Solucan, Lumbricus Terrestris: Yeni Bir Mikroenjeksiyon Damar Sistemi İn vivo Omurgasız Modeli

Solucanlar, damar sistemi çalışmaları için in vivo tezgah üstü yeni bir omurgasız modelidir. Solucan damar sistemine etkili cerrahi ve mikroenjeksiyona izin veren teknikler ve ekipmanlar sunuyoruz. Cerrahi protokoller, mikroenjeksiyon teknikleri ve ısmarlama mikropipetlerin üretilmesi için prosedür anlatılmaktadır.

Omurgalılar biyomedikal araştırmalar için vazgeçilmez olsa da, çalışmalar genellikle maliyet, uzun iç inceleme ve etik hususlar gibi faktörlerle sınırlıdır. Solucanı, belirli ön vaskülatür çalışmalarına uygulanabilen alternatif, düşük maliyetli, omurgasız bir hayvan olarak sunuyoruz. Solucanın dorsal damarlarının, ventral damarlarının ve beş çift sahte kalbin cerrahi mevcudiyeti nedeniyle, solucanlara kolayca erişilebilir, düşük maliyetli bakım sunar ve belirli bir bileşiğin yalnızca küçük dozlarının uygulanmasını gerektirir. Solucan modeli, insan kanına benzer bir hemoglobin yapısına sahip basit bir kapalı vasküler dolaşım sistemi sağlar. Solucanların uyuşturulması ve ilgili kan damarlarını ortaya çıkarmak için cerrahi insizyonların yapılması için bir protokol sağlanmıştır. Bileşik uygulama için mikropipetler, camın bir pipet çektirme ile ısıtılması ve çekilmesi ve mikron ölçeğinde ince bir iğne ucu oluşturmak için bir eğim sistemi kullanılmasıyla oluşturulur. Uçlar daha sonra bir mikropozisyoner ve mikroenjektör ile birlikte, büyük numune boyutlarının ve küçük bileşik hacimlerinin mevcudiyeti ile tekrar tekrar bir solucanın vasküler sistemine rastgele bileşikler enjekte etmek için kullanılır. Enjeksiyon prosedürünün incelikleri ile ilgili ayrıntılar verilmiştir. Solucanın küçük damar boyutu, özellikle ventral damar söz konusu olduğunda zorlayıcıdır; Bununla birlikte, sunulan tekniklere hakimiyet, düşük maliyetli bir çözüm olarak yüksek tekrarlanabilirlik sunarak çok büyük örneklem büyüklüğündeki çalışmaları pratik hale getirir.

Solucan, önceki bilimsel uygulamalar için önemli bir biyoindikatör ve biyo-tahlil olarak kullanılmıştır 1,2,3,4,5,6; Topraktaki biyositler (böcek öldürücüler) ve olumsuz ekotoksikolojik etkiler^gibi yerinde ve biyoakümülasyon çalışmaları için karasal ortamlarda tehlikeli ve toksik atıklardan kaynaklanan biyolojik riskleri değerlendirmek için ideal bir organizmadır 7,8,9,10. Ek olarak, biyoprospektif nedeniyle, solucan fibrinolitik, anti-pıhtılaştırıcı, anti-mikrobiyal ve anti-kanser moleküllerinin alternatif bir kaynağıdır^11,12; 1991'de bir ekibin solucan derisinden lumbrisin çıkarıp saflaştırdığı ve SHN farelerinin meme tümörlerine yerleştirdiği ve bu da tümör büyümesinin inhibisyonuna yol açtığı^{noktaya kadar 13}. Solucan aynı zamanda pedagojik olarak yararlı bir hayvan modelidir, çünkü öğrencileri ameliyata maruz bırakmak ve bir örneğin anatomisini anlamak için kullanılabilir; kan dolaşımını incelemekten elektrofizyolojiye^{kadar 14,15}.

Kendi araştırmamızda, canlı solucanların damarlarının yüksek yoğunluklu ultrasona verdiği tepkiyi inceledik¹⁸. Solucandaki damar yırtılmasının, insan mikro damarlarındaki yırtılma hasarında ilişkilendirdiğimize benzer koşullar altında meydana geldiğini bulduk. Devam eden çalışmamız, solucan damar sistemine mikro kabarcıkların enjekte edilmesini içerir. Mikro kabarcıklar, bir lipit, albümin veya polimer kabuk ile kaplanmış ağır bir gazdan oluşur, bu ajanlar görüntü kontrast ajanları ve hedefe yönelik ilaç dağıtımı için araçlar olarak kullanılabilir.

