Lombrico, Lumbricus Terrestris: un nuovo modello di invertebrato in vivo con vascolarizzazione per microiniezione

I lombrichi sono un nuovo modello da banco in vivo di invertebrati per studi di vascolarizzazione. Presentiamo tecniche e attrezzature che consentono una chirurgia efficiente e la microiniezione nel sistema vascolare del lombrico. Vengono descritti i protocolli chirurgici, le tecniche di microiniezione e la procedura per la produzione di micropipette su misura.

Sebbene i vertebrati siano indispensabili per la ricerca biomedica, gli studi sono spesso limitati da fattori quali costi, lunghe revisioni interne e considerazioni etiche. Presentiamo il lombrico come un invertebrato alternativo, a basso costo, applicabile ad alcuni studi preliminari di vascolarizzazione. A causa della disponibilità chirurgica dei vasi dorsali del lombrico, dei vasi ventrali e di cinque paia di pseudo cuori, i lombrichi sono facilmente accessibili, offrono una manutenzione a basso costo e richiedono la somministrazione solo di piccole dosi di un determinato composto. Il modello del lombrico fornisce un semplice sistema circolatorio vascolare chiuso con una struttura dell'emoglobina simile al sangue umano. Viene fornito un protocollo per l'anestetizzazione dei lombrichi e l'esecuzione di incisioni chirurgiche per esporre i vasi sanguigni pertinenti. Le micropipette per la somministrazione di composti sono formate riscaldando e tirando il vetro con un estrattore per pipette e utilizzando un sistema di smussatura per creare una punta dell'ago sottile su scala micron. Le punte vengono quindi utilizzate con un microposizionatore e un microiniettore per iniettare composti arbitrari nel sistema vascolare di un lombrico, in modo ripetibile, con la disponibilità di campioni di grandi dimensioni e piccoli volumi di composti. Vengono forniti dettagli sulle complessità della procedura di iniezione. Le piccole dimensioni del vaso del lombrico sono impegnative, in particolare nel caso del vaso ventrale; Tuttavia, la padronanza delle tecniche presentate offre un'elevata ripetibilità come soluzione a basso costo, rendendo pratici gli studi su campioni di dimensioni molto grandi.

Il lombrico è stato utilizzato come importante bioindicatore e biodosaggio per precedenti applicazioni scientifiche 1,2,3,4,5,6; È un organismo ideale per valutare i rischi biologici derivanti da rifiuti pericolosi e tossici in ambienti terrestri per studi in situ e di bioaccumulo, come biocidi (insetticidi) nel suolo ed effetti ecotossicologici avversi 7,8,9,10. Inoltre, a causa della bioprospezione, il lombrico è una fonte alternativa di molecole fibrinolitiche, anticoagulanti, antimicrobiche e antitumorali^11,12; al punto che un team nel 1991 ha estratto e purificato la lumbricina dalla pelle del lombrico e l'ha posizionata sui tumori mammari dei topi SHN, il che ha portato all'inibizione della crescita tumorale¹³. Il lombrico è anche un modello animale pedagogicamente utile, in quanto può essere utilizzato per esporre gli studenti alla chirurgia e alla comprensione dell'anatomia di un esemplare; dallo studio della circolazione sanguigna all'elettrofisiologia^14,15.

Nella nostra ricerca abbiamo esaminato la risposta dei vasi dei lombrichi vivi agli ultrasuoni ad alta intensità¹⁸. Abbiamo scoperto che la rottura dei vasi sanguigni nel verme si è verificata in condizioni simili a quelle che abbiamo associato al danno da rottura nei microvasi umani. Il nostro lavoro in corso prevede l'iniezione di microbolle nel sistema vascolare del lombrico. Le microbolle sono composte da un gas pesante racchiuso da un guscio lipidico, albumina o polimero, questi agenti possono essere utilizzati come agenti di contrasto dell'immagine e come veicoli per la somministrazione mirata di farmaci.

Questo nuovo protocollo è rilevante per qualsiasi studio che trarrebbe beneficio dall'iniezione endovenosa (IV) di un composto che potrebbe utilizzare i bioindicatori naturali del lombrico. L'approccio si basa sulla microiniezione endovenosa in uno dei diversi possibili punti di ingresso, tra cui uno qualsiasi degli pseudo cuori a cinque paia del lombrico, il vaso dorsale e il vaso ventrale. La procedura prevede un'elaborata incisione chirurgica per esporre i vasi, seguita da un'iniezione controllata da micro-posizionatore. Ciò si ottiene utilizzando micropipette personalizzate costruite appositamente per la microiniezione vascolare di lombrichi. Queste micropipette consentono il puntamento di precisione di recipienti di dimensioni fino a 90 μm di diametro.

