Farelerde Akut Böbrek Hasarı için Bilateral Renal İskemi-Reperfüzyon Modeli

İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) modeli, akut böbrek hasarı (ABH) gelişiminin farklı aşamalarında, özellikle ABH'den kronik böbrek hastalığına (KBH) ilerlemesi sırasında kullanılabilir. Burada, iskemik yaralanmayı indüklemek için renal pedikülleri vasküler bir klips aracılığıyla klempleyen transabdominal bir yaklaşımla farelerde IRI modeli geliştirme prosedürünü açıklıyoruz.

Akut böbrek hasarı (ABH), böbrek fonksiyonlarında hızlı bir düşüş olarak tanımlanır ve kalıcı böbrek fonksiyon bozukluğu, nefronların geri dönüşümsüz kaybı ve uyumsuz onarımları nedeniyle yavaş yavaş kronik böbrek hastalığına (KBH) ilerler. Son yıllarda, hacim azalması, sepsis, nefrotoksisite, kas yaralanması ve majör travma gibi çeşitli etiyolojilerde ABH insidansı giderek artmakta olup, iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) en sık epizodu oluşturmaktadır. Farelerde IRI modelinin geliştirilmesi, ABH'nin klinik öncesi modelleri için güçlü ve kontrol edilebilir araçlar sağlayan renal pediküllerin cerrahi klemplenmesi ile indüklenir. Daha da önemlisi, IRI modeli, ABH gelişiminin farklı aşamalarında, özellikle AKI'den KBH'ye kadar olan süreçlerde kullanılmaktadır. IRI modelinin birçok laboratuvarda yaygın olarak uygulanmasına rağmen, bir dizi değişken hala bu modelin sonuçlarını etkilemektedir. Burada, araştırmacıların ABH gelişiminde altta yatan patogenezi ve ABH'nin KBH'ye ilerlemesini araştırmaları için tekrarlanabilir ve güvenilir bir yöntem sağlamak için IRI model geliştirme prosedürünü açıklıyoruz.

Akut böbrek hasarı (ABH), 48 saat içinde serum kreatinininde ≥ 0.3 mg / dL (26.5 μM / L) artış veya serum kreatinininde 7 gün içinde taban çizgisinin 1.5 katına ≥ artış veya idrar hacmi 6 saat boyunca 0.5 mL / kg / s'< bir artış olarak tanımlanan, önemli morbidite ve mortaliteye sahip ciddi bir klinik sendromdur^{1, 2,3}. Onlarca yıllık araştırmalara rağmen, ABH için böbrek hasarını hafifletmek veya böbrek iyileşmesini hızlandırmak için etkili bir tedavi eksiktir ve ABH hastalarının önemli bir kısmı kronik böbrek hastalığına (KBH) ilerlemektedir4,5,6. Karmaşık moleküller ve yolaklar ABH ve kısmen ilerlemesinde rol oynar, bu nedenle klinik öncesi modeller, verimli terapötik modalitelerin geliştirilmesi için bu karmaşıklıkları çözmek için güçlü araçlar sağlar.

Klinik olarak, iskemi-reperfüzyon yaralanması (IRI) yaralanması, kardiyak ve karaciğer ameliyatları, dolaşım şoku, hacim azalması, sepsis, renal vasküler tıkanıklık veya tıkanıklık, böbrek nakli vb. dahil olmak üzere çeşitli durumlarda ABH'nin başlıca nedenidir⁷. IRI-AKI fare modeli 1960'lardan beri kullanılmaktadır; Bu model, iskemiye yol açan farelerde renal pediküllerin travmatik olmayan klemplerle cerrahi olarak klemplenmesi ve ardından klemplerin çıkarılarak renal kan akımının reperfüzyonu ile geliştirilmiştir. IRI-ABI modeli tipik olarak renal tübüler hücre ölümü ve ilerleyici böbrek dokusu hasarı ile karakterizedir. IRI, çeşitli nedenlerle ABH'de patogenez ve terapötik müdahale için kullanılan en yaygın modellerden biridir: (1) Cerrahi prosedürün basitliği ve güvenliği, IRI-ABH modelinin hayatta kalma oranını ve başarı oranını artırır⁸; (2) İskemi insan ABH'sinde önemli bir etiyoloji olduğundan, klinik ABH olayı^9'u değerlendirmek için IRI-ABH modeli daha iyi kullanılır; (3) IRI modeli, ABH'nin farklı aşamalarında böbrek hasarı ve histopatoloji değişiklikleri sunabilir, bu da ABH'den KBH^10'a ilerlemeyi incelemek için de geçerlidir. Deneysel tasarıma bağlı olarak, IRI ile indüklenen ABH modelleri arasında bilateral IRI, sağlam kontralateral böbrekli tek taraflı IRI ve eşzamanlı kontralateral nefrektomi ile tek taraflı IRI bulunur. Özellikle, bilateral IRI modeli, ABH'nin insan patolojik koşullarıyla daha ilgili olarak kabul edilir, çünkü her iki böbrek de kan akışından etkilenmiştir¹¹. IRI modeli, böbrek nakli, kardiyak baypas, renal vasküler veya nefron koruyucu cerrahi sonrası ve ayrıca hipotansiyon⁹ ortamında azalan renal kan akışının etkilerini simüle etmek için uygulanabilir. Burada, araştırmacıların iskemiye bağlı ABH'de altta yatan patogenezi araştırmaları için tutarlı ve güvenilir bir yöntem sağlamak için bilateral bir IRI modeli için prosedürü açıklıyoruz.

