نموذج نقص التروية الكلوي الثنائي لإصابة الكلى الحادة في الفئران

يمكن استخدام نموذج إصابة نقص التروية وإعادة التروية (IRI) في مراحل مختلفة من تطور إصابة الكلى الحادة (AKI) ، خاصة أثناء تطور AKI إلى مرض الكلى المزمن (CKD). هنا ، نصف إجراء تطوير نموذج IRI في الفئران عبر نهج عبر البطن ، وتثبيت العنق الكلوي عبر مقطع الأوعية الدموية للحث على إصابة إقفارية.

تعرف إصابة الكلى الحادة (AKI) بأنها انخفاض سريع في وظائف الكلى ، حيث يتطور الخلل الكلوي المستمر تدريجيا إلى مرض الكلى المزمن (CKD) بسبب الفقدان الذي لا رجعة فيه للنفرون وإصلاحها غير القابل للتكيف. في السنوات الأخيرة ، ازداد معدل الإصابة ب AKI فيما يتعلق بمسببات متنوعة ، بما في ذلك استنفاد الحجم ، والإنتان ، والسمية الكلوية ، وإصابة العضلات ، والصدمات الكبرى ، حيث تمثل إصابة نقص التروية وإعادة التروية (IRI) معظم الحلقات. يتم تطوير نموذج IRI في الفئران عن طريق التثبيت الجراحي للعنيق الكلوي ، والذي يوفر أدوات قوية ويمكن التحكم فيها للنماذج قبل السريرية ل AKI. الأهم من ذلك ، يتم نشر نموذج IRI في مراحل مختلفة من تطوير AKI ، خاصة في عمليات AKI إلى CKD. على الرغم من أن نموذج IRI يمارس على نطاق واسع في العديد من المختبرات ، إلا أن سلسلة من المتغيرات لا تزال تؤثر على نتائج هذا النموذج. هنا ، نصف إجراء تطوير نموذج IRI لتوفير طريقة قابلة للتكرار وموثوقة للباحثين لاستكشاف التسبب في المرض الأساسي في تطوير AKI وتطور AKI إلى CKD.

إصابة الكلى الحادة (AKI) هي متلازمة سريرية وخيمة ذات مراضة ووفيات كبيرة ، تعرف بأنها زيادة في الكرياتينين في المصل بمقدار ≥ 0.3 مجم / ديسيلتر (26.5 ميكرومتر / لتر) خلال 48 ساعة أو زيادة في الكرياتينين في الدم إلى ≥ 1.5 مرة خط الأساس خلال 7 أيام ، أو حجم البول < 0.5 مل / كجم / ساعة لمدة 6 ساعات^{1 ، 2،3}. على الرغم من عقود من البحث ، فإن العلاج الفعال ل AKI يفتقر إلى التخفيف من تلف الكلى أو تسريع تعافي الكلى ، وتتطور نسبة كبيرة من مرضى AKI إلى مرض الكلى المزمن (CKD) ^4،5،6. تشارك الجزيئات والمسارات المعقدة في AKI وتطورها جزئيا ، لذا توفر النماذج قبل السريرية أدوات قوية لكشف هذه التعقيدات لتطوير طرائق علاجية فعالة.

سريريا ، تعد إصابة نقص التروية وإعادة التروية (IRI) هي السبب الرئيسي ل AKI في حالات مختلفة ، بما في ذلك جراحات القلب والكبد ، والصدمة الدورية ، واستنفاد الحجم ، والإنتان ، وانسداد الأوعية الدموية الكلوية أو انسدادها ، وزرع الكلى ، وما إلى^{ذلك 7}. تم استخدام نموذج الماوس IRI-AKI منذ الستينيات. تم تطوير هذا النموذج عن طريق التثبيت الجراحي للعنيق الكلوي بمشابك غير مؤلمة في الفئران مما يؤدي إلى نقص التروية ويليه إعادة تروية تدفق الدم الكلوي عن طريق إزالة المشابك. يتميز نموذج IRI-AKI عادة بموت الخلايا الأنبوبية الكلوية وتلف أنسجة الكلى التدريجي. يعد IRI أحد أكثر النماذج شيوعا المستخدمة في التسبب في المرض والتدخل العلاجي في AKI لعدة أسباب: (1) تعمل بساطة وسلامة الإجراء الجراحي على تحسين معدل البقاء على قيد الحياة ومعدل نجاح نموذج^{IRI-AKI 8} ؛ (2) نظرا لأن نقص التروية هو سبب رئيسي في AKI البشري ، فإن نموذج IRI-AKI يستخدم بشكل أفضل لتقييم حدث AKI^{السريري 9} ؛ (3) يمكن أن يقدم نموذج IRI إصابات الكلى وتغيرات في علم الأنسجة في مراحل مختلفة من AKI ، وهو ما ينطبق أيضا على دراسة التقدم من AKI إلى CKD¹⁰. اعتمادا على التصميم التجريبي ، تشتمل نماذج AKI التي يسببها IRI على IRI الثنائي ، وIRI أحادي الجانب مع الكلى المقابلة السليمة ، وIRI أحادي الجانب مع استئصال الكلية المقابل المتزامن. والجدير بالذكر أن نموذج IRI الثنائي يعتبر أكثر صلة بالحالات المرضية البشرية ل AKI لأن كلتا الكليتين قد تأثرتا بإمدادات الدم¹¹. نموذج IRI قابل للتطبيق لمحاكاة آثار انخفاض تدفق الدم الكلوي بعد زراعة الكلى ، أو المجازة القلبية ، أو الأوعية الدموية الكلوية ، أو جراحة استبقاء الكلى ، وكذلك في وضع انخفاض ضغط^{الدم 9}. هنا ، نصف الإجراء الخاص بنموذج IRI الثنائي لتوفير طريقة متسقة وموثوقة للباحثين لاستكشاف التسبب في التسبب في AKI الناجم عن نقص التروية.

تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J في عمر 8 أسابيع ووزنها 25 جراما لإنشاء نموذج AKI عن طريق نقص التروية الثنائي. وفقا للدراسات السابقة ، نحافظ على درجة حرارة الجسم عند حوالي 36.5 درجة مئوية -37 درجة مئوية ، ومدة نقص تروية الكلى 30 دقيقة في جراحة IRI^12،13. كانت هناك حاجة إلى ما مجموعه 6 فئران لكل مجموعة ، وكانت الفئران التي تعمل بشكل زائف بمثابة ضوابط. تمت الموافقة على التجارب على في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) بجامعة تشجيانغ لحماية رفاهية. تم تنفيذ جميع إجراءات البحث على وفقا للمبادئ التوجيهية والمبادئ الأخلاقية لجامعة تشجيانغ.

1. التحضير قبل الجراحة

1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية بالضغط العالي.
2. تحضير محلول التخدير بإضافة 2 مل من الكيتامين و 0.4 مل من الزيلازين في 7.6 مل من محلول ملحي معقم. تخدير الفأر بمزيج من الكيتامين (80 ملغم/كغ) والزيلازين (16 ملغم/كغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق. قم بتقييم عمق التخدير باستخدام منعكس قرصة إصبع القدم.
3. ضع الفأر المخدر على بطانية الحرارة المنزلية لضمان بقاء مجرى الهواء دون عائق. الحفاظ على درجة حرارة الجسم في حدود 36.5-37 درجة مئوية.
4. قم بتغطية عيني الفأر بمرهم عين 1٪ من التتراسيكلين هيدروكلوريد لمنع الجفاف أثناء التخدير.
5. احلق شعر البطن باستخدام ماكينة قص الشعر ونظف جلد المنطقة الجراحية بمحلول بوفيدون اليود لمدة 3 مرات.

2. الجراحة

1. قم بعمل شق متوسط في البطن حوالي 1-1.5 سم بمقص جراحي عبر طبقة الجلد والعضلات وافتح تجويف البطن باستخدام موزعة.
2. كشف الكلى عن طريق تحريك الدهون خلف الصفاق ودفع الأمعاء والأعضاء الأخرى إلى التسلل باستخدام قطعة قطن. تقع الكلية في الفضاء خلف الصفاق ، على بعد حوالي 0.5 سم من العمود الفقري ، وتحت^الضلع 13.
3. قم بتشريح عنيق الكلى باستخدام ملقط مدبب ناعم لفصل وإزالة اللفافة والأنسجة الدهنية وفضح عنيق الكلى الأيسر.
4. قم بتثبيت العنق الكلوي بمشبك الأوعية الدموية باستخدام ملقط الإمساك وتأكد من أن تلف الأوعية الدموية طفيف قدر الإمكان. تجنب لقط دهون الجيوب الأنفية الكلوية الزائدة عن الحاجة ، مما قد يؤدي إلى نقص تروية الكلى غير المكتمل.
5. اضبط مدة نقص تروية الكلى ، بدءا من التثبيت لمدة 30 دقيقة. من سمات نقص التروية الناجح أن الكلى تتغير تدريجيا من الأحمر إلى الأرجواني الغامق في غضون بضع دقائق.
6. انقل الكلى إلى الفضاء خلف الصفاق. كرر الإجراء على الجانب المقابل لكشف وتثبيت العنقيق الكلوي الأيمن.
7. سجل وقت نقص التروية على كل جانب على حدة للتأكد من أن كلتا الكليتين تتلقى المدة الدقيقة لنقص التروية. أعد فتح الشق وحرر مشبك الأوعية الدموية في نهاية مدة نقص التروية.
8. استبدل الكلية في الفضاء خلف الصفاق ، ثم قم بخياطة العضلات والجلد طبقة تلو الأخرى باستخدام خياطة Vicryl 4-0.
   ملاحظة: يجب إجراء العمليات الجراحية في ظروف معقمة. نظف طاولة الجراحة والأدوات التي تحتوي على 75٪ من الإيثانول أثناء التشغيل عند الحاجة.