Questo protocollo è stato progettato per migliorare le precedenti tecniche di micropipettaggio, tra cui uno studio del 1948 per l'estrazione del sangue e dell'urina di lombrico¹⁶. Come mostrato nella Figura S1, l'impostazione per questa estrazione può essere difficile e, come affermato dall'autore, può richiedere fino a un'ora o più. Un metodo simile è stato sviluppato nel 1970, ma l'autore ha sperimentato diverse punte rotte mentre iniettava fluidi nelle fibre giganti del lombrico¹⁷. Nel presente metodo descritto di seguito, l'estrazione del sangue è una questione di secondi o minuti ed è rilevante sia per l'iniezione di composti che per l'estrazione di fluidi di lombrico. In questo caso specifico, abbiamo iniettato agenti di contrasto, microbolle.

1. Preparazione della micropipetta: tirare il vetro e smussare la punta

1. Estrazione di micropipette
   1. Accendere l'estrattore per micropipette e selezionare un programma per inserire parametri specifici per la microiniezione di lombrichi.
   2. Imposta i parametri su Pressione=500, Trazione=75, Tempo=250, Calore=336 e Velocità=70. I risultati possono variare da estrattore a estrattore; Pertanto, sperimenta i parametri per ottenere la punta desiderata (dimensione, nitidezza, forma, ecc.).
   3. Assicurarsi di eseguire un test RAMP per determinare il valore di calore delle micropipette prima di estrarle, poiché in caso contrario si potrebbe bruciare il filamento della vasca o rompere il vetro.
   4. Se è necessario modificare la pressione dell'aria, premere il pulsante di cancellazione, selezionare no (0) quando viene richiesto di cancellare tutti i valori e selezionare la pressione di modifica (2). Questo processo può variare da estrattore a estrattore; Pertanto, consultare il manuale dello strumento per modificare le impostazioni di pressione.
   5. Aprire il coperchio dell'estrattore per micropipette e caricare una micropipetta nell'estrattore. Il vetro per micropipette utilizzato era in vetro borosilicato con pipetta a filamento: 10 cm di lunghezza, diametro esterno: 1,5 mm e diametro interno: 0,86 mm.
   6. Far scorrere la pipetta nella scanalatura a V da destra lungo la fessura della pipetta fino a quando l'estremità della pipetta non si allinea con l'estremità del supporto della pipetta. Per garantire che la pipetta possa viaggiare attraverso il filamento fino al lato opposto, spingere la pipetta il più lontano possibile assicurandosi che rimanga appoggiata sulla fessura della pipetta.
   7. Per bloccare la pipetta, serrare la manopola sul lato destro e far scorrere il sistema di blocco insieme alla pipetta fino a raggiungere l'altro lato dell'estrattore attraverso il filamento. Infine, bloccare il lato sinistro della pipetta con l'estrattore. La pipetta deve trovarsi al centro del filamento; Consultare il manuale per istruzioni su come allineare correttamente la pipetta.
   8. Una volta caricata la pipetta, chiudere l'estrattore, premere il pulsante di trazione e attendere che la pipetta venga estratta prima di rimuovere le due pipette risultanti.
   9. Svitare le manopole per rimuovere le pipette e fare attenzione a non agganciare le pipette durante la rimozione dalla fessura.
   10. Posizionare le micropipette estratte su un supporto per micropipette o su un supporto per tenere la micropipetta in posizione e consentire una facile rotazione senza rompere le micropipette estratta. Abbiamo sviluppato il nostro supporto per micropipette che può essere creato in un'officina meccanica o anche stampato in 3D.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   11. Posizionare il supporto per micropipette sotto il microscopio e utilizzare un programma per fotocamera, o un software simile, per acquisire un'immagine delle micropipette estratte e registrare il diametro della punta utilizzando un ingrandimento 10x ~1000 mm e ~50 mm dalla punta.
   12. Prima di scattare un'immagine, assicurarsi che le impostazioni della fotocamera corrispondano all'impostazione del microscopio (10x), al fine di misurare con precisione, soprattutto per le misurazioni post-imaging. L'impostazione 10x si trova nella barra multifunzione orizzontale della barra degli strumenti situata nella parte superiore dello schermo.
   13. Per visualizzare e acquisire un'immagine della micropipetta, selezionare la fotocamera sul software della fotocamera situata nell'angolo in alto a sinistra e premere il pulsante Snap dopo aver messo a fuoco la punta per ottenere una lettura accurata. Il pulsante Snap si trova sulla barra degli strumenti orizzontale sul lato sinistro della pagina, sotto la scheda della fotocamera.
