Burada açıklanan protokol, 10 kilobayt uzunluğa kadar tek iplikli pozitif RNA viral genomlarının rastgele mutajenize edilmiş tam uzunlukta RNA kütüphanelerinin oluşturulmasına ve istenen deneysel koşullar altında ilgilenilen fenotiplerin seçilmesine izin verir. Bu teknik, klonlamasız bir yaklaşım kullanarak kısa sürede değişen seviyelerde genetik çeşitliliğe sahip tam uzunlukta viral RNA kütüphaneleri oluşturabilir. Teknik, kütüphanelerin sentezi için ucuz ve yaygın olarak bulunan reaktifleri kullanır.
Prosedürü göstermek, Shiv Nadar Üniversitesi Yaşam Bilimleri Bölümü Viroloji Bölümü'nden doktora öğrencisi Shaheen Khan olacak. Başlamak için, metin el yazmasında açıklandığı gibi, pJFH1 şablonu olmadan reaksiyon bileşenleri ile birlikte ileri ve geri primerlerle dört set deney için ana karışımı hazırlayarak ep-PCR gerçekleştirin. Ana karışımı dört tüpe ayırın.
Tek tek tüplere 100 nanogram, 50 nanogram, 25 nanogram ve 10 nanogram şablon ekleyin ve reaksiyonun toplam hacmini 50 mikrolitreye ayarlayın. 97 36 baz çifti parçasını yükseltmek için döngü koşullarını uygulayın. Beş mikrolitre PCR ürünü yükleyerek ve %0.8 TAE bazlı agaroz jel elektroforezi çalıştırarak bilinen miktarları bir kilobaz DNA merdiveni ile karşılaştırarak amplifiye edilmiş ep-PCR ürününü tahmin edin.
Ürünü bir kolon arıtma kiti kullanarak arındırın. 260 nanometrede absorbansı ölçerek saflaştırılmış ürünün konsantrasyonunu tahmin edin. Mikrolitre başına 100 nanograma eşit veya daha büyük bir ürün konsantrasyonu elde etmek için ep-PCR ürününü vakumla konsantre edin.
Bir in vitro RNA sentez reaksiyonu kurun ve inkübasyon için 37 santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra sentezlenen ürünü bir kolon saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Üreticinin tavsiyelerine göre yaklaşık bir mikrogram viral RNA, beş mikromolar ters primer ve 200 birim ters transkriptaz ekleyerek 20 mikrolitrelik bir cDNA sentez reaksiyonu oluşturun.
cDNA'yı kullanarak, metin el yazmasında açıklandığı gibi bir reaksiyon karışımı hazırlayın ve bir amplifikasyon döngüsü çalıştırın. 25 71 baz çiftinin ürün boyutunu doğrulamak için ürünü %0,8 TAE bazlı agaroz jel üzerinde çalıştırın ve ardından daha önce gösterildiği gibi bir kolon saflaştırma kiti kullanarak ürünü saflaştırın. 40 mikrolitre steril suda elute.
Üç asal A çıkıntısı eklemek için, 0.5 mikromolar DATP ve bir birim düşük kaliteli Taq DNA polimeraz ekleyin ve tüm PCR ürününü 1X PCR tamponu ve 1.5 milimolar magnezyum klorür ile birlikte 70 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra bir kolon saflaştırma kiti kullanarak karışımı saflaştırın. Ligasyon reaksiyonunu ayarlayın ve oda sıcaklığında üç saat inkübe edin.
Daha sonra bağlanmış DNA'ya 100 mikrolitre Escherichia coli DH5-Alpha ekleyin ve hücreleri 35 saniye boyunca 42 santigrat derecede ısıtın. Hücre süspansiyonuna bir mililitre LB ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. 13, 800 RCF'de santrifüj.
