Ters transkripsiyon analiz etmek için bu yeni yöntem bize retro viroloji alanı hakkında yeni şeyler söyleyebilir. Örneğin, hücresel kısıtlama faktörlerinin nasıl çalıştığı veya antiretroviral ilaçların HIV1 DNA sentezini nasıl engellenebildiği hakkında bilgi edinebiliriz. Bu tekniğin en büyük avantajı, sadece Nascent Reverse Tran scrips dizisi hakkında bilgi sağlamaz, aynı zamanda tek bir nükleer sıkı çözünürlükte onların hassas 3-prime DNA termini haritalama sağlar.
HIV1 enfekte hücrelerin toptan DNA HIV1 ücretsiz DNA zenginleştirme, hibrid yakalama tarafından yapılır ve bir PCR iş istasyonunda yapılmalıdır. Tek bir mikro santrifüj tüp içine örnek başına boncuk yüz mikrolitre başlığı boru ile manyetik streptavidin boncuk ana karışımı hazırlayın mikro santrifüj tüpler için uygun bir mıknatıs üzerine tüp yerleştirin. Boncuklar tüpün mıknatıs tarafına doğru yerleştikten sonra, depolama tamponu çıkarın, mıknatıstan tüp kaldırmak ve binktent yıkama veya BW tampon beş yüz mikrolitre boncuk askıya.
Tüpü mıknatısın üzerine geri yerleştirin, boncukların mıknatısa geçmesini bekleyin ve süpernatantı çıkarın. Mıknatıstan tüp çıkarın, kazein çözeltisi beş yüz mikrolitre ekleyin, boncuk lar askıya tekrar, ve on dakika oda sıcaklığında kuluçka. On dakika sonra, BW tampon ile boncuk yıkayın.
Tüpü mıknatısın üzerine geri yerleştirin, süpernatant'ı çıkarın ve boncukları 500 mikrolitre BW tamponunda yeniden askıya alın. Her yakalanan biyotinylated oligonükleotid örnek başına elli picomoles ekleyin. Otuz dakika boyunca uç mikser üzerinde bir ucunda sallanan ise oda sıcaklığında kuluçka.
Sonra, mıknatıs için tüp dönmek, supernatant kaldırmak, mıknatıs tüp kaldırmak, 1x on tampon beş yüz mikrolitre ekleyin ve boncuk askıya. İkinci yıkama dan sonra tekrar örnek başına 1x on tampon on mikrolitre immobilize oligonükleotidler ile boncuk askıya. Her örnek için, bir mikrosetrofuge tüp etiket ve boncuk süspansiyon on mikrolitre ekleyin, DNA yüz yetmiş mikrolitre, ve 3x on tampon doksan mikrolitre.
DNA'yı doğadan arındırmak için 92 derece lik kuru bir ısı bloğunda iki dakika kuluçkaya yatın. Tüpleri elli iki santigrat dereceye ayarlanmış farklı bir kuru ısı bloğuna taşıyın ve bir saat kuluçkaya yatırın. Bu kuluçka sırasında her on dakikada bir, tüpleri karıştırmak için ters çevirin.
Bir saatlik kuluçka süresi bittiğinde, boncukları bir kez 1x ten tamponunun beş yüz mikrolitresi ile yıkayın ve otuz beş mikrolitre nükleaz içermeyen su yla tekrar askıya alın. Herhangi bir sıvı çıkarmadan önce yaklaşık üç dakika boyunca mıknatıs tüpler bırakarak boncuk iyi yerleşmek emin olun. Eforlamak için, tüpleri 92 santigrat derecede kuru bir ısı bloğunda iki dakika kuluçkaya yatırın.
Sonra, hızlı bir şekilde mıknatıs üzerine tüpleri hareket ettirin, bir seferde bir tüp. Boncuklar tüpün kenarına bağlandıktan sonra, HIV1 DNA'sını içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Bu prosedüre başlamak için, nükleaz içermeyen su ve girdap tüp yüz mikromolar de lyophilized adaptör askıya yeniden.