   14. Effettuare le misurazioni delle micropipette estratte per determinare se sono state raggiunte le dimensioni e la consistenza desiderate del puntale. L'estrazione di un massimo di 5 pipette è sufficiente per determinare se l'estrattore e i suoi parametri producono costantemente la dimensione desiderata. Se la dimensione del puntale desiderata non è stata raggiunta, o se il dimensionamento continua a variare per pipetta, il ricercatore potrebbe dover sperimentare impostazioni diverse fino a raggiungere la dimensione del puntale desiderata, oppure potrebbe essere necessario fissare il posizionamento del filamento e della pipetta, il che potrebbe richiedere il riferimento al manuale dell'estrattore di pipette.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Impostazione per lo smusso della micropipetta e utilizzo dell'impedenziometro dell'elettrodo
   1. Per smussare le micropipette estratte, utilizzare una smussatrice per micropipette con un impedenziometro a elettrodi e uno stereomicroscopio 40x.
      NOTA: È possibile utilizzare altre smussatrici; Anche le smussatrici interne hanno successo, inoltre è possibile ottenere diverse configurazioni con diversi microscopi per esaminare il processo di smussatura, incluso il montaggio di una telecamera sul microscopio.
   2. Montare il piedistallo/piastra di macinazione con la piastra fine tra i due supporti neri.
   3. Posizionare la piastra inferiore con i magneti rivolti lontano dalla piastra.
   4. Avvitare insieme le tre parti: (1) l'anello di ritegno superiore, (2) la piastra fine di macinazione e (3) l'anello di ritegno inferiore (magnetico). Identificare la superficie abrasiva della piastra abrasiva; Per la lastra fine, è di colore viola e dovrebbe essere rivolta verso l'alto in modo che il vetro sia a contatto con il piatto ottico al quarzo.
   5. Posizionare cinque gocce di olio per piedistallo smussatore, o quante ne sono necessarie, sul piano ottico al quarzo dello strumento di smussatura e posizionare sopra la piastra assemblata. Questo olio può durare tutto il giorno, ma se la piastra sussulta o non gira quando dovrebbe, potrebbe essere necessario oliare nuovamente il piatto ottico al quarzo.
   6. Girare manualmente la piastra alcune volte per distribuire l'olio e poi lo strumento può essere acceso.
   7. Per impostare l'impedenziometro, aggiungere soluzione salina (0,9% NaCl) sullo stoppino, che è il filo di riferimento, e posizionare lo stoppino sulla piastra di smussatura. Immergere il nastro per fare un circuito con la micropipetta e coprire la piastra con un sottile strato di soluzione salina.
   8. Collegare il segmento di piombo all'estremità del filo che è collegato al misuratore di impedenza.
   9. Azionare l'interruttore "on" sull'impedenziometro e lasciarlo in "stand-by" fino al momento di iniziare la smussatura. Poiché stiamo creando una grande apertura, impostare l'impedenziometro dell'elettrodo su x0,1 quando è pronto per lo smusso.
3. Caricamento della micropipetta e smussatura
   1. Caricare la micropipetta sulla pinza per pipette che si trova sul manipolatore e serrare la manopola per tenerla in posizione durante la smussatura.
   2. Attraverso l'estremità posteriore della micropipetta, riempire l'intera pipetta con soluzione fisiologica e inserire l'elettrocatetere nella micropipetta, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria nella micropipetta. Si è notato che la presenza di bolle d'aria nella micropipetta provoca variabilità nelle misurazioni.
   3. Accendere il misuratore di impedenza passando da "stand-by" a "x0.1". La resistenza dovrebbe essere inizialmente di 100 MΩ e quando la punta della micropipetta tocca la soluzione fisiologica, dovrebbe mostrare una lettura diversa.
   4. Per smussare la dimensione corretta dell'apertura del puntale, prima di abbassare la micropipetta, regolare l'angolo a 35° sul manipolatore per ottenere una smussatura uniforme. Anche un angolo di 30° è sufficiente, ma tra i due, 35° mantiene una deviazione standard inferiore, quindi più consistente nello smusso e la punta si rompe meno.
   5. Utilizzando il manipolatore, posizionare la punta della micropipetta a circa due terzi dal centro di rotazione della piastra di macinazione.
   6. Utilizzando la manopola di regolazione grossolana, abbassare la micropipetta vicino alla piastra in modo che la punta della micropipetta si avvicini alla soluzione salina. Se non è disponibile una fotocamera, è importante guardare in basso nel microscopio per vedere la smussatura della punta.
