JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ديدان الأرض هي لافقاريات جديدة في الجسم الحي نموذج على مقاعد البدلاء لدراسات الأوعية الدموية. نقدم تقنيات ومعدات تسمح بالجراحة الفعالة والحقن المجهري في الأوعية الدموية لدودة الأرض. يتم وصف البروتوكولات الجراحية وتقنيات الحقن المجهري وإجراءات إنتاج الماصات الدقيقة المصنوعة خصيصا.

Abstract

على الرغم من أن الفقاريات لا غنى عنها في البحوث الطبية الحيوية ، إلا أن الدراسات غالبا ما تكون محدودة بعوامل مثل التكلفة والمراجعة الداخلية المطولة والاعتبارات الأخلاقية. نقدم دودة الأرض كلافقاريات بديلة منخفضة التكلفة قابلة للتطبيق على بعض دراسات الأوعية الدموية الأولية. نظرا للتوافر الجراحي للأوعية الظهرية لدودة الأرض ، والأوعية البطنية ، وخمسة أزواج من القلوب الزائفة ، يمكن الوصول بسهولة إلى ديدان الأرض ، وتوفر صيانة منخفضة التكلفة ، وتتطلب إعطاء جرعات صغيرة فقط من مركب معين. يوفر نموذج دودة الأرض نظاما بسيطا مغلقا للدورة الدموية مع بنية هيموجلوبين مشابهة لدم الإنسان. يتم توفير بروتوكول لتخدير ديدان الأرض وإجراء شقوق جراحية لكشف الأوعية الدموية ذات الصلة. يتم تشكيل الماصات الدقيقة للإدارة المركبة عن طريق تسخين الزجاج وسحبه باستخدام مجتذب ماصة واستخدام نظام شطف لإنشاء طرف إبرة دقيقة بمقياس ميكرون. ثم يتم استخدام النصائح مع جهاز تحديد المواقع الدقيقة والحاقن الدقيق لحقن مركبات تعسفية في نظام الأوعية الدموية لدودة الأرض ، بشكل متكرر ، مع توافر أحجام عينات كبيرة وأحجام مركبة صغيرة. يتم توفير تفاصيل حول تعقيدات إجراء الحقن. يمثل حجم الوعاء الصغير لدودة الأرض تحديا ، خاصة في حالة الوعاء البطني. ومع ذلك ، فإن إتقان التقنيات المقدمة يوفر قابلية عالية للتكرار كحل منخفض التكلفة ، مما يجعل دراسات حجم العينة الكبير جدا عملية.

Introduction

تم استخدام دودة الأرض كمؤشر حيوي مهم ومقايسة حيوية للتطبيقات العلمية السابقة1،2،3،4،5،6. وهو كائن حي مثالي لتقييم المخاطر البيولوجية الناجمة عن النفايات الخطرة والسامة في البيئات الأرضية لدراسات التراكم الأحيائي في الموقع والتراكم الأحيائي ، مثل المبيدات الحيوية (المبيدات الحشرية) في التربة والآثار السمية البيئية الضارة7،8،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب التنقيب البيولوجي ، تعد دودة الأرض مصدرا بديلا لجزيئات تحلل الفيبرين ، ومضادة للتخثر ، ومضادة للميكروبات ، ومضادة للسرطان11،12. لدرجة أن فريقا في عام 1991 استخرج ونقيته من جلد دودة الأرض ووضعه على أورام الثدي لفئران SHN ، مما أدى إلى تثبيط نموالورم 13. دودة الأرض هي أيضا نموذج حيواني مفيد من الناحية التربوية ، حيث يمكن استخدامها لتعريض الطلاب للجراحة وفهم تشريح العينة. من دراسة الدورة الدموية إلى الفيزيولوجيا الكهربية14،15.

في بحثنا الخاص ، قمنا بفحص استجابة أوعية ديدان الأرض الحية للموجات فوق الصوتية عاليةالكثافة 18. وجدنا أن تمزق الأوعية الدموية في الدودة حدث في ظل ظروف مشابهة لتلك التي ربطناها بتلف التمزق في الأوعية الدقيقة البشرية. يتضمن عملنا المستمر حقن الفقاعات الدقيقة في الأوعية الدموية لدودة الأرض. تتكون الفقاعات الدقيقة من غاز ثقيل مغطى بغلاف دهني أو ألبومين أو بوليمر ، ويمكن استخدام هذه العوامل كعوامل تباين للصور بالإضافة إلى مركبات لتوصيل الأدوية المستهدفة.