Örnek başına, artı bir kontrol örneği, 10x T4 DNA ligaz tampon sıfır noktası dört beş mikrolitre, adaptör dört mikrolitre ve nükleaz içermeyen su noktası sıfır beş mikrolitre birleştirir. Isı doksan iki derece santigrat iki dakika için, ve sonra yavaş yavaş bir PCR makinede on altı derece santigrat kadar soğumasını bekleyin. Bu adaptör bir saç iğnesi yapısı oluşturmak için izin verecektir.
Bu işlemin en önemli adımı, 3-prime DNA termini açmak için uyarlanmış moleküllerin verimli ve tarafsız ligasyonudur. Farklı uzunlukta saflaştırılmış yeni doğan cDNA molekülleri T4 DNA ligaz kullanılarak bir saç tokası tek telli DNA adaptörü ne bağlı. Adaptör, eşitlemayı kolaylaştıran rastgele altı nükleotit barkod dizisi taşır ve aynı anda benzersiz okumalar için tanımlayıcı görevi görehizmet eder.
3-prime termini adaptörü kendi kendine ligasyon önlemek için bir spacer taşır. Altmış mikrolitre son hacim ligasyon reaksiyonları kurmak için, her PCR tüpüne aşağıdakileri ekleyin: 10x T4 DNA ligaz tamponunun altı mikrolitresi, yüzde kırk PEG'in yirmi dört mikrolitresi, beş molar Betainin altı mikrolitresi, dört nokta beş mikrolitre adaptör, T4 DNA ligazının bir nokta iki mikrolitresi ve DNA'nın on sekiz noktalı mikrolitresi. Reaksiyonları iyice karıştırdıktan sonra, bir PCR makinesinde bir gecede on altı santigrat derecede kuluçkaya yat.
Adaptör ligasyonundan sonraki gün, her ligasyon reaksiyonuna DNA jeli yükleme tamponu içeren otuz mikrolitre formamid ve boru başlığı ile iyice karıştırın. Bir PCR makinede Iki dakika boyunca doksan dört derece santigrat ısı sonra hemen buz koymak. Bir sonraki adım jel elektroforez denatüre hazırlanmaktır.
Uygun bir jel tankında üre poliakrilamid jel denaturing bir ön döküm yüzde altı TBE yerleştirin ve 1x TBE çalışan tampon ekleyin. Önceden yirmi dakika boyunca jel çalıştırın. Sonra, çalışan tampon ile jel cepleri yıkamak için bir şırınga ve yirmi bir gauge iğne kullanın.
Daha sonra aynı numunenin kuyu başına otuz mikrolitresini üç kuyuya yükleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için jel başına sadece bir numune çalıştırılması tavsiye edilir. Yirmi dakika koş.
Jel çalışırken, alt delik poke için yirmi bir gauge şırınga iğne kullanarak örnek başına üç sıfır noktası beş mililitre mikrosantrifüj tüpler ilerler. Hazırlanan tüplerin her birini iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne takın ve örnek adı artı düşük, orta veya yüksek olarak etiketleyin. Koyu mavi boya ön jel ile yaklaşık yarım olduğunda, elektroforez durdurmak ve jel kaset çıkarın.
Kaseti açın ve jeli jiletle dikey olarak kesin. Cömertçe yüklü örnekleri üç kuyu ile şerit çıkarmak için. 1x TBE ve siyanür nükleik asit leke beş mikrolitre ve üç ila beş dakika kuluçka ile bir kap jel şerit ekleyin.
Daha sonra çıkarılacak olan serbest adaptörün üst kısmını kolayca belirlemek için boyamanın yeterli olduğundan emin olun. Daha sonra, mavi ışık transilluminator yüzeyini tamamen distile de iyonize su ile temizleyin. Sonra boyama kabından jel parçası almak ve ışık kutusuna yerleştirin.
Işık kutusunu açın ve turuncu filtre ile lekeli nükleik asitleri inceleyin. Lekeli jel üzerinde temsili bir ligated DNA örneği, burada gösterilir. Adaptör genellikle aşırı yüklü görünür ve bir çizgi olarak yukarıda çalışan ligated HIV1 DNA ile büyük bir blob olarak çalışır.
Kırmızı çizgiler jel serbest adaptör kaldırmak için kesilecek siteleri gösterir ve üç eşit parçaya örnek bölmek. Yeni bir jilet kullanarak, jelin kenarlarını kesin. Daha sonra, adaptör ve alt jel parçaları kaldırmak için adaptörün hemen üzerinde kesin.