   7. Una volta che la punta della micropipetta entra in contatto con la soluzione fisiologica, la lettura dell'impedenziometro dovrebbe diminuire da 100 MΩ a un valore compreso tra 80 e 20 MΩ. Questo valore varierà a causa dell'apertura del vetro tirata.
   8. A questo punto, passare dalla manopola di regolazione grossolana a quella di regolazione fine per abbassare la pipetta più lentamente per evitare di rompere il puntale sulla piastra. È importante monitorare contemporaneamente l'impedenziometro e la punta in questa fase della smussatura.
   9. Durante la smussatura, osservare come cambia la dimensione della punta e utilizzare l'illuminazione per creare un buon punto di osservazione durante la smussatura.
      NOTA: La punta diventerà estremamente lucida man mano che si verifica la smussatura e l'apertura della punta diventerà più grande. In questa fase, è imperativo utilizzare la manopola di regolazione fine sul manipolatore per abbassare o alzare la micropipetta. Una volta che la micropipetta è stata sollevata dalla piastra, riportarla sulla piastra può causare la rottura della punta.
   10. Continuare ad abbassare lentamente la punta fino a raggiungere la piastra di smussatura e smussare lentamente fino a raggiungere una resistenza di circa 20 MΩ. La padronanza di questo processo sarà una forte curva di apprendimento e richiederà pratica per smussare la punta in modo coerente.
   11. Quando viene raggiunta una resistenza di 20 MΩ, sollevare la micropipetta dalla smussatrice .
   12. Rimuovere l'elettrocatetere dalla micropipetta e scaricare la micropipetta dalla smussatrice . Se lasciata sulla smussatrice la micropipetta può rompersi o creare un'apertura più grande sulla punta; Pertanto, è essenziale monitorare il misuratore e la punta durante la smussatura.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   13. Posizionare la micropipetta smussata sul supporto della micropipetta e utilizzare l'obiettivo 10x sul software del microscopio per misurare la dimensione dell'apertura del puntale. Una dimensione del campione di 10 punte è sufficiente per verificare la coerenza di tutte le punte smussate.
   14. Verificare che l'impostazione del microscopio (10x) corrisponda alle impostazioni della fotocamera prima di scattare una foto. I valori anomali possono essere eliminati dopo le misurazioni dell'apertura della punta.
   15. Per spegnere la smussatrice portare l'interruttore su "off" sia sul motore della cinghia di trasmissione che sull'impedenziometro.
   16. Svitare il piedistallo/piastra di macinazione per rimuovere l'anello di sicurezza superiore. Non sollevare il piedistallo/piastra di macinazione mentre sono attaccati l'uno all'altro perché può rompersi a causa di un vuoto creato.
   17. Dopo aver sollevato l'anello di ritegno superiore dell'accessorio con le viti, sfilare la piastra di macinazione fine e sollevare l'ultimo attacco magnetico per rimuoverlo. Rimuovere l'olio in eccesso sul piatto ottico al quarzo con salviette da laboratorio.
   18. Pulire tutti e tre i componenti con acqua deionizzata (DI) e asciugare tamponando per evitare la formazione di cristalli di sale. Dopo lunghi periodi di utilizzo, la base magnetica rotante potrebbe subire strappi. In tal caso, spruzzare una piccola quantità di acqua deionizzata sulla cinghia di trasmissione per rimuovere il sale cristallizzato.
   19. Rimuovere l'olio in eccesso sul retro della piastra di macinazione e sul piano ottico al quarzo.
   20. Utilizzare acqua deionizzata sulla piattaforma della smussatrice per rimuovere l'eccesso di soluzione salina che potrebbe essere presente sullo strumento per evitare la cristallizzazione.
   21. Utilizzare acqua deionizzata per lavare le punte smussate. Se le punte non vengono lavate, si cristallizzeranno ma possono essere facilmente lavate via con acqua deionizzata in un secondo momento.
   22. Stendere l'argilla all'interno di una piastra e utilizzare il vetro di copertura per evitare che le micropipette si contaminino.
   23. Praticare delle rientranze nell'argilla per trattenere le micropipette. Quando sono pronte per essere utilizzate, le punte smussate sono ora pronte per essere riempite con un composto di interesse e iniettate nel sistema vascolare del lombrico. Per questo esempio di protocollo, sono stati utilizzati agenti di contrasto, microbolle, come composto di interesse.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Calibrazione del microiniettore con punte smussate