Bu yeni protokol, solucanın doğal biyoindikatörlerini kullanabilecek bir bileşiğin intravenöz (IV) enjeksiyonundan fayda sağlayacak herhangi bir çalışma ile ilgilidir. Yaklaşım, solucanın beş çift yalancı kalbi, dorsal damar ve ventral damar dahil olmak üzere birkaç olası giriş noktasından birine IV mikroenjeksiyona dayanmaktadır. Prosedür, damarları ortaya çıkarmak için ayrıntılı bir cerrahi kesi ve ardından mikro konumlandırıcı kontrollü bir enjeksiyonu içerir. Bu, solucan vasküler mikroenjeksiyonu için özel olarak yapılmış özel mikropipetler kullanılarak elde edilir. Bu mikropipetler, 90 μm çapında bir ventral damar kadar küçük damarların hassas bir şekilde hedeflenmesini sağlar.

Bu protokol, solucan kanı ve idrarının çıkarılması için 1948 yılında yapılan bir çalışma da dahil olmak üzere daha önceki mikro pipetleme tekniklerini geliştirmek için tasarlanmıştır¹⁶. Şekil S1'de görüldüğü gibi, bu çıkarma işleminin kurulumu zor olabilir ve yazar tarafından belirtildiği gibi bir saat veya daha uzun sürebilir. Benzer bir yöntem 1970 yılında geliştirildi, ancak yazar, solucanın¹⁷ dev liflerine sıvı enjekte ederken çok sayıda kırık uç yaşadı. Aşağıda açıklanan mevcut yöntemde, kanın çıkarılması saniyeler ila dakikalar meselesidir ve hem bileşiklerin enjeksiyonu hem de solucan sıvılarının ekstraksiyonu ile ilgilidir. Bu özel durumda, kontrast maddeleri, mikro kabarcıkları enjekte ettik.