Son olarak, genellikle yüksek molekül ağırlıklı DNA keskin bir yoğun sinyal var jel cepleri yaklaşık bir milimetre de dahil olmak üzere jel çok üst kesip. Kalan jel parçasını yatay olarak içeren üç eşit parçaya bölün. Düşük, orta ve yüksek molekül ağırlıklı alanlar.
Daha sonra, iki milimetre parçalar halinde iki üç jel parçalarıher kesilmiş ve hazırlanan sıfır noktası beş mililitre mikrosantrifüj tüpler içine aktarın. Bir dakika boyunca açık kapaklarla en yüksek hızda döndürün. Bir jel slush oluşturmak için iki mililitrelik tüp içine delik jel parçaları sıkmak için.
Herhangi bir jel parçacıkları sıfır noktası beş mililitrelik tüp altında kalırsa, elle bir iğne kullanarak iki mililitretüp aktarın. Her mikrosantrifüj tüp jel slush bir mililitre üre jel ekstraksiyon tampon ekleyerek DNA çıkarma prosedürü başlayın. Tüpleri son mikser üzerinde, oda sıcaklığında en az üç saat döndürün.
Filtre sütunlarını hazırlayın. Membran tıkanmasını önleyen selüloz asetat membran filtreli her santrifüj sütununa küçük yuvarlak cam elyaf filtresi eklemek için temiz bir cımbız seti kullanın. Filtreyi ters boru kafası ucuyla yerleştirin.
Kısaca jel slush ve ekstraksiyon tampon ile iki mililitre tüpler imal mikrocentrifuge, ve hazırlanan filtre sütunları için supernatant yedi yüz mikrolitre aktarın. Filtre sütunlarını bir dakika boyunca en yüksek hızda mikrosantrifüj de santrifüj edin. Sonra yeni bir iki mililitre mikrosantrifüj tüp yoluyla akış aktarın.
Kalan supernatant ile sütunları yeniden yükleyin. Ekstraksiyon çamur mümkün olduğunca çok sıvı elde etmeye çalışın ve jel parçaları dahil olup olmadığını endişelenmeyin. Tekrar dön.
Aynı çıkarma örneklerinin akışını birleştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi ilerleyin. Bu protokol, antiretroviral insan proteini A3G'nin yokluğunda veya varlığında Vif eksikliği OLAN HIV-1 ile enfekte olan CEMS-ST hücrelerinden alınan örneklerde kullanılmıştır. Her örnekten elde edilen toplam benzersiz okuma sayısının bir çizimi, artan A3G düzeylerinin toplam okuma sayısını azalttığını gösterir.
A3G'nin ters transkriptaz aracılı cdna sentezi üzerindeki inhibitör etkisini yansıtan. Sonraki üç çizimde, moleküllerin ilk yüz seksen iki nükleotit içindeki her olası uzunluktaki fraksiyonu mavi histogramlarla gösterilir. A3G eklenmesi birkaç çok özel tekrarlanabilir pozisyonlarda kısa kesilmiş cdna moleküllerinin keskin bir artış maliyeti.
Kesikli kırmızı çizgiler, ilgili konumda C'den T mutasyonlarına c taşıyan okuma yüzdelerini gösterir. Pozitif kontrol, sentetik oligonükleotidlerin dizi, uzunluk ve konsantrasyon havuzunun işlenmesiyle üretilebilir. Tüm moleküller sadece küçük varyasyonları ile eşit bolluk yakın görünmelidir.
Bir kitaplık çalışması, sıralamada küçük bir uzunluk önyargısı oluşturuyorsa, boyut yanlılığını temsil eden eğimden türetilen bir normalleştirme faktörü uygulanması tavsiye edilir. Bu prosedür, DNA moleküllerinin üç asal ucunun belirlenmesinin nükleik asit metabolizması ares içine anahtar anlayışlar katacak diğer sistemlere kolayca adapte edilebilir. HIV ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bazı enfeksiyonların sadece belirlenmiş güvenlik laboratuvarlarında yapılması gerektiğini unutmayın.