1. Preparare una piastra con rivestimento idrofobico.
   1. Il giorno prima, rivestire due piastre con rivestimento idrofobico sulla superficie per polimerizzare durante la notte. Questa sostanza chimica dovrebbe provenire da materiali acquistati in negozio o da materiali di laboratorio interni, se disponibili, e sono necessarie almeno 12 ore per l'indurimento.
   2. Il rivestimento è un processo rapido in due fasi. Spruzzare con il Base Coat e poi spruzzare con il Top Coat.
   3. In una cappa o in uno spazio aperto, spruzzare il Base Coat sulla piastra dopo aver agitato energicamente la bomboletta Base Coat una volta che le palline di miscelazione hanno vibrato per un minuto.
   4. Spruzzare la piastra con il rivestimento di base a circa 6-12 pollici dalla superficie eseguendo passaggi mentre si riveste la piastra. I passaggi consistono in passaggi leggeri da destra a sinistra e poi su e giù. Continua ad agitare mentre la piastra viene rivestita e assicurati di non spruzzare eccessivamente in quanto ridurrà le prestazioni del prodotto.
   5. Attendere 1-2 minuti prima di applicare un altro strato di Base Coat. Sebbene non sia necessario, il rivestimento aggiuntivo può essere applicato se lo si desidera.
   6. Attendere 30 minuti affinché la base si asciughi.
   7. Ripetere i passaggi 2.1.3 - 2.1.5 per il top coat.
   8. Una volta che la piastra si è indurita durante la notte o per almeno 12 ore, la piastra è pronta per essere riempita con olio minerale. Riempire la piastra circa a metà con olio minerale.
   9. Posizionare la piastra con olio minerale sullo stadio del microiniettore.
2. Caricare le punte smussate sul microiniettore.
   1. Collegare il microiniettore direttamente a un getto d'aria compressa da laboratorio. Per questo sistema è possibile utilizzare una bombola di azoto compresso e un regolatore di pressione, ma si noti che altri sistemi di microiniettori potrebbero richiedere un'interfaccia diversa.
   2. Aprire l'aria compressa e aprire il regolatore della linea dell'aria a bassa pressione a 70 PSI e accendere il microiniettore. Non superare gli 80 PSI, poiché il sistema non è in grado di gestire oltre 80 PSI.
   3. Riempire nuovamente le punte con acqua utilizzando una siringa da 1 ml con un ago per mozzo in metallo. Se il diametro interno della pipetta è diverso, sarà necessario un ago di metallo di calibro diverso per adattarlo.
   4. Una volta riempita d'acqua, caricare la micropipetta sul portaaghi del micromanipolatore a joystick. Possono essere utilizzati diversi microiniettori e micromanipolatori.
3. Creare bolle d'acqua per calibrare il volume di erogazione attraverso una micropipetta smussata.
   NOTA: Prima di introdurre qualsiasi somministrazione di composto nel sistema vascolare del lombrico, il microiniettore deve essere calibrato per determinare il volume corretto di iniezione.
   1. Impostare i parametri sul microiniettore per la pressione a 4 PSI e il tempo a 0,5 secondi. Il superamento di questi parametri distorcerà le dimensioni del vaso, il che è sfavorevole, a meno che l'obiettivo del ricercatore non sia quello di studiare l'espansione del vaso.
   2. Abbassare il puntale della pipetta fino a quando non si trova vicino al fondo della piastra, ma fare attenzione a non rompere il puntale sul fondo della piastra. Più bassa è la punta nell'olio minerale, più sarà viscosa sulla punta, il che potrebbe portare alla rottura.
   3. Iniziare da un bordo della piastra per utilizzare completamente la piastra durante la calibrazione.
   4. Una volta che questo è in posizione, premere il pedale per erogare una bolla d'acqua nell'olio.
   5. La bolla potrebbe rimanere attaccata alla punta. Per rimediare a questo problema, estrarre rapidamente la piastra nella direzione opposta alla bolla per separarla dal puntale della pipetta.
   6. Utilizzando il software della fotocamera, misurare la dimensione della bolla e calcolare il volume. Se non è disponibile alcun software della fotocamera, è possibile utilizzare un software alternativo.
   7. Creare 10 bolle e misurare il diametro medio delle bolle per determinare il volume corretto che la micropipetta erogherà nel sistema vascolare dei lombrichi.
      NOTA: Se il ricercatore è interessato a erogare una varietà di volumi, i parametri per la pressione e il tempo possono essere manipolati; Ripetere i passaggi 2.3.1 - 2.3.7.