1. Mikropipet hazırlama: cam ve eğim ucu çekme

1. Mikropipet çekme
   1. Mikropipet çekiciyi açın ve solucan mikroenjeksiyonu için belirli parametreleri girmek üzere bir program seçin.
   2. Parametreleri Basınç=500, Çekme=75, Zaman=250, Isı=336 ve Hız=70 olarak ayarlayın. Sonuçlar çektirmeden çektirmeye değişebilir; Bu nedenle, istenen ucu elde etmek için parametrelerle denemeler yapın (boyut, keskinlik, şekil vb.).
   3. Mikropipetleri çekmeden önce ısı değerini belirlemek için bir RAMP testi yaptığınızdan emin olun, çünkü bunun yapılmaması oluk filamentinin yanmasına veya camın kırılmasına neden olabilir.
   4. Hava basıncının değiştirilmesi gerekiyorsa, temizleme düğmesine basın, tüm değerlerin silinmesi istendiğinde hayır (0) öğesini seçin ve basıncı değiştir (2) öğesini seçin. Bu işlem çektirmeden çektirmeye değişebilir; Bu nedenle, basınç ayarlarını değiştirmek için cihaz kılavuzuna bakın.
   5. Mikropipet çektirme kapağını açın ve çektirmeye bir mikropipet yükleyin. Kullanılan mikropipet camı, filament pipetli borosilikat camdı: 10 cm uzunluğunda, dış çapı: 1,5 mm ve iç çapı: 0,86 mm.
   6. Pipetin ucu pipet tutucunun ucuyla aynı hizaya gelene kadar pipeti sağdan pipet yarığı boyunca V oluğuna kaydırın. Pipetin filament boyunca karşı tarafa hareket edebilmesini sağlamak için, pipeti pipet yarığı üzerinde durduğundan emin olarak mümkün olduğunca itin.
   7. Pipeti kilitlemek için sağ taraftaki düğmeyi sıkın ve kilitli sistemi, filamentten çektirmenin diğer tarafına ulaşana kadar pipetle birlikte kaydırın. Son olarak, pipetin sol tarafını çektirmeye kilitleyin. Pipet filamentin ortasında olmalıdır; Pipetin nasıl düzgün şekilde hizalanacağına ilişkin talimatlar için kılavuza bakın.
   8. Pipet yüklendikten sonra çektirmeyi kapatın, çekme düğmesine basın ve ortaya çıkan iki pipeti çıkarmadan önce pipetin çekilmesini bekleyin.
   9. Pipetleri çıkarmak için düğmeleri gevşetin ve yarıktan çıkarırken pipetleri klipslememeye dikkat edin.
   10. Mikropipeti yerinde tutmak ve çekilen mikropipetleri kırmadan kolay döndürmeye izin vermek için çekilen mikropipetleri bir mikropipet tutucusuna veya bir tür desteğe yerleştirin. Bir makine atölyesinde oluşturulabilen ve hatta 3D olarak yazdırılabilen kendi mikropipet tutucumuzu geliştirdik.
       NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
   11. Mikropipet tutucuyu mikroskobun altına yerleştirin ve çekilen mikropipetlerin resmini çekmek ve uçtan ~1000 mm ve ~50 mm büyütme kullanarak uç çapını kaydetmek için bir kamera programı veya benzeri bir yazılım kullanın.
   12. Bir resim çekmeden önce, özellikle görüntüleme sonrası ölçümlerde doğru ölçüm yapmak için kamera ayarlarının mikroskop ayarıyla (10x) eşleştiğinden emin olun. 10x ayarı, ekranın üst kısmına yakın bir yerde bulunan yatay araç çubuğu şeridinde bulunur.
   13. Mikropipetin resmini görüntülemek ve çekmek için, sol üst köşede bulunan kamera yazılımında kamerayı seçin ve doğru bir okuma elde etmek için uca odaklandıktan sonra Tutturma düğmesine basın. Tutturma düğmesi, sayfanın sol tarafında, kamera sekmesinin altındaki yatay araç çubuğunda bulunur.
   14. İstenen uç boyutuna ve kıvamına ulaşılıp ulaşılmadığını belirlemek için çekilen mikropipetlerin ölçümlerini alın. Çektirmenin ve parametrelerinin tutarlı bir şekilde istenen boyutu üretip üretmediğini belirlemek için 5 pipete kadar çekmek yeterlidir. İstenen uç boyutuna ulaşılamadıysa, boyutlandırma pipete göre değişmeye devam ederse, araştırmacının istenen uç boyutu elde edilene kadar farklı ayarlarla denemeler yapması gerekebilir veya pipet çektirme kılavuzunun referansını gerektirebilecek filamenti ve pipet yerleşimini sabitlemek gerekebilir.
       NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
2. Mikropipeti eğim verecek şekilde ayarlama ve elektrot empedans ölçeri kullanma
   1. Çekilen mikropipetlere eğim vermek için, elektrot empedans ölçer ve 40x stereo mikroskop içeren bir mikropipet düzenleyici kullanın.
      NOT: Diğer eğim açı açıları kullanılabilir; Şirket içi eğim verme makineleri bile başarılıdır, ayrıca eğim verme işlemini incelemek için mikroskoba bir kamera monte etmek de dahil olmak üzere farklı mikroskoplarla farklı konfigürasyonlar elde edilebilir.
   2. Kaide/taşlama plakasını ince plaka ile iki siyah tutucu arasına monte edin.
   3. Alt plakayı, mıknatıslar plakadan uzağa bakacak şekilde yerleştirin.
   4. Üç parçayı birbirine vidalayın: (1) üst tespit halkası, (2) taşlama ince plakası ve (3) alt tespit halkası (manyetik). Taşlama plakasının aşındırıcı yüzeyini tanımlayın; İnce plaka için mor bir renktir ve camın kuvars optik düz ile temas etmesi için yukarı bakmalıdır.
   5. Kaynak ağzı açma aletinin kuvars optik düzlüğüne beş damla beveler kaide yağı veya gerektiği kadar damlatın ve monte edilmiş plakayı üstüne yerleştirin. Bu yağ tüm gün dayanabilir, ancak plaka sarsılırsa veya gerektiği zaman dönmezse, kuvars optik dairenin yeniden yağlanması gerekebilir.
   6. Yağı yaymak için plakayı birkaç kez manuel olarak döndürün ve ardından cihaz açılabilir.
   7. Empedans ölçeri kurmak için referans tel olan fitilin üzerine tuzlu su (%0.9 NaCl) ekleyin ve fitili eğim verme plakasına yerleştirin. Mikropipet ile bir devre yapmak için şeridi ıslatın ve plakayı ince bir tabaka tuzlu su çözeltisi ile kaplayın.
