Modello bilaterale di ischemia-riperfusione renale per danno renale acuto nei topi

Il modello di danno da ischemia-riperfusione (IRI) può essere utilizzato in diverse fasi dello sviluppo del danno renale acuto (AKI), specialmente durante la progressione da AKI a malattia renale cronica (CKD). Qui, descriviamo la procedura per lo sviluppo del modello IRI nei topi tramite un approccio trans-addominale, bloccando i peduncoli renali tramite una clip vascolare per indurre il danno ischemico.

Il danno renale acuto (AKI) è definito come un rapido declino della funzione renale, in cui la disfunzione renale persistente progredisce gradualmente verso la malattia renale cronica (CKD) a causa della perdita irreversibile di nefroni e della loro riparazione disadattiva. Negli ultimi anni, l'incidenza dell'AKI è aumentata per quanto riguarda diverse eziologie, tra cui deplezione di volume, sepsi, nefrotossicità, lesioni muscolari e traumi maggiori, in cui la lesione da ischemia-riperfusione (IRI) rappresenta la maggior parte degli episodi. Lo sviluppo del modello IRI nei topi è indotto dal clampaggio chirurgico dei peduncoli renali, che fornisce strumenti potenti e controllabili per modelli preclinici di AKI. È importante sottolineare che il modello IRI viene implementato in diverse fasi dello sviluppo dell'AKI, in particolare nei processi da AKI a CKD. Nonostante il modello IRI sia ampiamente praticato in molti laboratori, una serie di variabili influenzano ancora i risultati di questo modello. Qui, descriviamo la procedura di sviluppo del modello IRI per fornire un metodo ripetibile e affidabile ai ricercatori per esplorare la patogenesi sottostante nello sviluppo di AKI e la progressione di AKI in CKD.

Il danno renale acuto (AKI) è una sindrome clinica grave con morbilità e mortalità significative, definite come un aumento della creatinina sierica di ≥ 0,3 mg/dL (26,5 μM/L) entro 48 ore o un aumento della creatinina sierica a ≥ 1,5 volte il basale entro 7 giorni, o volume delle urine < 0,5 mL/kg/h per 6 ore^{1, 2,3}. Nonostante decenni di ricerca, manca una terapia efficace per l'AKI in grado di alleviare il danno renale o accelerare il recupero renale e una percentuale considerevole di pazienti con AKI progredisce verso la malattia renale cronica (CKD)^4,5,6. Molecole e percorsi complessi sono coinvolti nell'AKI e nella sua progressione in parte, quindi i modelli preclinici forniscono potenti strumenti per svelare queste complessità per lo sviluppo di modalità terapeutiche efficienti.

Clinicamente, la lesione da ischemia-riperfusione (IRI) è la principale causa di AKI in varie condizioni, tra cui interventi chirurgici cardiaci ed epatici, shock circolatorio, deplezione di volume, sepsi, occlusione o ostruzione vascolare renale, trapianto di rene e così via⁷. Il modello di topo IRI-AKI è in uso dagli anni '60; Questo modello è stato sviluppato mediante clampaggio chirurgico dei peduncoli renali con pinze non traumatiche nei topi che hanno portato all'ischemia e seguito da riperfusione del flusso sanguigno renale rimuovendo le pinze. Il modello IRI-AKI è tipicamente caratterizzato da morte delle cellule tubulari renali e danno progressivo al tessuto renale. L'IRI è uno dei modelli più comuni utilizzati per la patogenesi e l'intervento terapeutico nell'AKI per diversi motivi: (1) La semplicità e la sicurezza della procedura chirurgica migliorano il tasso di sopravvivenza e il tasso di successo del modello IRI-AKI⁸; (2) Poiché l'ischemia è una delle principali eziologie nell'AKI umana, il modello IRI-AKI è meglio utilizzato per valutare l'evento clinico^{AKI 9}; (3) Il modello IRI potrebbe presentare danni renali e cambiamenti istopatologici in diversi stadi di AKI, che è applicabile anche allo studio della progressione da AKI a CKD¹⁰. A seconda del disegno sperimentale, i modelli di AKI indotta da IRI includono IRI bilaterale, IRI unilaterale con rene controlaterale intatto e IRI unilaterale con nefrectomia controlaterale simultanea. In particolare, il modello IRI bilaterale è considerato più rilevante per le condizioni patologiche umane di AKI perché entrambi i reni sono stati colpiti dall'afflusso di sangue¹¹. Il modello IRI è applicabile per simulare gli effetti della riduzione del flusso sanguigno renale dopo trapianto di rene, bypass cardiaco, chirurgia vascolare renale o nephron-sparing, nonché nel contesto dell'ipotensione⁹. Qui, descriviamo la procedura per un modello IRI bilaterale per fornire un metodo coerente e affidabile ai ricercatori per esplorare la patogenesi sottostante nell'AKI indotta da ischemia.

