Bilaterales renales Ischämie-Reperfusionsmodell für akutes Nierenversagen bei Mäusen

Das Ischämie-Reperfusions-Schädigungsmodell (IRI) kann in verschiedenen Stadien der Entwicklung einer akuten Nierenschädigung (AKI) eingesetzt werden, insbesondere während des Fortschreitens der AKI bis zur chronischen Nierenerkrankung (CKD). Hier beschreiben wir das Verfahren zur Entwicklung von IRI-Modellen bei Mäusen über einen transabdominalen Zugang, bei dem Nierenstiele über einen Gefäßclip eingeklemmt werden, um eine ischämische Verletzung zu induzieren.

Akutes Nierenversagen (AKI) ist definiert als ein rascher Rückgang der Nierenfunktion, bei dem eine anhaltende Nierenfunktionsstörung aufgrund des irreversiblen Verlusts von Nephronen und ihrer maladaptiven Reparatur allmählich zu einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) fortschreitet. In den letzten Jahren hat die Inzidenz von AKI in Bezug auf verschiedene Ätiologien zugenommen, darunter Volumenmangel, Sepsis, Nephrotoxizität, Muskelverletzungen und schwere Traumata, bei denen Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) für die meisten Episoden verantwortlich sind. Die Entwicklung des IRI-Modells bei Mäusen wird durch chirurgisches Abklemmen der Nierenstiele induziert, was leistungsfähige und kontrollierbare Werkzeuge für präklinische Modelle von AKI bietet. Wichtig ist, dass das IRI-Modell in verschiedenen Phasen der AKI-Entwicklung eingesetzt wird, insbesondere in den Prozessen von AKI bis CKD. Obwohl das IRI-Modell in vielen Laboratorien weit verbreitet ist, beeinflussen eine Reihe von Variablen immer noch die Ergebnisse dieses Modells. Hier beschreiben wir das Verfahren der IRI-Modellentwicklung, um Forschern eine wiederholbare und zuverlässige Methode zur Verfügung zu stellen, um die zugrunde liegende Pathogenese bei der Entwicklung von AKI und die Progression von AKI zu CKD zu untersuchen.

Akutes Nierenversagen (AKI) ist ein schweres klinisches Syndrom mit signifikanter Morbidität und Mortalität, definiert als ein Anstieg des Serumkreatinins um ≥ 0,3 mg/dl (26,5 μM/l) innerhalb von 48 h oder ein Anstieg des Serumkreatinins auf das 1,5-fache des Ausgangswerts innerhalb von 7 Tagen auf das ≥ oder das Urinvolumen < 0,5 ml/kg/h für 6 h^{1, 2,3}. Trotz jahrzehntelanger Forschung fehlt es an einer wirksamen Therapie für AKI, um Nierenschäden zu lindern oder die Genesung der Nieren zu beschleunigen, und ein beträchtlicher Teil der AKI-Patienten entwickelt sich zu einer chronischen Nierenerkrankung (CKD)^4,5,6. Komplexe Moleküle und Signalwege sind teilweise an der AKI und ihrer Progression beteiligt, so dass präklinische Modelle leistungsstarke Werkzeuge bieten, um diese Komplexitäten für die Entwicklung effizienter therapeutischer Modalitäten zu entschlüsseln.

Klinisch gesehen ist eine Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) die Hauptursache für AKI bei verschiedenen Erkrankungen, darunter Herz- und Leberoperationen, Kreislaufschock, Volumenmangel, Sepsis, Nierengefäßverschluss oder -obstruktion, Nierentransplantation und so weiter⁷. Das Mausmodell IRI-AKI ist seit den 1960er Jahren im Einsatz. Dieses Modell wurde durch chirurgisches Einklemmen der Nierenstiele mit nicht-traumatischen Klemmen bei Mäusen entwickelt, was zu einer Ischämie führte, und gefolgt von einer Reperfusion des renalen Blutflusses durch Entfernen der Klammern. Das IRI-AKI-Modell ist typischerweise durch den renalen tubulären Zelltod und eine fortschreitende Schädigung des Nierengewebes gekennzeichnet. Das IRI ist aus mehreren Gründen eines der gebräuchlichsten Modelle für die Pathogenese und therapeutische Intervention bei AKI: (1) Die Einfachheit und Sicherheit des chirurgischen Eingriffs verbessert die Überlebensrate und Erfolgsrate des IRI-AKI-Modells⁸; (2) Da Ischämie eine wichtige Ätiologie bei humanen AKI ist, wird das IRI-AKI-Modell besser zur Beurteilung des klinischen AKI-Ereignisses^{verwendet 9}; (3) Das IRI-Modell könnte Veränderungen der Nierenschädigung und der Histopathologie in verschiedenen Stadien der AKI darstellen, was auch auf die Untersuchung der Progression von AKI zu CKD¹⁰ anwendbar ist. Abhängig vom Versuchsdesign umfassen IRI-induzierte AKI-Modelle eine bilaterale IRI, eine unilaterale IRI mit intakter kontralateraler Niere und eine unilaterale IRI mit gleichzeitiger kontralateraler Nephrektomie. Bemerkenswert ist, dass das bilaterale IRI-Modell als relevanter für die pathologischen Zustände der AKI beim Menschen angesehen wird, da beide Nieren von der Blutversorgung betroffen sind¹¹. Das IRI-Modell ist anwendbar, um die Auswirkungen eines verminderten Nierenblutflusses nach Nierentransplantation, Herzbypass, Nierengefäß- oder nephronsparender Operation sowie bei Hypotonie^{zu simulieren 9}. Hier beschreiben wir das Verfahren für ein bilaterales IRI-Modell, um Forschern eine konsistente und zuverlässige Methode zur Verfügung zu stellen, um die zugrunde liegende Pathogenese bei Ischämie-induzierter AKI zu untersuchen.

Männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 8 Wochen und mit einem Gewicht von 25 g wurden verwendet, um das AKI-Modell durch bilaterale Ischämie-Reperfusion zu etablieren. Wie in früheren Studien halten wir die Körpertemperatur bei etwa 36,5 °C bis 37 °C, und die Dauer der Nierenischämie beträgt 30 Minuten in der IRI-Operation^12,13. Insgesamt wurden 6 Mäuse für jede Gruppe benötigt, und scheinoperierte Mäuse dienten als Kontrollen. Die Tierversuche in dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Zhejiang genehmigt, um das Wohlergehen der Tiere zu schützen. Alle Tierversuche wurden nach den ethischen Richtlinien und Prinzipien der Zhejiang Universität durchgeführt.

1. Präoperative Vorbereitung

1. Hochdrucksterilisation aller chirurgischen Instrumente.
2. Bereiten Sie die Anästhesielösung vor, indem Sie 2 ml Ketamin und 0,4 ml Xylazin in 7,6 ml sterile Kochsalzlösung hinzufügen. Betäuben Sie die Maus mit einer Mischung aus Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (16 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion. Beurteilen Sie die Narkosetiefe mit dem Zehenkneifreflex.
3. Legen Sie die betäubte Maus auf die homöotherme Decke, um sicherzustellen, dass ihre Atemwege frei bleiben. Halten Sie die Körpertemperatur im Bereich von 36,5-37 °C.
4. Decken Sie die Augen der Maus mit 1 % Tetracyclinhydrochlorid-Augensalbe ab, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
5. Rasieren Sie die Haare des Bauches mit einem Haarschneider und reinigen Sie die Haut des Operationsbereichs 3x mit einer Povidon-Jod-Lösung.

2. Chirurgie

1. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen mittleren Schnitt des Bauches ca. 1-1,5 cm über die Haut- und Muskelschicht und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem Spreizer.
2. Legen Sie die Niere frei, indem Sie das retroperitoneale Fett bewegen und den Darm und andere Organe mit einem Wattestäbchen ins Abseits schieben. Die Niere befindet sich im retroperitonealen Raum, etwa 0,5 cm lateral der Wirbelsäule und unterhalb der 13^. Rippe.
3. Präparieren Sie den Nierenstiel mit einer feinen spitzen Pinzette, um die Faszien und das Fettgewebe zu trennen und zu entfernen und die linken Nierenstiele freizulegen.
4. Klemmen Sie die Nierenstiele mit einem Gefäßclip mit einer Haltezange fest und sorgen Sie dafür, dass die Gefäßschädigung so gering wie möglich ist. Vermeiden Sie das Einklemmen von überflüssigem Nierensinusfett, das zu einer unvollständigen renalen Ischämie führen kann.
5. Stellen Sie die Dauer der Nierenischämie ein, beginnend mit dem Klemmen für 30 Minuten. Charakteristisch für eine erfolgreiche Ischämie ist, dass sich die Niere innerhalb weniger Minuten allmählich von rot zu dunkelviolett verfärbt.
6. Bewegen Sie die Niere in den retroperitonealen Raum. Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen Seite, um die rechten Nierenstiele freizulegen und zu klemmen.
7. Notieren Sie die Ischämiezeit auf jeder Seite separat, um sicherzustellen, dass beide Nieren die genaue Dauer der Ischämie erhalten. Öffnen Sie den Schnitt wieder und lösen Sie den Gefäßclip am Ende der Ischämiedauer.
8. Setzen Sie die Niere in den retroperitonealen Raum ein und nähen Sie dann den Muskel und die Haut Schicht für Schicht mit dem Vicryl 4-0-Nahtmaterial.
   HINWEIS: Die chirurgischen Eingriffe sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Reinigen Sie den Operationstisch und die Instrumente während der Operation bei Bedarf mit 75%igem Ethanol.

3. Nachsorge

1. Verabreichen Sie 0,5-1 ml warme und sterile Kochsalzlösung durch intraperitoneale Injektion, um den Flüssigkeitsverlust auszugleichen.
2. Halten Sie das Brustbein mit Aufmerksamkeit aufrecht, bis die Maus wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat. Lege die Maus auf die homöotherme Decke, bis sie bei vollem Bewusstsein ist, und kehre dann in ihren Käfig zurück. Geben Sie die Maus nicht an andere Tiere zurück, bis sie vollständig genesen ist.
3. Geben Sie Buprenorphin 0,05-0,10 mg/kg alle 12 Stunden für die ersten 3 Tage, um postoperative Schmerzen zu lindern. Überwachen Sie die chirurgischen Mäuse jeden Tag.

4. Modell-Bewertung

1. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung
   1. Euthanasieren Sie Tiere mit Pentobarbital-Natrium durch intraperitoneale Injektion an den Tagen 1, 3, 7 oder 14 nach der IRI.
   2. Frisches Nierengewebe über Nacht mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixieren und in 75 % Ethanol bei 4 °C lagern.
   3. Nach dem Dehydrieren und Einbetten werden die erhaltenen Proben für die Färbung in eine Dicke von 8 μm geschnitten.
   4. Entwachse die Gewebeabschnitte in Xylol und rehydriere sie dann mit abnehmenden Ethanolkonzentrationen.
   5. Färben Sie die Gewebeschnitte mit Hämatoxylin und Eosin.
   6. Dehydrieren Sie die Gewebeabschnitte, indem Sie die Konzentrationen von Ethanol und Xylol erhöhen.
2. Nierenfunktionstest
   1. Entnehmen Sie Blutproben mit der Methode der Augapfelblutentnahme nach der Anästhesie.
   2. Zentrifugieren Sie Blutproben bei 12000 x g für 10 Minuten, um das Serum zu trennen.
   3. Bestimmen Sie das Serumkreatinin und den Blutharnstoffstickstoff (BUN) mit dem automatischen trockenchemischen Analysator zur Überwachung der Nierenfunktion.
3. Echtzeit-PCR (RT-PCR)
   1. Extrahieren Sie Gesamt-RNA aus Nierengewebe mit einem schnellen RNA-Extraktionskit und synthetisieren Sie dann cDNA mit einem Reverse-Transkriptase-Mix-Kit. Führen Sie die RT-PCR mit dem SYBR Green Premix Kit durch und führen Sie sie auf dem RT-PCR-Gerät aus. Die hier verwendeten Primersequenzen wurden vor¹⁴ berichtet: KIM1 forward, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; rückwärts 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'; NGAL nach vorne, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; rückwärts 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3'; GAPDH nach vorne, 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'; rückwärts 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

Zustand der Niere während der Operation

Charakteristisch für eine erfolgreiche Ischämie ist, dass sich die Niere innerhalb von 1-2 Minuten allmählich von rot zu dunkelviolett ändert, und eine erfolgreiche Reperfusion zeichnet sich dadurch aus, dass sich die Niere innerhalb von 1-2 Minuten allmählich von tiefviolett zu rot ändert.

Histologie der Niere nach der Operation

In diesem Artikel haben wir ein detailliertes Verfahren zum renalen IRI-Modell vorgestellt und anschließend hervorgehoben, dass es sich um ein robustes Modell für die Progression von AKI und AKI zu CKD handelt. Darüber hinaus zeigen wir die Auswirkungen der beiden Hauptkriterien der Nierenschädigung, einschließlich der Nierenhistologie und -funktion.

Mehrere wichtige Punkte bei chirurgischen Eingriffen müssen hervorgehoben werden, um ein wiederholbares u...

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Wir bedanken uns bei allen Teilnehmenden für die Mitarbeit an der aktuellen Studie. Diese Studie wurde durch die Finanzierung der Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LZ22H050001) und des Programms der Provinz Zhejiang für die Kultivierung hochrangiger innovativer Gesundheitstalente für Weiqiang Lin unterstützt.