3. Preparazione alla chirurgia dei lombrichi per esporre la vascolarizzazione specifica dei lombrichi di interesse

1. Preparazione e misurazioni dei lombrichi
   1. Preparare una soluzione di etanolo al 10% che anestetizzerà i lombrichi prima dell'intervento chirurgico.
   2. Conserva i lombrichi in un becher da 100 ml con il terreno tra un esperimento e l'altro.
   3. Conservare solo 5 - 10 lombrichi alla volta nel becher per evitare che si secchino a causa dei bruschi passaggi dal frigorifero al piano di lavoro, da 4 °C a 25 °C.
   4. Mettere i lombrichi in etanolo al 10% per 30 minuti. Se il lombrico è ancora in movimento dopo 30 minuti, lasciarlo nella soluzione di etanolo per altri 5 minuti.
      NOTA: A volte il lombrico ha bisogno di più tempo a causa delle sue dimensioni; Pertanto, potrebbe essere necessario regolare il tempo in etanolo in base alle dimensioni del lombrico, ma non superare l'ora. Più di un'ora danneggerà il lombrico.
   5. Sciacquare il lombrico sotto l'acqua del rubinetto per rimuovere la melma che produce e l'etanolo.
   6. Metti il lombrico su un tovagliolo di carta per rimuovere l'acqua in eccesso.
   7. Una volta che il lombrico è stato anestetizzato, registrare il peso (g), la larghezza (mm), la lunghezza (mm) e la larghezza del vaso (μm) di ciascun lombrico. Prendi il peso e le dimensioni del lombrico prima di praticare qualsiasi incisione e senza allungare il lombrico.
   8. Una volta che il vaso è stato esposto chirurgicamente al microscopio, utilizzare il software della fotocamera per misurare la larghezza del vaso. Se non è disponibile alcun software per la fotocamera, sarebbe sufficiente un micro-righello in acciaio inossidabile, anche se non è preciso come una misurazione digitale via software.
      NOTA: A seconda del vaso di interesse, passare al passaggio 3.2 (vaso ventrale), 3.3 (vaso dorsale), 3.4 (vista dall'alto dei cuori) o 3.5 (vista laterale dei cuori).
2. Esposizione del sistema vascolare del lombrico, il vaso ventrale (metodo 1)
   1. Utilizzare un cuscinetto di gomma durante la procedura chirurgica per bloccare il lombrico, esponendo così il vaso di interesse per il ricercatore. La parte scura della pelle deve essere rivolta verso il basso.
   2. Per aprire chirurgicamente il lombrico, posizionarlo sul suo lato dorsale, la parte più scura del lombrico, dove viene praticata una piccola incisione laterale sulla pelle di circa 1 mm con una lama. Questa piccola incisione consente alle forbici chirurgiche di entrare per creare una lunga incisione.
   3. Appuntare la pelle del lombrico a 33 mm di distanza, praticando un'apertura di 27 mm per esporre il recipiente, utilizzando solo quattro perni per esporre correttamente il recipiente. I perni possono essere aggiunti o spostati, una volta che il lombrico è stato bloccato, per aiutare a manipolare la pelle del lombrico.
   4. Con le forbici chirurgiche, fai un'incisione per raggiungere l'altro perno sul lato del suo corpo. Spingendo verso l'alto verso la pelle, previene qualsiasi danno all'interno del lombrico, come il taglio del sistema vascolare o intestinale.
   5. Una volta praticata l'incisione, appuntare o ri-spillare dove è stata praticata la prima incisione e poi alla fine del taglio.
   6. Utilizzando entrambi gli strumenti chirurgici (impugnature chirurgiche), muovere la pelle per esporre l'interno del lombrico.
   7. Fissa la pelle sul fondo mentre la pelle viene spostata e, mentre sali il lombrico, continua a separare accuratamente la pelle dagli organi. Una volta in cima, posiziona l'ultimo spillo.
   8. Se il vaso non è esposto, tirare i lati opposti della pelle del lombrico per separare il tessuto elastico del lombrico per esporre il vaso ventrale e separare ulteriormente la pelle.
      NOTA: Questo strattone rimuoverà parte del tessuto che trattiene gli organi all'interno del lombrico. Fai attenzione a questo passaggio, poiché potrebbe rompere involontariamente i vasi del lombrico. Il vaso ventrale dovrebbe ora essere esposto e il cordone nervoso può funzionare come un marcatore del vaso, perché il cordone nervoso corre lungo la pelle proprio accanto e parallelamente al vaso ventrale. Se il vaso ventrale è vicino all'intestino, uno strattone sulla pelle può esporre ulteriormente il vaso. In caso contrario, spingi l'intestino di lato, ma ciò potrebbe causare un'area di lavoro disordinata.