Topi maschi C57BL/6J di 8 settimane di età e del peso di 25 g sono stati utilizzati per stabilire il modello AKI mediante ischemia-riperfusione bilaterale. Come da studi precedenti, manteniamo la temperatura corporea a circa 36,5 °C-37 °C e la durata dell'ischemia renale è di 30 minuti nell'intervento IRI^12,13. Erano necessari un totale di 6 topi per ogni gruppo e i topi azionati da sham fungevano da controlli. Gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università di Zhejiang per proteggere il benessere degli animali. Tutte le procedure di ricerca sugli animali sono state eseguite seguendo le linee guida e i principi etici dell'Università di Zhejiang.

1. Preparazione pre-operatoria

1. Sterilizza ad alta pressione tutti gli strumenti chirurgici.
2. Preparare la soluzione anestetica aggiungendo 2 ml di ketamina e 0,4 ml di xilazina in 7,6 ml di soluzione fisiologica sterile. Anestetizzare il topo con una miscela di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale. Valutare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
3. Posizionare il topo anestetizzato sulla coperta omeotermica per assicurarsi che le sue vie aeree rimangano libere. Mantenere la temperatura corporea nell'intervallo 36,5-37 °C.
4. Copri gli occhi del topo con unguento per gli occhi all'1% di tetraciclina cloridrato per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
5. Radere i peli dell'addome con un tagliacapelli e pulire la pelle dell'area chirurgica con una soluzione di iodio povidone per 3x.

2. Chirurgia

1. Praticare un'incisione mediana addominale di circa 1-1,5 cm con le forbici chirurgiche attraverso la pelle e lo strato muscolare e aprire la cavità addominale con un divaricatore.
2. Esporre il rene spostando il grasso retroperitoneale e spingendo l'intestino e gli altri organi verso il fuorigioco con un batuffolo di cotone. Il rene si trova nello spazio retroperitoneale, a circa 0,5 cm lateralmente alla colonna vertebrale e sotto la^13a costola.
3. Sezionare il peduncolo renale con una pinza a punta fine per separare e rimuovere la fascia e il tessuto adiposo ed esporre i peduncoli renali sinistri.
4. Bloccare i peduncoli renali con una clip vascolare utilizzando una pinza di tenuta e assicurarsi che il danno vascolare sia il più lieve possibile. Evitare di bloccare il grasso ridondante del seno renale, che può portare a un'ischemia renale incompleta.
5. Impostare la durata dell'ischemia renale, iniziando con il clampaggio per 30 minuti. La caratteristica dell'ischemia di successo è che il rene passa gradualmente dal rosso al viola intenso in pochi minuti.
6. Spostare il rene nello spazio retroperitoneale. Ripetere la procedura sul lato controlaterale per esporre e bloccare i peduncoli renali destri.
7. Registrare il tempo di ischemia su ciascun lato separatamente per assicurarsi che entrambi i reni ricevano l'esatta durata dell'ischemia. Riaprire l'incisione e rilasciare la clip vascolare al termine della durata dell'ischemia.
8. Riposizionare il rene nello spazio retroperitoneale, quindi suturare il muscolo e la pelle strato per strato con la sutura Vicryl 4-0.
   NOTA: Le procedure chirurgiche devono essere eseguite in condizioni sterili. Pulire il tavolo operatorio e gli strumenti con etanolo al 75% durante il funzionamento, quando necessario.