هذا البروتوكول الجديد وثيق الصلة بأي دراسة من شأنها أن تستفيد من الحقن الوريدي (IV) لمركب يمكن أن يستخدم المؤشرات الحيوية الطبيعية لدودة الأرض. يعتمد هذا النهج على الحقن المجهري الوريدي في واحدة من عدة نقاط دخول محتملة ، بما في ذلك أي من القلوب الزائفة المكونة من خمسة أزواج لدودة الأرض ، والوعاء الظهري ، والوعاء البطني. يتضمن الإجراء شقا جراحيا مفصلا لكشف الأوعية الدموية ، يليه حقن يتم التحكم فيه بواسطة محدد الموضع الدقيق. يتم تحقيق ذلك باستخدام ماصات دقيقة مخصصة مصممة خصيصا للحقن المجهري للأوعية الدموية لدودة الأرض. تسمح هذه الماصات الدقيقة بالاستهداف الدقيق للأوعية الصغيرة التي يصل قطرها إلى 90 ميكرومتر.

تم تصميم هذا البروتوكول لتحسين تقنيات سحب العينات الدقيقة السابقة ، بما في ذلك دراسة أجريت عام 1948 لاستخراج دم دودة الأرض والبول16. كما هو موضح في الشكل S1 ، قد يكون إعداد هذا الاستخراج صعبا ، وكما ذكر المؤلف ، يمكن أن يستغرق ما يصل إلى ساعة واحدة أو أكثر. تم تطوير طريقة مماثلة في عام 1970 ، لكن المؤلف عانى من العديد من الأطراف المكسورة أثناء حقن السوائل في الألياف العملاقة لدودة الأرض17. في الطريقة الحالية الموضحة أدناه ، يستغرق استخراج الدم من ثوان إلى دقائق وهو ذو صلة بكل من حقن المركبات واستخراج سوائل دودة الأرض. في هذه الحالة بالذات ، قمنا بحقن عوامل التباين ، الفقاعات الدقيقة.