3. Esposizione del sistema vascolare del lombrico, il vaso dorsale (metodo 2)
   NOTA: I passaggi per esporre il vaso dorsale sono simili all'esposizione del vaso ventrale.
   1. Ripetere i passaggi 3.2.1 - 3.2.3 del passaggio 3.2. La parte scura della pelle dovrebbe essere rivolta verso l'alto per questi passaggi.
   2. Usa le forbici chirurgiche per tagliare verso il centro del lombrico sul lato opposto.
   3. Dal centro del lombrico, praticare un'incisione verso la parte anteriore del lombrico, la testa. Spingendo verso l'alto verso la pelle si evitano danni all'interno del lombrico, come il taglio del vaso o dell'intestino.
   4. Una volta effettuato il taglio diagonale, appuntare o riappuntare il sito della prima incisione e poi al termine del taglio che è stato effettuato.
   5. Ripetere i passaggi 3.2.6 - 3.2.9 del passaggio 3.2.
      NOTA: Il vaso dorsale dovrebbe ora essere esposto.
4. Esposizione della vascolarizzazione del lombrico, vista dall'alto dei cuori (metodo 3)
   1. Utilizzare un tampone di gomma durante la procedura chirurgica per bloccare il lombrico, esponendo così il vaso di interesse per il ricercatore.
   2. Per esporre chirurgicamente il lombrico, posizionalo sul suo lato ventrale, la parte chiara del lombrico. La parte scura della pelle dovrebbe essere rivolta verso l'alto.
   3. Usa quattro spilli per tenere premuta la pelle del lombrico e per creare una finestra per esporre i cuori di interesse. Un perno aggiuntivo, per un totale di cinque, può essere utilizzato per tenere premuto il lombrico vicino alla punta della sua testa, l'estremità anteriore.
   4. Inizia a bloccare il lombrico dal basso verso l'alto, iniziando dal lato destro e poi spostandoti sul lato sinistro. Appunta il lombrico, posizionando due spilli sulla parte superiore vicino alla punta della testa, all'estremità anteriore e due vicino al clitello.
   5. Con l'aiuto di una lama si pratica, sul lato del lombrico viene praticata una piccola incisione di circa 1 mm.
   6. Usa una forbice chirurgica per tagliare verso il centro del lombrico sul lato opposto.
   7. Dal centro del lombrico, fai un taglio verso la parte anteriore del lombrico fino a raggiungere la bocca del lombrico, l'estremità anteriore.
      NOTA: È importante che le forbici siano sollevate contro la pelle per evitare di tagliare il sistema vascolare; La lama delle forbici è visibile mentre si passa attraverso la pelle. Assicurati che il taglio sia fatto all'estremità anteriore del lombrico in quanto ciò fornirà una migliore visibilità dei cuori.
   8. Una volta appuntato, riappunta il lombrico, se la pelle si arriccia nel lombrico.
   9. Fai uno strattone per separare correttamente il tessuto del lombrico per esporre correttamente i cuori.
   10. Se i cuori non sono esposti, muovi le vescicole seminali bianche, poiché i cuori a volte si nascondono sotto queste vescicole.
       NOTA: L'esposizione al cuore può variare da lombrico a lombrico, tutti e 10 i cuori possono essere visibili o solo la metà e così via. A questo punto, il ricercatore deve determinare se spostare organi e tessuti per localizzare i cuori del lombrico.
5. Esposizione della vascolarizzazione del lombrico, vista laterale dei cuori (metodo 4)
   1. Utilizzare un tampone di gomma durante la procedura chirurgica per bloccare il lombrico, esponendo così il vaso di interesse per il ricercatore.
   2. Per esporre chirurgicamente il lombrico, posizionalo su un lato. Poiché il lombrico è su un fianco, sia il lato chiaro che quello scuro del lombrico dovrebbero essere visibili.
   3. Ripetere i passaggi 3.4.3 - 3.4.9 dal passaggio 3.4.
   4. Se i cuori non sono esposti, muovi le vescicole seminali bianche, poiché i cuori a volte si nascondono sotto queste vescicole.
      NOTA: L'esposizione al cuore può variare da lombrico a lombrico, tutti e cinque i cuori possono essere visibili o meno. A questo punto, il ricercatore deve determinare se spostare organi e tessuti per localizzare i cuori del lombrico.