8 haftalık ve 25 g ağırlığındaki erkek C57BL/6J fareler, bilateral iskemi-reperfüzyon ile AKI modelini oluşturmak için kullanıldı. Önceki çalışmalara göre, vücut ısısını 36.5 °C-37 °C civarında tutuyoruz ve IRI cerrahisinde böbrek iskemi süresi 30 dakikadır^12,13. Her grup için toplam 6 fareye ihtiyaç vardı ve sahte olarak çalıştırılan fareler kontrol görevi gördü. Bu çalışmadaki hayvan deneyleri, hayvanların refahını korumak için Zhejiang Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan araştırma prosedürleri, Zhejiang Üniversitesi'nin etik yönergelerine ve ilkelerine uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

1. Tüm cerrahi aletleri yüksek basınçla sterilize edin.
2. 7.6 mL steril salin içinde 2 mL ketamin ve 0.4 mL ksilazin ekleyerek anestezik çözeltiyi hazırlayın. Fareyi intraperitoneal enjeksiyon ile ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (16 mg / kg) karışımı ile uyuşturun. Ayak parmağını sıkıştırma refleksini kullanarak anestezik derinliği değerlendirin.
3. Hava yolunun engellenmediğinden emin olmak için anestezi uygulanmış fareyi homeotermik battaniyenin üzerine yerleştirin. Vücut ısısını 36,5-37 °C aralığında tutun.
4. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için farenin gözlerini %1 tetrasiklin hidroklorür göz merhemi ile kapatın.
5. Karın kıllarını bir saç kesme makinesi ile tıraş edin ve cerrahi alanın cildini 3 kez povidon-iyot solüsyonu ile temizleyin.

2. Ameliyat

1. Cerrahi makasla yaklaşık 1-1,5 cm'lik bir karın medyan kesisini cilt ve kas tabakası üzerinden yapın ve karın boşluğunu yayıcı ile açın.
2. Retroperitoneal yağı hareket ettirerek ve bağırsakları ve diğer organları pamuklu çubukla ofsayta iterek böbreği açığa çıkarın. Böbrek, retroperitoneal boşlukta, omurganın yaklaşık 0.5 cm lateralinde ve 13^{. kaburganın} altında bulunur.
3. Fasya ve yağ dokusunu ayırmak ve çıkarmak ve sol renal pedikülleri ortaya çıkarmak için renal pedikülü ince sivri forseps ile inceleyin.
4. Renal pedikülleri tutma forseps kullanarak vasküler bir klips ile kelepçeleyin ve vasküler hasarın mümkün olduğunca küçük olduğundan emin olun. Eksik renal iskemiye yol açabilecek gereksiz renal sinüs yağını klemplemekten kaçının.
5. Böbrek iskemi süresini, 30 dakika boyunca klempleme ile başlayarak ayarlayın. Başarılı iskeminin özelliği, böbreğin birkaç dakika içinde yavaş yavaş kırmızıdan koyu mora değişmesidir.
6. Böbreği retroperitoneal boşluğa taşıyın. Sağ renal pedikülleri açığa çıkarmak ve klemplemek için karşı taraftaki prosedürü tekrarlayın.
7. Her iki böbreğin de iskeminin tam süresini almasını sağlamak için her iki taraftaki iskemi süresini ayrı ayrı kaydedin. İnsizyonu tekrar açın ve iskemi süresinin sonunda vasküler klipsi serbest bırakın.
8. Böbreği retroperitoneal boşluğa yerleştirin ve ardından Vicryl 4-0 sütür ile kas ve cildi katman katman dikin.
   NOT: Cerrahi işlemler steril şartlarda yapılmalıdır. Ameliyat masasını ve aletleri çalışma sırasında gerektiğinde %75 etanol ile temizleyin.

