Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del VIH, como determinar la composición genética de los provirus del VIH y los diferentes tipos de células. Identificar especialmente aquellos que están genéticamente intactos y potencialmente competentes para la replicación. Las principales ventajas de esta técnica es que nos permite amplificar casi los provirus del VIH de longitud completa de células infectadas por el VIH únicas y luego secuenciarlos por secuenciación de próxima generación.
Para comenzar, prepare todos los búferes como se describe en el protocolo de texto. Obtener un pellet celular y añadir cien microlitros de tampón de lysis por millón de células. Mezclar en pipeteando arriba y abajo.
Lyse las células incubando en un ciclor térmico a 55 grados centígrados durante una hora y luego agregue 85 grados centígrados durante 15 minutos. Para comenzar a amplificar los provirus de ADN VIH-1 individuales, mezcle los reactivos para la primera PCR redonda, tal como se indica en la tabla uno del protocolo de texto. Agregue 38 microlitros a 85 pozos en una placa PCR de 96 pozos y etiquete esta placa como PCR 1.
Después de esto, mueva la placa PCR 1 a un área clara designada para la adición de ADN genómico. El uso de clorhidrato de tris diluye en serie el ADN genómico de una relación de uno a tres a una relación de uno a 81 asegurándose de preparar 45 microlitros de cada dilución. Añadir dos microlitros de ADN genómico diluido a cada pozo de muestra y dos microlitros de clorhidrato de tris a cada pozo de control negativo.
Selle toda la placa excepto el pozo de control positivo. A continuación, vaya a un área designada para la adición del control positivo. Añadir dos microlitros del control positivo al pozo correspondiente y luego sellar la placa por completo.
Utilice un spinner de placa PCR para girar brevemente la placa PRC 1 y tire hacia abajo de cualquier contenido residual de los lados de los pozos. Ejecute la placa PCR 1 en el ciclor térmico como se describe en el protocolo de texto. A continuación, mezcle los reactivos para la segunda ronda de PCR como se indica en la tabla uno.
Añadir 28 microlitros de esta mezcla PCR 2 a 85 pozos de una nueva placa PCR de 96 pozos. Etiquete esta placa como PCR 2. Usando un spinner de placa, gire brevemente la placa PCR 1 para tirar hacia abajo cualquier contenido residual de los lados de los pozos.
Añadir 80 microlitros de clorhidrato de tris a cada pozo de esta placa. Después de esto, utilice una pipeta de canal mutli para transferir dos microlitros de cada pozo de la placa PCR 1 a los pozos correspondientes en la placa PCR 2. Selle la placa PCR 2 con una envoltura adhesiva transparente.
Gire brevemente la placa PCR 2 en el hilandero de la placa. Mientras tanto, selle la placa PCR 1 con una película de sellado térmico para un almacenamiento a largo plazo a menos 20 grados centígrados. Ejecute la placa PCR 2 en un ciclor térmico como se describe en el protocolo de texto.
A continuación, gire brevemente la placa PCR 2 para tirar hacia abajo cualquier contenido residual de los lados de los pozos. Con una pipeta multicanal, añada 60 microlitros de clorhidrato de tris a cada pozo. A continuación, ejecute 15 microlitros de cada pozo en dos geles de agarosa prefabricados de 48 pozos al por ciento que contienen bromuro de etidio.
Identifique los pozos que contienen el producto amplificado y sus tamaños aproximados y guarde la imagen del gel. Después de esto, determinar la dilución en la que no más del 30 por ciento de los pozos son positivos para el producto amplificado. En primer lugar, utilice un spinner de placa para girar brevemente la placa PCR 2 y tire hacia abajo cualquier contenido residual de los lados de los pozos.
Transfiera 40 microlitros de los pozos que contienen el producto amplificado a los pozos correspondientes de una nueva placa midi de 96 pozos. A continuación, establezca un kit de purificación basado en la alimentación magnética asegurándose de llevar las perlas magnéticas a temperatura ambiente y preparar una solución fresca de 80 por ciento de etanol. Una vez que las perlas alcanzan el vórtice de temperatura ambiente para asegurarse de que se resuspenden a fondo.
