マウスにおける急性腎障害に対する両側腎虚血再灌流モデル

虚血再灌流障害(IRI)モデルは、急性腎障害(AKI)の発症のさまざまな段階、特にAKIから慢性腎臓病(CKD)への進行中に使用できます。ここでは、マウスにおける経腹的アプローチによるIRIモデル開発の手順、血管クリップを介して腎椎弓根をクランプして虚血性損傷を誘発する手順について説明します。

急性腎障害(AKI)は、腎機能が急速に低下し、持続的な腎機能障害が徐々に進行し、ネフロンが不可逆的に失われ、その不適応な修復により慢性腎臓病(CKD)に進行することと定義されています。近年、体積減少、敗血症、腎毒性、筋損傷、大外傷など多様な病因でAKIの発症率が増加傾向にあり、虚血再灌流障害(IRI)がほとんどのエピソードを占めています。マウスにおけるIRIモデルの開発は、腎椎弓根の外科的クランプによって誘発され、AKIの前臨床モデルに強力で制御可能なツールを提供します。重要なのは、IRIモデルはAKI開発のさまざまな段階、特にAKIからCKDへのプロセスで展開されることです。IRIモデルは多くの研究室で広く実践されていますが、このモデルの結果には依然として一連の変数が影響しています。ここでは、研究者がAKIの発生とAKIからCKDへの進行における根本的な病因を調査するための再現性と信頼性の高い方法を提供するためのIRIモデル開発の手順について説明します。

急性腎障害 (AKI) は、罹患率と死亡率が有意な重篤な臨床症候群であり、48 時間以内に血清クレアチニンが 0.3 mg/dL (26.5 μM/L) ≥増加するか、血清クレアチニンが 7 日以内にベースラインの 1.5 倍に増加する≥、または^{6 時間で}尿量が 0.5 mL/kg/h < 1^、2,3.何十年にもわたる研究にもかかわらず、AKIの効果的な治療法は腎臓の損傷を軽減したり、腎臓の回復を促進したりするためのものがなく、AKI患者のかなりの割合が慢性腎臓病(CKD)に進行しています^4,5,6。複雑な分子と経路は、AKIとその進行に部分的に関与しているため、前臨床モデルは、効率的な治療法の開発のためにこれらの複雑さを解明するための強力なツールを提供します。

臨床的には、虚血再灌流障害(IRI)損傷は、心臓および肝臓の手術、循環ショック、体積の枯渇、敗血症、腎血管の閉塞または閉塞、腎臓移植など、さまざまな状態におけるAKIの主な原因^です7。IRI-AKIマウスモデルは1960年代から使用されています。このモデルは、虚血につながるマウスの非外傷性クランプによる腎椎弓根の外科的クランプと、クランプを取り外すことによる腎血流の再灌流によって開発されました。IRI-AKIモデルは、通常、腎尿細管細胞死と進行性の腎組織損傷を特徴としています。IRIは、いくつかの理由から、AKIの病因と治療介入に使用される最も一般的なモデルの1つです:(1)外科的手順のシンプルさと安全性は、IRI-AKIモデル⁸の生存率と成功率を向上させます。(2)虚血はヒトAKIの主要な病因であるため、IRI-AKIモデルは臨床AKIイベント⁹の評価に適しています。(3) IRIモデルは、AKIのさまざまな段階で腎障害と組織病理学の変化を示す可能性があり、これはAKIから^CKD10への進行の研究にも適用できます。実験デザインに応じて、IRI誘発AKIモデルには、両側IRI、無傷の対側腎臓を持つ片側IRI、および同時対側腎摘出術を伴う片側IRIが含まれます。特に、両側IRIモデルは、両方の腎臓が血液供給の影響を受けているため、AKIのヒトの病理学的状態により関連性が高いと考えられています¹¹。IRIモデルは、腎移植後、心臓バイパス術、腎血管手術後、または腎温存手術後、および低血圧⁹の設定における腎血流の減少の影響をシミュレートするために適用できます。ここでは、研究者が虚血誘発性AKIの根本的な病因を調査するための一貫した信頼性の高い方法を提供するための、二国間IRIモデルの手順について説明します。

8週齢、体重25gの雄C57BL/6Jマウスを用いて、両側性虚血再灌流によるAKIモデルを確立しました。以前の研究によると、IRI手術^12,13では、体温を約36.5°C〜37°Cに維持し、腎虚血の持続時間は30分です。各グループごとに合計6匹のマウスが必要であり、偽操作マウスが対照として機能しました。本研究の動物実験は、動物の福祉を保護するために、浙江大学の動物管理委員会(IACUC)によって承認されています。すべての動物研究手順は、浙江大学の倫理ガイドラインと原則に従って行われました。

1. 術前準備

1. すべての手術器具を高圧滅菌します。
2. 7.6 mLの滅菌生理食塩水に2 mLのケタミンと0.4 mLのキシラジンを加えて麻酔薬溶液を準備します。.腹腔内注射により、ケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(16 mg / kg)の混合物でマウスに麻酔をかけます。つま先のピンチ反射を使用して麻酔薬の深さを評価します。
3. 麻酔をかけたマウスをホメオサームブランケットの上に置き、気道が遮られないようにします。体温を36.5〜37°Cの範囲に保ちます。
4. 麻酔下での乾燥を防ぐために、マウスの目を1%塩酸テトラサイクリン眼軟膏で覆います。
5. バリカンで腹部の髪を剃り、手術部位の皮膚をポビドンヨード溶液で3回洗浄します。

2. 手術

1. 皮膚と筋肉の層を介して手術用ハサミで腹部中央部を約1〜1.5cm切開し、スプレッダーで腹腔を開きます。
2. 後腹膜脂肪を動かし、綿棒で腸や他の臓器をオフサイドに押して腎臓を露出させます。腎臓は後腹膜腔にあり、脊椎の外側約0.5cm、13^番目の 肋骨の下にあります。
3. 細い先のとがった鉗子で腎椎弓根を解剖して、筋膜と脂肪組織を分離して除去し、左の腎椎弓根を露出させます。
4. 保持鉗子を使用して血管クリップで腎椎弓根を固定し、血管の損傷ができるだけ軽微であることを確認します。不完全な腎虚血につながる可能性のある余分な腎洞脂肪のクランプは避けてください。.
5. 腎臓虚血の持続時間を設定します、30分間のクランプから始めます。成功した虚血の特徴は、腎臓が数分以内に赤から濃い紫色に徐々に変化することです。
6. 腎臓を後腹膜腔に移動します。反対側で手順を繰り返して、右の腎椎弓根を露出させてクランプします。
7. 両側の虚血時間を別々に記録して、両方の腎臓が虚血の正確な期間を受け取るようにします。切開部を再度開き、虚血期間の終了時に血管クリップを放します。
8. 腎臓を後腹膜腔に置換し、Vicryl 4-0縫合糸で筋肉と皮膚を層ごとに縫合します。
   注:外科的処置は無菌条件下で行う必要があります。手術台と器具は、必要に応じて手術中に75%エタノールで清掃してください。

3. 術後のケア

1. 腹腔内注射により0.5〜1mLの温冷生理食塩水を投与し、体液の損失を補います。
2. マウスが十分な意識を取り戻すまで、注意を払って胸骨の横臥を維持します。マウスを完全に意識を得るまでマウスをホメオサームブランケットの上に置いてから、ケージに戻ります。完全に回復するまで、マウスを他の動物の会社に戻さないでください。
3. 術後の痛みを軽減するために、最初の3日間はブプレノルフィン0.05-0.10 mg / kgを最初の3日間は12時間ごとに投与します。.手術用マウスを毎日監視します。

4. モデル評価

1. ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色
   1. IRI後1、3、7、または14日目に腹腔内注射により、ペントバルビタールナトリウムを使用して動物を安楽死させます。
   2. 新鮮な腎臓組織を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で一晩固定し、75%エタノールで4°Cで保存します。
   3. 脱水して包埋した後、得られたサンプルを8μmの厚さにカットして染色します。
   4. キシレンで組織切片を脱ろうし、エタノールの濃度を減らして再水和します。
   5. 組織切片をヘマトキシリンとエオシンで染色します。
   6. エタノールとキシレンの濃度を上げて組織切片を脱水します。
2. 腎機能アッセイ
   1. 麻酔後、眼球採血法を用いて血液サンプルを採取します。
   2. 血液サンプルを12000 x g で10分間遠心分離し、血清を分離します。
   3. 腎機能を監視するための自動ドライケミストリーアナライザーで血清クレアチニンと血中尿素窒素(BUN)を測定します。
3. リアルタイムPCR (RT-PCR)
   1. クイックRNA抽出キットを使用して腎臓組織から全RNAを抽出し、逆転写酵素ミックスキットでcDNAを合成します。SYBR Green Premix Kitを使用してRT-PCRを実施し、RT-PCR装置で実行します。ここで使用されたプライマー配列は^、14より前に報告されました:KIM1フォワード、5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3';逆5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3';NGALフォワード、5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3;逆5'-TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3';GAPDH フォワード、5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3';逆5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。

手術中の腎臓の状態

成功した虚血の特徴は、腎臓が1〜2分以内に赤から濃い紫色に徐々に変化することであり、成功した再灌流は、腎臓が1〜2分以内に濃い紫色から赤に徐々に変化するという特徴があります。

手術後の腎臓の組織学

HEおよび過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色は、急性腎...

この論文では、腎臓IRIモデルの詳細な手順を提供し、その後、それがAKIおよびAKIからCKDへの進行のための堅牢なモデルであることを強調しました。さらに、腎臓の組織学と機能を含む、腎障害の2つの主要な基準の影響を示します。

外科的処置におけるいくつかの重要なポイントは、再現性と信頼性のあるモデルのために強調する必要があります...

著者は、利益相反を宣言しません。

今回の研究への協力に対して、参加者の皆様に感謝いたします。この研究は、中国浙江省自然科学財団(LZ22H050001)からの資金提供と、Weiqiang Linへの高レベル革新的健康人材の育成のための浙江省プログラムによって支援されました。