   8. Kurşun segmentini empedans ölçere bağlı telin ucuna takın.
   9. Empedans ölçerdeki "açma" düğmesini çevirin ve eğim vermeye başlamaya hazır olana kadar "beklemede" bırakın. Büyük bir açıklık yarattığımız için, eğim vermeye hazır olduğunuzda elektrot empedans ölçeri x0.1'e ayarlayın.
3. Mikropipetin yüklenmesi ve eğim verilmesi
   1. Mikropipeti manipülatör üzerinde bulunan pipet kelepçesine yükleyin ve eğim verirken yerinde tutmak için düğmeyi sıkın.
   2. Mikropipetin arka ucundan tüm pipeti tuzlu suyla doldurun ve mikropipette hava kabarcığı olmadığından emin olarak ucu mikropipete yerleştirin. Mikropipette hava kabarcıklarının bulunmasının ölçümlerde değişkenliğe neden olduğu fark edilmiştir.
   3. "Bekleme"den "x0.1"e geçerek empedans ölçeri açın. Direnç başlangıçta 100 MΩ olmalı ve mikropipet ucu tuzlu suya temas ettiğinde farklı bir okuma göstermelidir.
   4. Doğru uç açıklığı boyutunu eğimlendirmek için, mikropipeti indirmeden önce, tutarlı bir eğim elde etmek için manipülatördeki açıyı 35°'ye ayarlayın. 30°'lik bir açı da yeterlidir, ancak ikisi arasında 35° daha düşük bir standart sapmaya sahiptir, bu nedenle eğim vermede daha tutarlıdır ve uç daha az kırılır.
   5. Manipülatörü kullanarak, mikropipet ucunu öğütme plakasının dönme merkezinden yaklaşık üçte iki oranında konumlandırın.
   6. Kaba ayar düğmesini kullanarak, mikropipet ucu tuzlu su çözeltisine yaklaşacak şekilde mikropipeti plakaya yakın indirin. Kamera yoksa, ucun eğimini görmek için mikroskoba bakmak önemlidir.
   7. Mikropipet ucu tuzlu su ile temas ettiğinde, empedans ölçer okuması 100 MΩ'dan 80 ila 20 MΩ aralığında bir değere düşmelidir. Bu değer, çekilen cam açıklığı nedeniyle değişecektir.
   8. Bu noktada, plakadaki ucun kırılmasını önlemek için pipeti daha yavaş indirmek için kaba ayar düğmesinden ince ayar düğmesine geçin. Bu eğim verme aşamasında empedans ölçeri ve ucu aynı anda izlemek önemlidir.
   9. Eğim verirken, uç boyutunun değiştiğini gözlemleyin ve eğim verirken iyi bir bakış açısı oluşturmaya yardımcı olması için aydınlatmayı kullanın.
      NOT: Eğim oluştukça uç son derece parlak hale gelecek ve uç açıklığı büyüyecektir. Bu aşamada mikropipeti indirmek veya yükseltmek için manipülatör üzerindeki ince ayar düğmesinin kullanılması zorunludur. Mikropipet plakadan kaldırıldıktan sonra, tekrar plakaya geri getirmek ucun kırılmasına neden olabilir.
   10. Ucu eğim verme plakasına ulaşana kadar yavaşça indirmeye devam edin ve yaklaşık 20 MΩ'luk bir dirence ulaşılana kadar yavaşça eğim verin. Bu sürecin ustalığı, güçlü bir öğrenme eğrisi olacaktır ve ucu tutarlı bir şekilde eğmek için pratik gerektirecektir.
   11. 20 MΩ'luk bir dirence ulaşıldığında, mikropipeti beveler'den kaldırın.
   12. Kurşunu mikropipetten çıkarın ve mikropipeti beveler'dan boşaltın. Beveler üzerinde bırakılırsa, mikropipet kırılabilir veya ucunda daha büyük bir açıklık oluşturabilir; Bu nedenle, eğim verirken metreyi ve ucu izlemek önemlidir.
       NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
   13. Eğimli mikropipeti mikropipet tutucusuna yerleştirin ve uç açıklığı boyutunu ölçmek için mikroskop yazılımındaki 10x objektifi kullanın. Tüm eğimli uçlarda tutarlılığı kontrol etmek için 10 uçluk bir numune boyutu yeterlidir.
   14. Fotoğraf çekmeden önce mikroskop ayarının (10x) kamera ayarlarıyla eşleştiğini onaylayın. Uç açma ölçümlerinden sonra aykırı değerler dışarı atılabilir.
   15. Beveler'ı kapatmak için, hem tahrik kayışı motorunda hem de empedans ölçerde anahtarı "kapalı" konuma getirin.
   16. Üst tutma halkasını çıkarmak için kaide/taşlama plakasını sökün. Kaide/taşlama plakasını birbirine bağlıyken kaldırmayın çünkü oluşan vakum nedeniyle kırılabilir.
   17. Ataşmanın üst tespit halkasını vidalarla kaldırdıktan sonra, ince taşlama plakasını kaydırarak çıkarın ve çıkarmak için son manyetik ataşmanı kaldırın. Kuvars optik düzlük üzerindeki fazla yağı laboratuvar mendilleriyle temizleyin.
   18. Tuz kristali oluşumunu önlemek için üç bileşeni de deiyonize (DI) suyla temizleyin ve kurulayın. Uzun süreli kullanımdan sonra, dönen manyetik tabanda sarsıntı yaşanabilir. Böyle bir durumda, kristalleşmiş tuzu çıkarmak için tahrik kayışına az miktarda DI suyu püskürtün.
   19. Taşlama plakasının arkasındaki ve kuvars optik düzlükteki fazla yağı silin.
   20. Kristalleşmeyi önlemek için cihaz üzerinde olabilecek fazla tuzlu suyu çıkarmak için beveler platformunda DI suyu kullanın.
   21. Eğimli uçları yıkamak için DI su kullanın. Uçlar yıkanmazsa kristalleşirler ancak daha sonra DI su ile kolayca yıkanabilirler.
   22. Kili bir tabağın içine koyun ve mikropipetlerin kirlenmesini önlemek için kapak camını kullanın.
   23. Mikropipetleri tutmak için kilde girintiler yapın. Kullanıma hazır olduğunda, eğimli uçlar artık ilgilenilen bir bileşik ile geri doldurulmaya ve solucanın damar sistemine enjekte edilmeye hazırdır. Bu protokol örneği için, kontrast maddeler, mikro kabarcıklar, ilgilenilen bileşik olarak kullanılmıştır.
       NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.