Usando una pipeta multicanal, agregue 40 microlitros de cuentas a los 40 microlitros de producto amplificado en cada pozo de la placa midi. Mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Luego, transfiera la placa a un soporte magnético y déjela reposar durante dos minutos. Después de esto, retire y deseche el sobrenadante. Con la placa todavía en el soporte, lave las perlas añadiendo doscientas microlitros de la solución de etanol al 80 por ciento a cada pozo.
Incubar a temperatura ambiente durante 30 segundos y luego retirar y desechar el sobrenadante. Repita este proceso de lavado una vez desde la adición del etanol hasta el descarte del sobrenadante. El uso de una pipeta multicanal elimina cualquier exceso de etanol.
Deje que las cuentas se sequen al aire durante 15 minutos. Después de esto, retire la placa del soporte. Agregue 30 microlitros de tampón de elución a cada pocótelo y mezcle en pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
Incubar a temperatura ambiente durante dos minutos. Vuelva a colocar la placa sobre el soporte magnético y déjela reposar durante dos minutos. Usando una pipeta multicanal, transfiera 25 microlitros del sobrenadante a los pozos correspondientes de una nueva placa PCR de 96 pozos.
A continuación, utilice un fotómetro de espectro para determinar y registrar la concentración aproximada de cada producto de ADN amplificado. Establezca un kit de cuantificación de ADN de doble cadena y diluya el tampón a una vez en agua estéril libre de ADN. Agregue 99 microlitros del tampón a un número adecuado de pozos vacíos en una placa de cultivo de tejido inferior plano.
A continuación, agregue cien microlitros de tampón a tres pozos en blanco. Para cada producto amplificado a medir añadir un microlitro de ADN purificado en triplicado a cada tampón que contiene el pozo. Diluir el ADN de doble cadena lambda 10 veces de dos nanogramos por microlitro a apuntar nanogramos cero cero por microlitro para preparar los estándares.
Agregue cien microlitros de cada estándar de ADN de doble cadena a tres pozos. Diluir el tinte de florescencia de uno a doscientos con tampón. Agregue rápidamente cien microlitros a cada pozo que contenga una muestra, en blanco o estándar y mezcle en pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Después de esto, cubra la placa con papel de aluminio para evitar el contacto con la luz. Usando un lector de microplacas, registre la emisión de florescencia. Utilice las mediciones registradas para determinar la concentración de ADN de doble cadena en cada muestra.
A continuación, diluir cada producto purificado con agua a una concentración de punto cero dos nanogramos por microlitro. Después de la PCR anidada, los productos amplificados se ejecutan en un gel de agarosa del uno por ciento. La calidad inicial del PCR se puede determinar inspeccionando los controles.
Como los controles negativos que contienen productos amplificados indican contaminación y los controles positivos sin producto amplificado indican amplificación insuficiente. Sólo los pozos se ejecutan en la dilución del punto final que contienen provirus amplificados únicos se consideran para la secuenciación. Mientras que los pozos que contienen múltiples provirus amplificados de diferentes longitudes se pueden visualizar en esta etapa, no deben ser seleccionados para la secuenciación.
Para el montaje de novo, la calidad de los contigs ensamblados se puede evaluar para obtener suficiente profundidad y uniformeidad de cobertura. Las poblaciones mixtas también pueden ser identificadas en esta etapa por la presencia de una cobertura desigual. La representación visual de las secuencias aisladas de un participante revela que el 97 por ciento de sus secuencias son defectuosas.
Con secuencias intactas encontradas en el efector y memoria de transición CD4 células T positivas. Al intentar este procedimiento es importante recordar que sólo los productos amplificados obtenidos en la dilución limitante, es donde no más del 30 por ciento de los pozos son positivos, contienen un solo provirus. Después de este procedimiento, los productos amplificados se pueden secuenciar para determinar la composición genética de los provirus del VIH.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del VIH exploraran la distribución de provirus del VIH genéticamente intactos y diferentes tipos de células en los pacientes en la terapia para determinar dónde se esconden los provirus competentes genéticamente intactos y potencialmente replicados. No olvide que trabajar con células infectadas por el VIH puede ser peligroso y que las precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado y trabajar con un laboratorio certificado, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