3. Ameliyat sonrası bakım

1. Sıvı kaybını telafi etmek için intraperitoneal enjeksiyon ile 0.5-1 mL ılık ve steril salin uygulayın.
2. Fare yeterli bilinci yeniden kazanana kadar sternal yaslanmaya dikkat edin. Fareyi tam bilinç kazanana kadar homeotermik battaniyenin üzerine koyun, ardından kafesine geri dönün. Tamamen iyileşene kadar fareyi diğer hayvanların şirketine iade etmeyin.
3. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için ilk 3 gün boyunca her 12 saatte bir buprenorfin 0.05-0.10 mg / kg verin. Cerrahi fareleri her gün izleyin.

4. Model değerlendirmesi

1. Hematoksilen-Eozin (HE) boyama
   1. IRI'den sonraki 1, 3, 7 veya 14. günlerde intraperitoneal enjeksiyonla pentobarbital sodyum kullanarak hayvanlara ötenazi yapın.
   2. Taze böbrek dokularını gece boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin ve 4 °C'de %75 etanol içinde saklayın.
   3. Dehidrasyon ve gömme işleminden sonra, elde edilen numuneleri boyama için 8 μm kalınlığında kesin.
   4. Doku bölümlerini ksilen içinde mumdan arındırın ve ardından azalan etanol konsantrasyonları ile rehidre edin.
   5. Doku bölümlerini hematoksilen ve eozin ile boyayın.
   6. Etanol ve ksilen konsantrasyonlarını artırarak doku bölümlerini kurutun.
2. Böbrek fonksiyon testi
   1. Anesteziden sonra göz küresi kan alma yöntemini kullanarak kan örnekleri toplayın.
   2. Serumu ayırmak için kan örneklerini 12000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
   3. Böbrek fonksiyonunu izlemek için otomatik kuru kimya analizörü ile serum kreatinin ve kan üre azotunu (BUN) belirleyin.
3. Gerçek Zamanlı PCR (RT-PCR)
   1. Hızlı bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak böbrek dokularından toplam RNA'yı çıkarın ve ardından bir ters transkriptaz karışım kiti ile cDNA'yı sentezleyin. SYBR Green Premix Kit ile RT-PCR gerçekleştirin ve RT-PCR cihazında çalıştırın. Burada kullanılan primer dizileri^14'ten önce rapor edilmiştir: KIM1 ileri, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; ters 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'; NGAL ileri, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; ters 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTAGTCC-3'; GAPDH ileri, 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'; ters 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

Ameliyat sırasında böbreğin durumu

Başarılı iskeminin özelliği, böbreğin 1-2 dakika içinde kademeli olarak kırmızıdan koyu mora değişmesi ve başarılı reperfüzyonun böbreğin 1-2 dakika içinde yavaş yavaş koyu mordan kırmızıya dönüşmesi ile karakterize olmasıdır.

Ameliyat sonrası böbreğin histolojisi

HE ve Periyodik Asit Schiff (PAS) boy...

Bu yazıda, renal IRI modeli hakkında ayrıntılı bir prosedür sunduk ve daha sonra ABH ve ABH'nin KBH'ye ilerlemesi için sağlam bir model olduğunu vurguladık. Ek olarak, böbrek histolojisi ve fonksiyonu dahil olmak üzere iki ana böbrek hasarı kriterinin etkisini gösteriyoruz.

Tekrarlanabilir ve güvenilir bir model için cerrahi prosedürlerde birkaç kilit noktanın vurgulanması gerekir. Karın ameliyatı için, ameliyatla ilişkili travmayı en...

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Bu çalışmada gösterdikleri iş birliği için tüm katılımcılara teşekkürlerimizi sunarız. Bu çalışma, Çin'in Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LZ22H050001) ve Zhejiang eyaleti Weiqiang Lin'e Üst Düzey Yenilikçi Sağlık Yeteneklerinin Yetiştirilmesi için programından sağlanan finansmanla desteklenmiştir.