Protocol

1. تحضير الماصة الدقيقة: سحب الزجاج وطرف الميلا

  1. سحب الماصة الدقيقة
    1. قم بتشغيل مجتذب الماصة الدقيقة وحدد برنامجا لإدخال معلمات محددة للحقن المجهري لدودة الأرض.
    2. اضبط المعلمات على الضغط = 500 ، والسحب = 75 ، والوقت = 250 ، والحرارة = 336 ، والسرعة = 70. قد تختلف النتائج من مجتذب إلى مجتذب. لذلك ، جرب المعلمات لتحقيق الطرف المطلوب (الحجم ، الحدة ، الشكل ، إلخ).
    3. تأكد من إجراء اختبار RAMP لتحديد القيمة الحرارية للماصات الدقيقة قبل سحبها، لأن عدم القيام بذلك قد يؤدي إلى حرق خيوط الحوض الصغير أو كسر الزجاج.
    4. إذا كان ضغط الهواء بحاجة إلى التغيير، فاضغط على زر المسح وحدد رقم (0) عندما يطلب منك مسح جميع القيم، وحدد تغيير الضغط (2). قد تختلف هذه العملية من مجتذب إلى مجتذب. لذلك ، ابحث عن دليل الأداة لتغيير إعدادات الضغط.
    5. افتح غطاء مجتذب الماصة الدقيقة وقم بتحميل ماصة دقيقة في المجتذب. كان زجاج الماصة الدقيقة المستخدم عبارة عن زجاج البورسليكات مع ماصة خيوط: طولها 10 سم ، القطر الخارجي: 1.5 مم والقطر الداخلي: 0.86 مم.
    6. حرك الماصة في الأخدود على شكل حرف V من اليمين على طول شق الماصة حتى تتماشى نهاية الماصة مع نهاية حامل الماصة. لضمان انتقال الماصة عبر الفتيل إلى الجانب الآخر، ادفع الماصة إلى أقصى حد ممكن مع التأكد من بقائها مستقرة على شق الماصة.
    7. لقفل الماصة، أحكم ربط المقبض الموجود على الجانب الأيمن وحرك النظام المقفل مع الماصة حتى يصل إلى الجانب الآخر من الساحب من خلال الفتيل. أخيرا ، قم بقفل الجانب الأيسر من الماصة على الساحب. يجب أن تكون الماصة في منتصف الفتيل ؛ انظر الدليل للحصول على إرشادات حول كيفية محاذاة الماصة بشكل صحيح.
    8. بمجرد تحميل الماصة، أغلق المجتذب، واضغط على زر السحب، وانتظر حتى يتم سحب الماصة قبل إزالة الماصتين الناتجتين.
    9. قم بفك المقابض لإزالة الماصات واحرص على عدم قص الماصات أثناء إزالتها من الشق.
    10. ضع الماصات الدقيقة المسحوبة على حامل ماصة دقيقة أو نوع من الدعامة لتثبيت الماصة الدقيقة في مكانها وللسماح بالدوران السهل دون كسر الماصات الدقيقة المسحوبة. لقد قمنا بتطوير حامل الماصة الدقيقة الخاص بنا والذي يمكن إنشاؤه في ورشة ماكينات أو حتى طباعة ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
    11. ضع حامل الماصة الدقيقة تحت المجهر واستخدم برنامج الكاميرا، أو برنامج مشابه، لالتقاط صورة للماصات الدقيقة المسحوبة وتسجيل قطر الطرف باستخدام تكبير 10x ~ 1000 مم و~50 مم من الطرف.
    12. قبل التقاط صورة، تأكد من تطابق إعدادات الكاميرا مع إعداد المجهر (10x)، من أجل القياس بدقة، خاصة لقياسات ما بعد التصوير. تم العثور على الإعداد 10x في شريط الأدوات الأفقي الموجود بالقرب من الجزء العلوي من الشاشة.
    13. لعرض صورة الماصة الدقيقة والتقاطها، حدد الكاميرا على برنامج الكاميرا الموجود في الزاوية العلوية اليسرى واضغط على زر الانطباق بعد التركيز البؤري على الطرف للحصول على قراءة دقيقة. يوجد زر الانطباق على شريط الأدوات الأفقي على الجانب الأيسر من الصفحة أسفل علامة تبويب الكاميرا.
    14. خذ قياسات الماصات الدقيقة المسحوبة لتحديد ما إذا كان قد تم تحقيق حجم الطرف المطلوب والاتساق. يكفي سحب ما يصل إلى 5 ماصات لتحديد ما إذا كان الساحب ومعلماته ينتجان الحجم المطلوب باستمرار. إذا لم يتم تحقيق حجم الطرف المطلوب، أو إذا استمر تغيير الحجم لكل ماصة، فقد يحتاج الباحث إلى تجربة إعدادات مختلفة حتى يتم تحقيق حجم الطرف المطلوب، أو قد يكون من الضروري إصلاح موضع الفتيل والماصة، الأمر الذي قد يتطلب الرجوع إلى دليل مجتذب الماصة.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  2. الإعداد لشطبة الماصة الدقيقة واستخدام مقياس مقاومة القطب الكهربائي
    1. لشطبة الماصات الدقيقة المسحوبة، استخدم شطبة ماصة دقيقة مزودة بمقياس مقاومة قطب كهربائي ومجهر استريو 40x.
      ملاحظة: يمكن استخدام المشطوف الأخرى ؛ حتى الميول الداخلية ناجحة ، بالإضافة إلى إمكانية تحقيق تكوينات مختلفة باستخدام مجاهر مختلفة لفحص عملية الشطف ، بما في ذلك تركيب الكاميرا على المجهر.
    2. قم بتجميع قاعدة التمثال / لوحة الطحن مع اللوحة الدقيقة بين الحاملين الأسود.
    3. ضع اللوحة السفلية بحيث يكون المغناطيس متجها بعيدا عن اللوحة.
    4. قم بربط الأجزاء الثلاثة معا: (1) حلقة التثبيت العلوية ، (2) لوحة الطحن الدقيقة ، و (3) حلقة التثبيت السفلية (مغناطيسية). تحديد السطح الكاشطة للوحة الطحن ؛ بالنسبة للوحة الدقيقة ، فهي ذات لون أرجواني ويجب أن تكون متجها لأعلى بحيث يكون الزجاج ملامسا مع مسطح الكوارتز البصري.
    5. ضع خمس قطرات من زيت الركيزة المشطوف ، أو حسب العدد المطلوب ، على المسطح البصري الكوارتز لأداة الشطف وضع اللوحة المجمعة في الأعلى. يمكن أن يستمر هذا الزيت طوال اليوم ، ولكن إذا اهتزت اللوحة أو لم تدور عندما ينبغي ، فقد تحتاج إلى إعادة تزييت مسطح الكوارتز البصري.
    6. قم بتدوير اللوحة يدويا عدة مرات لنشر الزيت ومن ثم يمكن تشغيل الجهاز.
    7. لإعداد مقياس المعاوقة ، أضف محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) على الفتيل ، وهو السلك المرجعي ، وضع الفتيل على لوحة الشطف. انقع الشريط لعمل دائرة باستخدام الماصة الدقيقة ، وقم بتغطية اللوحة بطبقة رقيقة من المحلول الملحي.
    8. قم بتوصيل جزء الرصاص بنهاية السلك المتصل بمقياس المعاوقة.
    9. اقلب مفتاح "التشغيل" على مقياس المعاوقة واتركه في وضع "الاستعداد" حتى يصبح جاهزا لبدء الشطف. نظرا لأننا نقوم بإنشاء فتحة كبيرة ، اضبط مقياس مقاومة القطب الكهربائي على x0.1 عندما تكون جاهزا للشطبة.
  3. تحميل الماصة الدقيقة والشطف
    1. قم بتحميل الماصة الدقيقة على مشبك الماصة الموجود على المناور وشد المقبض لتثبيته في مكانه أثناء الشطف.
    2. من خلال الطرف الخلفي للماصة الدقيقة، املأ الماصة بالكامل بالمحلول الملحي، وأدخل السلك في الماصة الدقيقة، لضمان عدم وجود فقاعات هواء في الماصة الدقيقة. لقد لوحظ أن وجود فقاعات هواء في الماصة الدقيقة يسبب تباينا في القياسات.
    3. قم بتشغيل مقياس المقاومة عن طريق التبديل من "وضع الاستعداد" إلى "x0.1". يجب أن تكون المقاومة في البداية 100 MΩ وعندما يلامس طرف الماصة الدقيقة المحلول الملحي ، يجب أن يعرض قراءة مختلفة.
    4. لشطبة حجم فتحة الطرف الصحيح، قبل خفض الماصة الدقيقة، اضبط الزاوية على 35 درجة على المعالج لتحقيق شطف متسق. زاوية 30 درجة كافية أيضا ولكن بين الاثنين ، 35 درجة تحمل انحرافا معياريا أقل ، وبالتالي أكثر اتساقا في الشطف وينكسر الطرف أقل.
    5. باستخدام المعالج، ضع طرف الماصة الدقيقة على بعد ثلثي تقريبا من مركز دوران لوحة الطحن.
    6. باستخدام مقبض الضبط الخشن، قم بخفض الماصة الدقيقة بالقرب من اللوحة بحيث يقترب طرف الماصة الدقيقة من المحلول الملحي. إذا لم تكن هناك كاميرا متوفرة ، فمن المهم أن تنظر إلى أسفل المجهر لرؤية شطف الحافة.
    7. بمجرد أن يتلامس طرف الماصة الدقيقة مع المحلول الملحي ، يجب أن تنخفض قراءة مقياس المعاوقة من 100 MΩ إلى قيمة تتراوح بين 80 و 20 MΩ. ستختلف هذه القيمة بسبب فتحة الزجاج المسحوبة.
