеру высохнуть в течение 15 минут. После этого снимите тарелку с стенда. Добавьте 30 микролитров буфера elution к каждой хорошо и смешайте путем нежно pipetting вверх и вниз 10 времен.
Инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут. Поместите пластину обратно на магнитную подстоять и дайте ему отдохнуть в течение двух минут. Используя многоканарный пипетку, перенесите 25 микролитров супернатанта в соответствующие скважины новой 96-й скважины ПЦР.
Далее используйте спектральный фотометр для определения и записи приблизительной концентрации каждого усиленного продукта ДНК. Установите двойной мель ДНК количественного комплекта и разбавить буфер до одного раза в стерильной ДНК-свободной воды. Добавьте 99 микролитров буфера к соответствующему количеству пустых колодцев в плоской плите культуры нижней ткани.
Затем добавьте сто микролитров буфера в три пустые скважины. Для каждого усиленного продукта, который будет измеряться добавить один микролитер очищенной ДНК в тройной к каждому хорошо содержащие буфер. Разбавить лямбду двойной мель ДНК 10 раз от двух нанограмм на микролитер до точки нулевой ноль нанограмм на микролитер для подготовки стандартов.
Добавьте сто микролитров каждого двойного стандарта ДНК к трем скважинам. Разбавить флуоресцентный краситель от одной до двухсот с буфером. Быстро добавьте сто микролитров к каждой хорошо, которая содержит образец, пустой или стандартный и перемешать путем трубопроводов вверх и вниз.
После этого накройте пластину фольгой, чтобы избежать контакта со светом. Используя считыватель микроплатформ, замечт выбросы флорескции. Используйте записанные измерения для определения концентрации двойной мель ДНК в каждом образце.
Затем разбавить каждый очищенный продукт водой до концентрации нулевой точки два нанограмма на микролитер. После вложенных ПЦР, усиленные продукты работают на один процент агарозного геля. Начальное качество ПЦР можно определить путем проверки элементов управления.
Поскольку отрицательный контроль, содержащий усиленный продукт, указывает на загрязнение, а положительный контроль без усиления продукта указывает на недостаточное усиление. Только скважины работают в конце точки разбавления, которые содержат одиночные усиленные провирусы рассматриваются для последовательности. Хотя скважины, содержащие несколько усиленных провирусов различной длины, могут быть визуализированы на данном этапе, они не должны быть выбраны для секвенирования.
Для сборки de novo качество собранных контигов можно оценить по достаточной глубине и равномерности покрытия. Смешанные группы населения также могут быть определены на данном этапе наличием неравномерного охвата. Визуальное представление последовательностей, изолированных от одного участника, показывает, что 97 процентов их последовательностей являются дефектными.
С нетронутыми последовательностями, найденными в effector и переходной памяти CD4 положительные Т-клетки. При попытке этой процедуры важно помнить, что только усиленные продукты, полученные при ограничении разбавления, то есть там, где не более 30 процентов скважин являются положительными, содержат один провирус. После этой процедуры усиленные продукты могут быть секвенированы для определения генетического состава ВИЧ-провирусов.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области ВИЧ, чтобы изучить распределение генетически нетронутыми ВИЧ-провирусов и различных типов клеток у пациентов на терапии, чтобы определить, где генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентных провирусов скрыть. Не забывайте, что работа с ВИЧ-инфицированными клетками может быть опасной и такие меры предосторожности, как ношение соответствующего средства индивидуальной защиты и работа в сертифицированной лаборатории, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.