3. Assistenza post-operatoria

1. Somministrare 0,5-1 ml di soluzione fisiologica calda e sterile mediante iniezione intraperitoneale per compensare la perdita di liquidi.
2. Mantenere la decubito sternale con attenzione fino a quando il topo non ha riacquistato sufficiente coscienza. Metti il topo sulla coperta omeotermica fino a quando non riprende piena coscienza, quindi torna nella sua gabbia. Non restituire il topo alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
3. Somministrare buprenorfina 0,05-0,10 mg/kg ogni 12 ore per i primi 3 giorni per alleviare il dolore post-operatorio. Monitora i topi chirurgici ogni giorno.

4. Valutazione del modello

1. Colorazione con ematossilina-eosina (HE)
   1. Eutanasia degli animali con pentobarbital sodico mediante iniezione intraperitoneale nei giorni 1, 3, 7 o 14 dopo l'IRI.
   2. Fissare i tessuti renali freschi con paraformaldeide (PFA) al 4% per una notte e conservare in etanolo al 75% a 4 °C.
   3. Dopo la disidratazione e l'inclusione, tagliare i campioni ottenuti in uno spessore di 8 μm per la colorazione.
   4. Decerare le sezioni di tessuto in xilene, quindi reidratare con concentrazioni decrescenti di etanolo.
   5. Colorare le sezioni di tessuto con ematossilina ed eosina.
   6. Disidratare le sezioni di tessuto aumentando le concentrazioni di etanolo e xilene.
2. Dosaggio della funzionalità renale
   1. Raccogliere campioni di sangue utilizzando il metodo di raccolta del sangue del bulbo oculare dopo l'anestesia.
   2. Centrifugare campioni di sangue a 12000 x g per 10 minuti per separare il siero.
   3. Determinare la creatinina sierica e l'azoto ureico nel sangue (BUN) mediante l'analizzatore automatico di chimica a secco per monitorare la funzionalità renale.
3. PCR in tempo reale (RT-PCR)
   1. Estrarre l'RNA totale dai tessuti renali utilizzando un kit di estrazione rapida dell'RNA, quindi sintetizzare il cDNA con un kit di miscelazione per trascrittasi inversa. Eseguire la RT-PCR con il kit SYBR Green Premix ed eseguire l'esecuzione sullo strumento RT-PCR. Le sequenze di primer qui utilizzate sono state riportate prima del¹⁴: KIM1 forward, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; inverso 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'; NGAL in avanti, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; rovescio 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3'; GAPDH in avanti, 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'; inverso 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

Stato del rene durante l'intervento chirurgico

La caratteristica dell'ischemia di successo è che il rene cambia gradualmente da rosso a viola intenso entro 1-2 minuti e la riperfusione di successo è caratterizzata dal rene che passa gradualmente dal viola intenso al rosso entro 1-2 minuti.

Istologia del rene dopo l'intervento chirurgico

L'HE e la colorazione con acido p...

In questo articolo, abbiamo fornito una procedura dettagliata sul modello IRI renale, evidenziando successivamente che si tratta di un modello robusto per la progressione di AKI e AKI a CKD. Inoltre, dimostriamo l'impatto dei due principali criteri di danno renale, tra cui l'istologia e la funzione renale.

Diversi punti chiave nelle procedure chirurgiche devono essere enfatizzati per un modello ripetibile e affidabile. Per la chirurgia addominale, si consiglia...

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Esprimiamo il nostro apprezzamento a tutti i partecipanti per la loro collaborazione nel presente studio. Questo studio è stato supportato dal finanziamento della Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LZ22H050001) e dal programma provinciale di Zhejiang per la coltivazione di talenti di salute innovativa di alto livello a Weiqiang Lin.