3. رعاية ما بعد الجراحة

1. يجب تطبيق 0.5-1 مل من المحلول الملحي الدافئ والمعقم عن طريق الحقن داخل الصفاق للتعويض عن فقدان السوائل.
2. حافظ على الاستلقاء القصي باهتمام حتى يستعيد الفأر وعيا كافيا. ضع الفأر على بطانية الحرارة المنزلية حتى يكتسب وعيه الكامل ، ثم عد إلى قفصه. لا تعيد الفأر إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما.
3. أعط البوبرينورفين 0.05-0.10 مجم / كجم كل 12 ساعة لأول 3 أيام لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. راقب الفئران الجراحية كل يوم.

4. تقييم النموذج

1. تلطيخ الهيماتوكسيلين - إيوزين (HE)
   1. القتل الرحيم للحيوانات باستخدام البنتوباربيتال الصوديوم عن طريق الحقن داخل الصفاق في الأيام 1 أو 3 أو 7 أو 14 بعد الإير.
   2. قم بإصلاح أنسجة الكلى الطازجة بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) طوال الليل ، وقم بتخزينها في 75٪ إيثانول عند 4 درجات مئوية.
   3. بعد الجفاف والتضمين ، قم بتقطيع العينات التي تم الحصول عليها إلى سمك 8 ميكرومتر للتلوين.
   4. قم بإزالة الشمع من أقسام الأنسجة في الزيلين ، ثم أعد ترطيبها مع انخفاض تركيزات الإيثانول.
   5. تلطخ أقسام الأنسجة بالهيماتوكسيلين واليوزين.
   6. تجفيف أقسام الأنسجة عن طريق زيادة تركيزات الإيثانول والزيلين.
2. فحص وظائف الكلى
   1. جمع عينات الدم باستخدام طريقة جمع الدم في مقلة العين بعد التخدير.
   2. عينات دم أجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 10 دقائق لفصل المصل.
   3. تحديد الكرياتينين في الدم ونيتروجين اليوريا في الدم (BUN) بواسطة محلل الكيمياء الجافة الأوتوماتيكي لمراقبة وظيفة الكلى.
3. تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (RT-PCR)
   1. استخرج الحمض النووي الريبي الكلي الكلي من أنسجة الكلى باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي السريع ، ثم قم بتصنيع (كدنا) باستخدام مجموعة مزيج النسخ العكسي. قم بإجراء RT-PCR باستخدام مجموعة SYBR Green Premix Kit وتشغيلها على أداة RT-PCR. تم الإبلاغ عن التسلسلات التمهيدية المستخدمة هنا قبل¹⁴: KIM1 إلى الأمام ، 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3 '; عكس 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3 '; NGAL إلى الأمام ، 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3 ؛ عكس 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3 '; GAPDH إلى الأمام ، 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3 '؛ عكس 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

حالة الكلى أثناء الجراحة

تتمثل سمة نقص التروية الناجحة في أن الكلى تتغير تدريجيا من الأحمر إلى الأرجواني الغامق في غضون 1-2 دقيقة ، وتتميز إعادة التروية الناجحة بتغير الكلى تدريجيا من اللون الأرجواني الغامق إلى الأحمر في غضون 1-2 دقيقة.

في هذه الورقة ، قدمنا إجراء مفصلا حول نموذج IRI الكلوي ، مما أبرزنا لاحقا أنه نموذج قوي لتقدم AKI و AKI إلى CKD. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح تأثير المعيارين الرئيسيين لإصابة الكلى ، بما في ذلك أنسجة الكلى ووظيفتها.

يجب التأكيد على العديد من النقاط الرئيسية في العمليا?...

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

نعرب عن تقديرنا لجميع المشاركين على تعاونهم في الدراسة الحالية. تم دعم هذه الدراسة بتمويل من مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة تشجيانغ في الصين (LZ22H050001) وبرنامج مقاطعة تشجيانغ لتنمية المواهب الصحية المبتكرة عالية المستوى إلى Weiqiang Lin.