2. Eğimli uçlu mikroenjektör kalibrasyonu

1. Hidrofobik kaplı bir plaka hazırlayın.
   1. Bir gün önce, gece boyunca kürlenmek için yüzeyde iki plakayı hidrofobik kaplama ile kaplayın. Bu kimyasal, mağazadan satın alınan malzemelerden veya varsa kurum içi laboratuvar malzemelerinden olmalıdır ve kürlenmesi için en az 12 saat gereklidir.
   2. Kaplama, iki aşamalı hızlı bir işlemdir. Baz Kat ile püskürtün ve ardından Üst Kat ile püskürtün.
   3. Bir kapüşonda veya açık bir alanda, karıştırma topları bir dakika boyunca tıkırdadıktan sonra Taban Kat kutusunu kuvvetlice salladıktan sonra Taban Kaplamayı plakaya püskürtün.
   4. Plakayı kaplarken geçişler yaparak plakayı yüzeyden yaklaşık 6-12 inç uzağa Taban Kat ile püskürtün. Geçişler, sağdan sola ve ardından yukarı ve aşağı hafif geçişlerden oluşur. Plaka kaplanırken sallamaya devam edin ve ürün performansını düşüreceği için aşırı püskürtmemeye dikkat edin.
   5. Baz Katın başka bir kaplamasını uygulamadan önce 1-2 dakika bekleyin. Gerekli olmamakla birlikte, istenirse ek kaplama uygulanabilir.
   6. Baz Katın kuruması için 30 dakika bekleyin.
   7. Üst kat için 2.1.3 - 2.1.5 arasındaki adımları tekrarlayın.
   8. Plaka gece boyunca veya en az 12 saat kürlendikten sonra, plaka mineral yağ ile doldurulmaya hazırdır. Plakayı yaklaşık yarısına kadar mineral yağ ile doldurun.
   9. Mineral yağ içeren plakayı mikroenjektör aşamasına yerleştirin.
2. Eğimli uçları mikroenjektöre yükleyin.
   1. Mikro enjektörü doğrudan bir laboratuvar basınçlı hava jetine bağlayın. Bu sistem için sıkıştırılmış bir nitrojen silindiri ve bir basınç regülatörü kullanılabilir, ancak diğer mikroenjektör sistemlerinin farklı bir arayüz gerektirebileceğini unutmayın.
   2. Basınçlı havayı açın ve düşük basınçlı hava hattı regülatörünü 70 PSI'ye açın ve mikro enjektörü açın. Sistem 80 PSI'nin üzerini işleyemeyeceği için 80 PSI'yi aşmayın.
   3. Metal Göbek İğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanarak uçları suyla doldurun. Pipetin iç çapı farklıysa, onu yerleştirmek için farklı bir ölçü metal iğneye ihtiyaç duyulacaktır.
   4. Su ile geri doldurulduktan sonra, mikropipeti joystick mikromanipülatörünün iğne tutucusuna yükleyin. Farklı mikroenjektörler ve mikromanipülatörler kullanılabilir.
3. Eğimli mikropipet ile dağıtım hacmini kalibre etmek için su kabarcıkları oluşturun.
   NOT: Solucanın damar sistemine herhangi bir bileşik uygulama uygulanmadan önce, uygun hacim enjeksiyonunu belirlemek için mikroenjektör kalibre edilmelidir.
   1. Mikroenjektör üzerindeki parametreleri 4 PSI'da basınç ve 0,5 saniyede zaman için ayarlayın. Bu parametrelerin aşılması, araştırmacının amacı damar genişlemesini incelemek olmadıkça, geminin boyutunu bozacaktır ki bu elverişsizdir.
   2. Pipet ucunu plakanın altına yakın olana kadar indirin, ancak ucu plakanın altından kırmamaya dikkat edin. Mineral yağın ucu ne kadar düşükse, uçta o kadar viskoz olur ve bu da kırılmaya neden olabilir.
   3. Kalibrasyon sırasında plakayı tam olarak kullanmak için plakanın bir kenarından başlayın.
   4. Bu yerine oturduğunda, yağda bir su kabarcığı dağıtmak için pedala basın.
   5. Kabarcık uca yapışmış kalabilir. Bunu düzeltmek için, pipet ucundan ayırmak için plakayı baloncuğun tersi yönde hızla çekin.
   6. Kamera yazılımını kullanarak baloncuk boyutunu ölçün ve hacmi hesaplayın. Herhangi bir kamera yazılımı mevcut değilse, alternatif yazılım kullanılabilir.
   7. Mikropipetin solucan damar sistemine dağıtacağı doğru hacmi belirlemek için 10 baloncuk oluşturun ve ortalama kabarcık çapını ölçün.
      NOT: Araştırmacı çeşitli hacimleri dağıtmakla ilgileniyorsa, basınç ve zaman parametreleri manipüle edilebilir; 2.3.1 - 2.3.7 arasındaki adımları tekrarlayın.