4. Somministrazione di composti nel sistema vascolare dei lombrichi

1. Preparazione del lombrico per la somministrazione del composto
   NOTA: Per questi passaggi specifici, abbiamo iniettato agenti di contrasto, microbolle, nel sistema vascolare del lombrico come composto di interesse.
   1. Prima della microiniezione, posizionare il lombrico nella fase di microiniezione e utilizzare una salvietta da laboratorio per rimuovere eventuali liquidi attorno al vaso di interesse, esponendo così il sistema vascolare per l'iniezione.
      NOTA: Non applicare una forte pressione perché causerebbe sanguinamento del recipiente.
   2. Allineare il sistema vascolare di interesse alla micropipetta, poiché è importante che il vaso ventrale sia allineato per l'iniezione. Se i cuori sono di interesse, devono essere perpendicolari alla micropipetta.
   3. Focalizzare il microscopio sul sistema vascolare di interesse e iniziare ad abbassare la micropipetta verso il sistema vascolare. Prima di spostare uno qualsiasi dei manipolatori del joystick, verificare che siano tutti impostati su 0 mm per garantire la migliore mobilità.
   4. Quando la punta della micropipetta è a contatto con il recipiente dei lombrichi, assicurarsi che l'angolo tra il recipiente e la micropipetta sia inferiore a 15°.
   5. Una volta che la micropipetta inizia ad applicare pressione sul vaso, il sangue si allontanerà dalla punta a causa della pressione sul sistema vascolare. Questa è una buona indicazione del corretto posizionamento dell'iniezione.
   6. Per garantire il successo dell'iniezione, utilizzare il joystick per spostare la micropipetta in avanti fino a entrare in contatto con il sistema vascolare.
      NOTA: È importante non forare il recipiente. Si noti che la punta deve spostare il sistema vascolare, per il vaso dorsale e ventrale, nella direzione in cui si muove la micropipetta, quindi è necessario utilizzare il quadrante grossolano per spostare la punta della micropipetta in avanti per consentire la penetrazione completa nel vaso. Se la piastra è mobile, questa può essere utilizzata per spostare e perforare il recipiente nella micropipetta invece di utilizzare i microcontrollori o tutti contemporaneamente. Il recipiente non verrà penetrato immediatamente, ma un rinculo del recipiente è un indicatore della corretta penetrazione della micropipetta. Una volta che la punta è penetrata nel recipiente, il recipiente deve essere dritto e allineato con la micropipetta. In caso contrario, ritrarre lentamente la micropipetta utilizzando il controllo di precisione.
   7. Premere il pedale per iniettare la vascolarizzazione del lombrico. La diluizione del sangue è un altro indicatore di una corretta penetrazione una volta premuto il pedale.
   8. Ritrarre lentamente la micropipetta ed estrarla.
      NOTA: In alternativa, rompere la punta mentre la micropipetta è ancora nel recipiente è un metodo efficace per evitare la perdita di sangue.

I seguenti risultati rappresentativi si basano su una serie di parametri specifici che includono le impostazioni utilizzate per estrarre la pipetta di vetro, la dimensione dell'apertura della pipetta formata da un dato angolo di smussatura e la pressione e il tempo delle microiniezioni. Nella Figura 1 viene visualizzato uno schema del flusso che rappresenta il processo dall'inizio alla fine.

In base ai parametri dell'estrattore pe...

Mentre il lombrico è in etanolo al 10%, in particolare se il lombrico è di età avanzata, potrebbero esserci effetti indesiderati per tempi di esposizione superiori a 30 minuti; L'intestino inizierà a deteriorarsi e quando il lombrico viene aperto chirurgicamente, il suo intestino interno si allarga. Pertanto, si incoraggia l'uso di lombrichi giovani e di mezza età. Durante il processo di taglio della pelle del lombrico, è imperativo che non venga eseguito un taglio completo a forbi...

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato finanziato dalla NSF-FDA Scholar-in-Residence Fellowship (NSF-FDA SIR, #1641221), dalla Food and Drug Administration Office Chief Scientist Challenge Grant (FDA OCS) della National Science Foundation, dal National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (NSF IGERT, #1144646) e supportato dall'Office of Science and Engineering Laboratories (OSEL) presso la Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti.