小鼠急性肾损伤的双侧肾缺血再灌注模型

缺血再灌注损伤 （IRI） 模型可用于急性肾损伤 （AKI） 发展的不同阶段，尤其是在 AKI 到慢性肾脏病 （CKD） 进展期间。在这里，我们描述了通过经腹入路在小鼠中开发 IRI 模型的程序，通过血管夹夹住肾蒂以诱导缺血性损伤。

急性肾损伤 （AKI） 定义为肾功能迅速下降，其中由于肾单位不可逆的丢失及其适应不良的修复，持续性肾功能障碍逐渐发展为慢性肾病 （CKD）。近年来，AKI 的发病率一直在增加，涉及多种病因，包括血容量不足、脓毒症、肾毒性、肌肉损伤和严重创伤，其中缺血再灌注损伤 （IRI） 占大多数发作。小鼠 IRI 模型的开发是通过手术夹闭肾蒂诱导的，这为 AKI 的临床前模型提供了强大且可控的工具。重要的是，IRI 模型部署在 AKI 开发的不同阶段，尤其是在 AKI 到 CKD 的过程中。尽管 IRI 模型在许多实验室中得到广泛应用，但一系列变量仍然影响着该模型的结果。在这里，我们描述了 IRI 模型开发的过程，为研究人员提供了一种可重复且可靠的方法来探索 AKI 发展和 AKI 进展为 CKD 的潜在发病机制。

急性肾损伤 （AKI） 是一种严重的临床综合征，具有显着的发病率和死亡率，定义为 48 小时内血清肌酐增加 ≥ 0.3 mg/dL （26.5 μM/L） 或血清肌酐增加至 7 天内基线的 1.5 倍≥，或尿量< 0.5 mL/kg/h 持续 6 小时^1，2,3.尽管进行了数十年的研究，但缺乏有效的 AKI 疗法来减轻肾脏损伤或加速肾脏恢复，并且相当一部分 AKI 患者会发展为慢性肾脏病 （CKD）^4,5,6。复杂的分子和通路部分参与 AKI 及其进展，因此临床前模型提供了强大的工具来解开这些复杂性，以开发有效的治疗方式。

临床上，缺血再灌注损伤 （IRI） 损伤是各种情况下 AKI 的主要原因，包括心脏和肝脏手术、循环休克、血容量不足、败血症、肾血管闭塞或阻塞、肾移植等⁷。IRI-AKI 小鼠模型自 1960 年代以来一直在使用;该模型是通过对导致缺血的小鼠使用非创伤性夹闭肾蒂手术夹闭，然后通过移除夹子对肾血流进行再灌注而开发的。IRI-AKI 模型的典型特征是肾小管细胞死亡和进行性肾组织损伤。IRI 是 AKI 发病机制和治疗干预最常用的模型之一，原因如下：（1） 手术过程的简单性和安全性提高了 IRI-AKI 模型的存活率和成功率⁸;（2） 由于缺血是人类 AKI 的主要病因，因此 IRI-AKI 模型更适合用于评估临床 AKI 事件⁹;（3） IRI 模型可以呈现 AKI 不同阶段的肾损伤和组织病理学变化，也适用于研究从 AKI 到 CKD¹⁰ 的进展。根据实验设计，IRI 诱导的 AKI 模型包括双侧 IRI、对侧肾脏完整的单侧 IRI 和同时对侧肾切除术的单侧 IRI。值得注意的是，双侧 IRI 模型被认为与 AKI 的人类病理状况更相关，因为两个肾脏都受到血液供应的影响¹¹。IRI 模型适用于模拟肾移植、心脏搭桥、肾血管或保留肾单位手术后肾血流量减少的影响，以及在低血压的情况下⁹。在这里，我们描述了双侧 IRI 模型的程序，为研究人员提供了一种一致且可靠的方法来探索缺血诱导的 AKI 的潜在发病机制。

使用 8 周龄、体重 25 g 的雄性 C57BL/6J 小鼠通过双侧缺血再灌注建立 AKI 模型。根据以前的研究，我们将体温保持在 36.5 °C-37 °C 左右，IRI 手术中肾缺血持续时间为 30 分钟^12,13。每组共需要 6 只小鼠，假手术小鼠作为对照。本研究中的动物实验已获得浙江大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准，以保护动物的福利。所有动物研究程序均按照浙江大学的伦理准则和原则进行。

1. 术前准备

1. 对所有手术器械进行高压灭菌。
2. 通过在 7.6 mL 无菌盐水中加入 2 mL 氯胺酮和 0.4 mL 甲苯噻嗪来制备麻醉溶液。通过腹膜内注射用氯胺酮 （80 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （16 mg/kg） 的混合物麻醉小鼠。使用脚趾捏反射评估麻醉深度。
3. 将麻醉的小鼠放在恒温毯上，以确保其气道保持畅通无阻。将体温保持在 36.5-37 °C 范围内。
4. 用 1% 盐酸四环素眼膏覆盖小鼠的眼睛，以防止麻醉时干燥。
5. 用理发器剃掉腹部的毛发，并用聚维酮碘溶液清洁手术区域的皮肤 3 次。

2. 手术

1. 用手术剪刀通过皮肤和肌肉层切开约 1-1.5 厘米的腹部正中切口，然后用扩张器打开腹腔。
2. 通过移动腹膜后脂肪并用棉签将肠道和其他器官推到越位位置来暴露肾脏。肾脏位于腹膜后间隙，脊柱外侧约 0.5 cm，^第 13 根肋骨下方。
3. 用细尖镊子解剖肾蒂，以分离和去除筋膜和脂肪组织，并暴露左肾蒂。
4. 使用固定镊子用血管夹夹住肾蒂，并确保血管损伤尽可能小。避免夹夹多余的肾窦脂肪，这可能导致不完全性肾缺血。
5. 设置肾缺血持续时间，从夹紧 30 分钟开始。成功缺血的特点是肾脏在几分钟内逐渐从红色变为深紫色。
6. 将肾脏移至腹膜后间隙。在对侧重复该过程，以暴露并夹住右肾蒂。
7. 分别记录每一侧的缺血时间，以确保两个肾脏都能接收到确切的缺血持续时间。在缺血持续时间结束时重新打开切口并松开血管夹。
8. 将肾脏置换到腹膜后间隙，然后用 Vijol 4-0 缝合线逐层缝合肌肉和皮肤。
   注意：外科手术应在无菌条件下进行。手术过程中需要时用 75% 乙醇清洁手术台和器械。

3. 术后护理

1. 通过腹膜内注射给予 0.5-1 mL 温热无菌盐水以补偿液体损失。
2. 保持胸骨卧姿，直到小鼠恢复足够的意识。将鼠标放在恒温毯上，直到它完全清醒，然后回到笼子里。在完全恢复之前，不要将老鼠归还给其他动物。
3. 前 3 天每 12 小时给予丁丙诺啡 0.05-0.10 mg/kg，以减轻术后疼痛。每天监测手术小鼠。

4. 模型评估

1. 苏木精-伊红 （HE） 染色
   1. 在 IRI 后第 1 天、第 3 天、第 7 天或第 14 天通过腹膜内注射使用戊巴比妥钠对动物实施安乐死。
   2. 用 4% 多聚甲醛 （PFA） 固定新鲜的肾组织过夜，并在 4 °C 下储存在 75% 乙醇中。
   3. 脱水包埋后，将获得的样品切成 8 μm 厚进行染色。
   4. 在二甲苯中脱蜡组织切片，然后用浓度降低的乙醇再水化。
   5. 用苏木精和伊红对组织切片进行染色。
   6. 通过增加乙醇和二甲苯的浓度使组织切片脱水。
2. 肾功能检测
   1. 麻醉后使用眼球采血方法采集血样。
   2. 将血液样品以 12000 x g 离心 10 分钟以分离血清。
   3. 通过自动干化学分析仪测定血清肌酐和血尿素氮 （BUN），以监测肾功能。
3. 实时荧光定量 PCR （RT-PCR）
   1. 使用快速 RNA 提取试剂盒从肾组织中提取总 RNA，然后用逆转录酶混合物试剂盒合成 cDNA。使用 SYBR Green Premix 试剂盒进行 RT-PCR，并在 RT-PCR 仪器上运行。此处使用的引物序列在¹⁴ 日之前报道：KIM1 向前，5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3';反向 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3';NGAL 前锋，5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3;反向 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3';GAPDH 正向，5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3';反向 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。

手术期间的肾脏状态

成功缺血的特点是肾脏在 1-2 min内逐渐由红色变为深紫色，成功再灌注的特点是肾脏在 1-2 min内逐渐由深紫色变为红色。

手术后肾脏的组织学

HE 和过碘酸希夫 （PAS） 染色是验证急性肾损伤的直接方法。在缺血再灌注损伤模型中，主要受伤部位是近端肾小管的 S3 ?...

在本文中，我们提供了肾脏 IRI 模型的详细程序，随后强调它是 AKI 和 AKI 进展为 CKD 的稳健模型。此外，我们还展示了肾损伤的两个主要标准的影响，包括肾脏组织学和功能。

要获得可重复且可靠的模型，需要强调外科手术中的几个关键点。对于腹部手术，建议在中线切口处露出肾脏，以尽量减少与手术相关的创伤。由于腹膜后脂肪，很难完全解剖?...

作者声明没有利益冲突。

我们感谢所有参与者在当前研究中的合作。本研究得到了浙江省自然科学基金 （LZ22H050001） 和浙江省高层次创新健康人才培养计划对林伟强的资助。