3. İlgilenilen belirli solucan damar sistemini ortaya çıkarmak için solucan cerrahisi hazırlığı

1. Solucan hazırlama ve ölçümleri
   1. Ameliyattan önce solucanları uyuşturacak %10 etanol solüsyonu hazırlayın.
   2. Solucanları deneyler arasında toprakla birlikte 100 mL'lik bir beherde tutun.
   3. Buzdolabından tezgah üstü 4 °C ila 25 °C arasındaki ani değişiklikler nedeniyle solucanların kurumasını önlemek için beherde bir seferde yalnızca 5 - 10 solucan bulundurun.
   4. Solucanları 30 dakika boyunca% 10 etanole koyun. Solucan 30 dakika sonra hala hareket ediyorsa, 5 dakika daha etanol çözeltisinde bırakın.
      NOT: Bazen solucanın büyüklüğü nedeniyle daha fazla zamana ihtiyacı vardır; Bu nedenle, etanoldeki sürenin solucan boyutuna göre ayarlanması gerekebilir, ancak bir saati aşmamalıdır. Bir saatten fazla bir süre solucana zarar verir.
   5. Ürettiği balçık ve etanolü çıkarmak için solucanı musluk suyunun altında durulayın.
   6. Fazla suyu çıkarmak için solucanı bir kağıt havlu üzerine koyun.
   7. Solucan uyuşturulduktan sonra, her solucanın ağırlığını (g), genişliğini (mm), uzunluğunu (mm) ve damar genişliğini (μm) kaydedin. Herhangi bir kesi yapılmadan önce ve solucanı germeden solucanın ağırlığını ve boyutlarını alın.
   8. Damar mikroskop altında cerrahi olarak maruz kaldıktan sonra, damarın genişliğini ölçmek için kamera yazılımını kullanın. Herhangi bir kamera yazılımı mevcut değilse, dijital bir yazılım ölçümü kadar doğru olmasa da, paslanmaz bir mikro cetvel yeterli olacaktır.
      NOT: İlgilendiğiniz gemiye bağlı olarak, Adım 3.2 (ventral damar), 3.3 (sırt damarı), 3.4 (kalplerin üstten görünümü) veya 3.5'e (kalplerin yandan görünümü) atlayın.
2. Solucan damar sisteminin, ventral damarın açığa çıkarılması (yöntem 1)
   1. Cerrahi prosedür sırasında solucanı sabitlemek için bir lastik ped kullanın, böylece ilgilenilen gemiyi araştırmacıya maruz bırakın. Cildin koyu renkli kısmı aşağı bakmalıdır.
   2. Solucanı cerrahi olarak açmak için, solucanın daha koyu kısmı olan sırt tarafına yerleştirin, burada bir bıçakla yaklaşık 1 mm'lik cilt üzerinde küçük bir yan kesi yapılır. Bu küçük kesi, uzun bir kesi oluşturmak için cerrahi makasın girmesine izin verir.
   3. Solucan derisini 33 mm aralıklarla sabitleyin, kabı ortaya çıkarmak için 27 mm'lik bir açıklık açın, kabı düzgün bir şekilde ortaya çıkarmak için yalnızca dört pim kullanın. Solucan sabitlendikten sonra, solucanın derisini manipüle etmeye yardımcı olmak için pimler eklenebilir veya taşınabilir.
   4. Cerrahi makasla vücudunun yan tarafındaki diğer pime ulaşmak için bir kesi yapın. Cilde doğru iterek, solucanın iç kısmına, damar sistemini veya bağırsağı kesmek gibi herhangi bir hasarı önler.
   5. Kesi yapıldıktan sonra, ilk kesiğin yapıldığı yeri ve ardından kesimin sonunda sabitleyin veya yeniden sabitleyin.
   6. Her iki cerrahi aleti de (cerrahi tutamaklar) kullanarak, solucanın içini ortaya çıkarmak için cildi hareket ettirin.
   7. Cilt hareket ettirilirken alttaki cildi aşağı doğru sabitleyin ve solucanı yukarı doğru hareket ettirirken cildi organlardan dikkatlice ayırmaya devam edin. En üste geldikten sonra, son pimi yerleştirin.
   8. Damar açıkta değilse, ventral damarı açığa çıkarmak ve cildi daha da ayırmak için solucanın elastik dokusunu ayırmak için solucan derisinin zıt taraflarını çekin.
      NOT: Bu römorkör, solucanın içindeki organları tutan dokunun bir kısmını çıkaracaktır. Bu adıma dikkat edin, çünkü istemeden solucanın damarlarını yırtabilir. Ventral damar şimdi açığa çıkarılmalıdır ve sinir kordonu, damarın bir belirteci olarak işlev görebilir, çünkü sinir kordonu, ventral damarın hemen yanında ve ona paralel olarak cilt boyunca uzanır. Ventral damar bağırsağa yakınsa, cilt üzerindeki bir çekiş damarı daha da açığa çıkarabilir. Değilse, bağırsağı yana doğru itin, ancak bu dağınık bir çalışma alanına neden olabilir.