Süpernatanı atın ve 200 mikrolitre taze LB ortamında yeniden süspanse edin. Mililitre ampisilin başına 50 mikrogram içeren bir LB plakası üzerine dönüştürülmüş E.coli DH5-Alfa hücrelerinin 100 mikrolitresini plakalayın ve 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Mililitre ampisilin başına 50 mikrogram içeren beş mililitre LB ortamında 25 ila 30 koloniden oluşan mini preparatlar hazırlayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün.
Ertesi gün, plazmitleri ticari bir kit ile ekstrakte edin ve tüm koloniler için 200 nanogram izole plazmit, iki birim EcoR1 ve 1X kısıtlama tamponu ile 10 mikrolitre hacimde kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirin. Sindirim karışımlarını 37 santigrat derecede üç saat inkübe ettikten sonra, plazmit DNA eklemesini doğrulamak için ürünleri %0.8 TAE bazlı agaroz jel üzerine yükleyin. Önerilen primerleri kullanarak 25 pozitif klonun plazmitlerinin Sanger dizilimini gerçekleştirin.
Transfeksiyondan bir gün önce, hücreleri bölün ve bir hemositometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın. Daha sonra insan hepatoma 7.5 hücrelerini iki mililitre tam DMEM'de 35 milimetrelik kaplarda tohumlayın ve hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 10 mikrolitre transfeksiyon reaktifini 50 mikrolitre minimal esansiyel ortamda seyrelterek transkript lipid kompleksini hazırlayın ve beş mikrogram viral transkripti 50 mikrolitre minimal esansiyel ortamda ayrı ayrı seyreltin.
Her iki karışımı da oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra bunları tek bir steril mikrosantrifüj tüpünde karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücre inkübasyonundan sonra, kültür ortamını çıkarın, hücreleri önceden ısıtılmış 1X PBS ile iki kez yıkayın ve minimum esansiyel ortamdan 1.5 mililitre ekleyin.
Kompleksi yavaşça ekleyin ve düzgün dağılım için tabağı hafifçe döndürün. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 10 saat inkübe edin. Ardından ortamı çıkarın.
Transfekte edilmiş hücreleri bir mililitre önceden ısıtılmış 1X PBS ile iki kez yıkayın ve iki mililitre tam DMEM ekleyin. Bir viral RNA izolasyon kiti kullanarak viral RNA'yı 140 mikrolitre kültür süpernatantından izole edin. Ticari bir qRT-PCR kiti kullanarak 10 mikrolitrelik bir qRT-PCR reaksiyonu kurun.
HCV RNA kantifikasyonu için ileri ve geri primerleri ve probu kullanın. Reaksiyon döngüsünü 20 dakika boyunca 48 santigrat dereceye, 10 dakika boyunca 95 santigrat dereceye ve 15 saniye boyunca 45 santigrat derece ve bir dakika boyunca 60 santigrat dereceye ayarlayın. Tepkileri çalıştırın ve negatif kontroller ayarlayın.
Paralel olarak, viral RNA'yı ölçmek için HCV transkriptlerinin on kat seri olarak seyreltilmiş bilinen kopya sayısını kullanarak standart bir eğri oluşturun. Üç kopya halinde gerçekleştirin. İnsan hepatomu 7.5 hücrelerini 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve hücreleri, virüsü eklemeden yaklaşık 16 saat önce% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.
Biyogüvenlik Sınıf II kabininde, virüsün on kat seri seyreltmesini gerçekleştirin. Hücreleri enfekte etmek için oyuk başına 100 mikrolitre seyreltilmiş virüs ekleyin ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Üç gün sonra, enfekte olmuş hücreleri 0.1 mililitre PBS ile üç kez yıkayın ve hücreleri 20 dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede 0.1 mililitre buz gibi soğuk metanol ile sabitleyin ve geçirgenleştirin.
Kuyuları 1X PBS ile üç kez ve ardından PBST ile 1X ile yıkayın. PBST'yi çıkardıktan sonra, PBST'de %0,2 yağsız süt içeren 0,1 mililitre %1 BSA ile hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika bloke edin. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve hücrelere beş dakika boyunca 1X PBS'de hazırlanan 0.1 mililitre% 3 hidrojen peroksit uygulayın.
Yine, hücreleri iki kez 1X PBS ve 1X PBST ile yıkayın. Kuyucuk başına 50 mikrolitre anti-NS5A 9E10 monoklonal antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Kuyuları 1X PBS ile üç kez ve PBST ile bir kez yıkayın.
Kuyucuk başına 50 mikrolitre HRP konjuge keçi anti-fare ikincil IgG ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve ardından kuyucukları 0.1 mililitre 1X PBS ile yıkayarak bağlanmamış antikoru çıkarın. 30 mikrolitre DAB ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. DAB çözeltisini çıkarın ve kuyucukları iki kez 1X PBS ile ve bir kez damıtılmış suyla yıkayın.
% 0.03 sodyum azid içeren 100 mikrolitre PBS ekleyin. Her bir kuyuyu 10X objektif kullanarak ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Pozitif kuyuların sayısını sayın.
Kuyuların %50'sini etkileyen uç nokta seyreltmesini tahmin etmek için bir Reed ve Muench hesaplayıcısı kullanın. Bir NS5A inhibitörü olan pibrentasvir'i% 100 DMSO'da bir milimolar konsantrasyona çözün ve tam DMEM'de 10 nanomolar konsantrasyona kadar seyreltin. Daha sonra, 12 saat boyunca hücrelerin% 50'sini enfekte etmek için bir ML50 virüs dozu ile% 70 birleşmede saf Huh-7.5 hücrelerini enfekte edin ve daha sonra enfekte olmuş hücreleri enfeksiyondan 24 saat sonra altı oyuklu plakalara aktarın.
16 saatlik hücre bölünmesinden sonra enfekte olmuş hücrelere 1X EC50 PIB ekleyin. Bunu, her hücre ardışık altı geçiş için bölündükten sonra, ardından üç ilaçsız geçiş döngüsü izledikten sonra yapın ve odak oluşturan bir tahlil kullanarak virüs yayılımını izleyin. Her geçişte viral süpernatanları toplayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
18. günde süpernatanttan viral RNA'yı ve sentezlenen cDNA'yı çıkarın. Beş mikrolitre seyreltilmiş cDNA kullanarak NS5A genini çoğaltın. Daha sonra NS5A dizileme primerlerini kullanarak altı ila sekiz pozitif bakteriyel plazmitte NS5A ilaç direnci mutasyonlarını belirleyin.
Tam genom mutant kütüphaneleri, klonal pJFH1 kullanılarak 100 ila 10 nanogramdan azalan miktarlarda sentezlendi. ep-PCR ürünlerinin ortalama verimleri mikrolitre başına 3.8 ila 12.5 nanogram arasında değişmektedir. Mutant kütüphanelerdeki mutasyonların oranı, ep-PCR reaksiyonunda pJFH1 girişinin azalmasıyla artmıştır.
Şablonun 50 nanogramı kullanılarak sentezlenen ML50, kopyalanan 10.000 baz çifti başına dört ikameye sahipken, 25 nanogram şablon kullanılarak sentezlenen ML25, dokuz ikame barındırıyordu. Klonal pJFH1'de dizilenen nükleotid sayısı içinde hiçbir ikame bulunmadı. ML50 viral varyantları, klonal JFH1 virüsüne kıyasla pibrentasvir'e daha az duyarlıydı.
Sekiz NS5A klonundan dördü D7V+F28C kombinasyonuna sahipken, V8A+F28C ve F36L'nin her biri bir klonda meydana geldi. Bu mutasyonlar, klinik olarak anlamlı NS5A direnç mutasyonlarını barındırdığı bilinen NS5A'nın N terminal bölgesindeydi. ep-PCR'nin her bir bileşeninin nihai konsantrasyonu, özellikle şablon miktarı kritiktir.
KB Extender'ın olmaması, ep-PCR ürününün verimini büyük ölçüde azaltacaktır.