3. Solucan damar sisteminin, dorsal damarın açığa çıkarılması (yöntem 2)
   NOT: Dorsal damarı açığa çıkarma adımları, ventral damar maruziyetine benzer.
   1. Adım 3.2'deki 3.2.1 - 3.2.3 adımlarını tekrarlayın. Bu adımlar için cildin koyu renkli kısmı yukarı bakmalıdır.
   2. Solucanın ortasına doğru karşı tarafa doğru kesmek için cerrahi makas kullanın.
   3. Solucanın ortasından, solucanın ön kısmına, kafasına doğru bir kesi yapın. Cilde doğru yukarı doğru itmek, solucanın iç kısmında, damarı veya bağırsağı kesmek gibi herhangi bir hasarı önler.
   4. Çapraz kesim yapıldıktan sonra, ilk kesi bölgesini ve ardından yapılan kesimin sonunda iğneleyin veya yeniden sabitleyin.
   5. Adım 3.2'deki 3.2.6 - 3.2.9 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Sırt damarı şimdi açıkta kalmalıdır.
4. Solucan damar sisteminin açığa çıkarılması, kalplerin üstten görünümü (yöntem 3)
   1. Cerrahi prosedür sırasında solucanı sabitlemek için bir lastik ped kullanın, böylece ilgilenilen gemiyi araştırmacıya maruz bırakın.
   2. Solucanı cerrahi olarak ortaya çıkarmak için, solucanın hafif kısmı olan ventral tarafına yerleştirin. Cildin koyu renkli kısmı yukarı bakmalıdır.
   3. Solucanın derisini tutmak ve ilgilenilen kalpleri ortaya çıkarmak için bir pencere oluşturmak için dört pim kullanın. Solucanı başının ucuna, ön ucuna yakın tutmak için toplam beş kişilik ek bir pim kullanılabilir.
   4. Solucanı aşağıdan yukarıya doğru sabitlemeye başlayın, sağ taraftan başlayın ve sonra sol tarafa doğru hareket edin. Solucanı, başın ucuna, ön ucuna ve klitellumun yanına iki pim yerleştirerek sabitleyin.
   5. Solucanın yan tarafında yaklaşık 1 mm'lik küçük bir kesi yapmak için bir bıçak kullanın.
   6. Solucanın ortasına doğru karşı tarafa doğru kesmek için cerrahi bir makas kullanın.
   7. Solucanın ortasından, solucanın ön ucu olan solucanın ağzına ulaşana kadar solucanın önüne doğru bir kesim yapın.
      NOT: Damar sisteminin kesilmesini önlemek için makasın cilde karşı kaldırılması önemlidir; Makas bıçağı, deriden geçerken görülebilir. Kesiğin solucanın ön ucuna yapıldığından emin olun, çünkü bu kalplerin daha iyi görünmesini sağlayacaktır.
   8. Sabitlendikten sonra, cilt solucanın içine kıvrılıyorsa, solucanı yeniden sabitleyin.
   9. Kalpleri düzgün bir şekilde ortaya çıkarmak için solucanın dokusunu düzgün bir şekilde ayırmak için bir römorkör yapın.
   10. Kalpler açıkta kalmazsa, beyaz seminal vezikülleri hareket ettirin, çünkü kalpler bazen bu veziküllerin altına saklanır.
       NOT: Kalp maruziyeti solucandan solucana değişebilir, 10 kalbin tümü görünür olabilir veya sadece yarısı vb. Bu noktada araştırmacı, solucanın kalbini bulmak için organları ve dokuları hareket ettirip ettirmeyeceğini belirlemelidir.
5. Solucan damar sisteminin açığa çıkarılması, kalplerin yandan görünümü (yöntem 4)
   1. Cerrahi prosedür sırasında solucanı sabitlemek için bir lastik ped kullanın, böylece ilgilenilen gemiyi araştırmacıya maruz bırakın.
   2. Solucanı cerrahi olarak ortaya çıkarmak için, yan tarafına yerleştirin. Solucan kendi tarafında olduğu için, solucanın hem aydınlık hem de karanlık tarafı görünür olmalıdır.
   3. Adım 3.4'teki 3.4.3 - 3.4.9 adımlarını tekrarlayın.
   4. Kalpler açıkta kalmazsa, beyaz seminal vezikülleri hareket ettirin, çünkü kalpler bazen bu veziküllerin altına saklanır.
      NOT: Kalp maruziyeti solucandan solucana değişebilir, beş kalbin tümü görünür veya daha az olabilir. Bu noktada araştırmacı, solucanın kalbini bulmak için organları ve dokuları hareket ettirip ettirmeyeceğini belirlemelidir.

4. Solucan Damar Sistemine Bileşik Uygulama

1. Solucanın bileşik uygulama için hazırlanması
   NOT: Bu özel adımlar için, ilgilenilen bileşik olarak solucan damar sistemine kontrast maddeler, mikro kabarcıklar enjekte ettik.
   1. Mikroenjeksiyondan önce, solucanı mikroenjeksiyon aşamasına yerleştirin ve ilgilenilen damarın etrafındaki sıvıları çıkarmak için bir laboratuvar mendili kullanın, böylece damar sistemini enjeksiyon için açığa çıkarın.
      NOT: Damarın kanamasına neden olacağı için güçlü bir basınç uygulamayın.
   2. Ventral damarın enjeksiyon için hizalanması önemli olduğundan, ilgilenilen damar sistemini mikropipetle hizalayın. Kalpler ilgi çekiyorsa, mikropipete dik olmalıdır.
   3. Mikroskobu ilgilenilen damar sistemine odaklayın ve mikropipeti damar sistemine indirmeye başlayın. Joystick manipülatörlerinden herhangi birini hareket ettirmeden önce, en iyi hareketliliği sağlamak için hepsinin 0 mm'ye ayarlandığını onaylayın.
   4. Mikropipetin ucu solucan kabı ile temas ettiğinde, kap ile mikropipet arasındaki açının 15°'den az olduğundan emin olun.
   5. Mikropipet damar üzerine baskı uygulamaya başladığında, damar sistemi üzerindeki baskı nedeniyle kan uçtan uzaklaşacaktır. Bu, uygun enjeksiyon yerleşiminin iyi bir göstergesidir.
   6. Başarılı bir enjeksiyonu sağlamak için, damar sistemi ile temas etmek üzere mikropipeti ileri doğru hareket ettirmek için joystick'i kullanın.
      NOT: Damarı delmemek önemlidir. Ucun, dorsal ve ventral damar için damar sistemini mikropipetin hareket ettiği yönde hareket ettirmesi gerektiğine dikkat edin ve ardından damara tam penetrasyon sağlamak için mikropipet ucunu ileri doğru hareket ettirmek için kaba kadran kullanılmalıdır. Plaka hareketliyse, bu, mikrodenetleyicileri veya hepsini aynı anda kullanmak yerine, kabı mikropipete taşımak ve delmek için kullanılabilir. Damar hemen delinmeyecektir, ancak kabın geri tepmesi, mikropipetin uygun şekilde nüfuz ettiğinin bir göstergesidir. Uç damara girdikten sonra, damar düz olmalı ve mikropipet ile hizalanmalıdır. Değilse, ince kontrolü kullanarak mikropipeti yavaşça geri çekin.
   7. Solucanın damar sistemini enjekte etmek için pedala basın. Kanın seyreltilmesi, pedala basıldığında uygun penetrasyonun bir başka göstergesidir.
   8. Mikropipeti yavaşça geri çekin ve mikropipeti çekip çıkarın.
      NOT: Alternatif olarak, mikropipet hala damar içindeyken ucu kırmak, kan kaybını önlemek için etkili bir yöntemdir.

Aşağıdaki temsili sonuçlar, cam pipeti çekmek için kullanılan ayarları, belirli bir eğim açısından oluşturulan pipet açıklığı boyutunu ve mikroenjeksiyonların basıncını ve süresini içeren bir dizi özel parametreye dayanmaktadır. Şekil 1'de, süreci baştan sona temsil eden bir akış şeması görüntülenir.

Seçilen pipet çektirme parametrelerine bağlı olarak, çekme işleminden aşağıdaki uç ç?...

Solucan% 10 etanol içindeyken, özellikle solucan daha yaşlı ise, 30 dakikadan daha uzun maruz kalma süreleri için istenmeyen etkiler olabilir; Bağırsaklar bozulmaya başlar ve solucan cerrahi olarak açıldığında iç bağırsakları yayılır. Bu nedenle, genç ila orta yaşlı solucanların kullanılması teşvik edilir. Solucanın derisini kesme işlemi sırasında, tam bir makas kesiminin yapılmaması zorunludur, yani araştırmacı sadece yarıya kadar kesmeli ve son nokt...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, NSF-FDA Scholar-in-Residence Bursu (NSF-FDA SIR, #1641221), ABD Gıda ve İlaç İdaresi Ofisi Baş Bilim İnsanı Yarışması Hibesi (FDA OCS), Ulusal Bilim Vakfı Bütünleştirici Lisansüstü Eğitim ve Araştırma Stajı (NSF IGERT, #1144646) tarafından finanse edildi ve ABD Gıda ve İlaç Dairesi'ndeki (FDA) Bilim ve Mühendislik Laboratuvarları Ofisi (OSEL) tarafından desteklendi.