    8. في هذه المرحلة، قم بالتبديل من مقبض الضبط الخشن إلى مقبض الضبط الدقيق لخفض الماصة بشكل أبطأ لتجنب كسر الطرف الموجود على اللوحة. من المهم مراقبة مقياس المعاوقة والحافة في وقت واحد في هذه المرحلة من الشطف.
    9. أثناء الشطف ، لاحظ تغير حجم الطرف ، واستخدم الإضاءة للمساعدة في إنشاء نقطة مراقبة جيدة أثناء الشطف.
      ملاحظة: سيصبح الطرف لامعا للغاية عند حدوث الشطف ، وستصبح فتحة الطرف أكبر. من الضروري استخدام مقبض الضبط الدقيق الموجود على المناور لخفض الماصة الدقيقة أو رفعها في هذه المرحلة. بمجرد رفع الماصة الدقيقة عن اللوحة، يمكن أن يتسبب إعادتها إلى اللوحة إلى كسر الطرف.
    10. استمر في خفض الطرف ببطء حتى يصل إلى لوحة الشطف وشطبة ببطء حتى يتم الوصول إلى مقاومة تبلغ حوالي 20 MΩ. سيكون إتقان هذه العملية منحنى تعليميا قويا وسيتطلب الأمر ممارسة لشطبة الطرف باستمرار.
    11. عند الوصول إلى مقاومة 20 MΩ ، ارفع الماصة الدقيقة من الشطوف.
    12. قم بإزالة الرصاص من الماصة الدقيقة وتفريغ الماصة الدقيقة من الشطوف. إذا تركت على المشطوف ، يمكن أن تنكسر الماصة الدقيقة أو تخلق فتحة أكبر عند طرفها ؛ لذلك ، من الضروري مراقبة العداد والحافة أثناء الشطف.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
    13. ضع الماصة الدقيقة المشطوفة على حامل الماصة الدقيقة واستخدم هدف 10x على برنامج المجهر لقياس حجم فتحة الطرف. حجم العينة المكون من 10 نصائح مناسب للتحقق من الاتساق في جميع الأطراف المشطوفة.
    14. تأكد من أن إعداد المجهر (10x) يطابق إعدادات الكاميرا قبل التقاط صورة. قد يتم التخلص من القيم المتطرفة بعد قياسات فتح الطرف.
    15. لإيقاف تشغيل الشطوف ، قم بتشغيل المفتاح إلى "إيقاف التشغيل" على كل من محرك حزام القيادة ومقياس المقاومة.
    16. قم بفك قاعدة التمثال / لوحة الطحن لإزالة حلقة التثبيت العلوية. لا ترفع قاعدة التمثال / لوحة الطحن أثناء توصيلها ببعضها البعض لأنها يمكن أن تنكسر بسبب الفراغ الناشئ.
    17. بعد رفع حلقة التثبيت العلوية للمرفق بالبراغي ، حرك لوحة الطحن الدقيقة ، وارفع آخر مرفق مغناطيسي لإزالته. قم بإزالة الزيت الزائد على الكوارتز البصري المسطح باستخدام مناديل المختبر.
    18. نظف المكونات الثلاثة بالماء منزوع الأيونات (DI) وجففها لتجنب تكون بلورات الملح. بعد فترات طويلة من الاستخدام ، قد تتعرض القاعدة المغناطيسية الدوارة للاهتزاز. إذا حدث هذا ، قم برش كمية صغيرة من ماء DI على حزام القيادة لإزالة أي ملح متبلور.
    19. امسح الزيت الزائد الموجود على الجزء الخلفي من لوحة الطحن وكذلك على سطح الكوارتز البصري.
    20. استخدم ماء DI على منصة الشطف لإزالة أي محلول ملحي زائد قد يكون على الجهاز لتجنب التبلور.
    21. استخدم ماء DI لغسل الأطراف المشطوفة. إذا لم يتم غسل الأطراف ، فسوف تتبلور ولكن يمكن غسلها بسهولة بماء DI لاحقا.
    22. ضع الطين داخل صفيحة واستخدم زجاج الغطاء لمنع الماصات الدقيقة من التلوث.
    23. قم بعمل مسافات بادئة في الطين لتثبيت الماصات الدقيقة. عندما تكون جاهزة للاستخدام ، تكون الأطراف المشطوفة جاهزة الآن لإعادة ملئها بمركب ذي أهمية وحقنها في الأوعية الدموية لدودة الأرض. بالنسبة لمثال البروتوكول هذا ، تم استخدام عوامل التباين ، الفقاعات الدقيقة ، كمركب محل اهتمام.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. معايرة الحاقن الدقيق مع أطراف مشطوفة

  1. تحضير طبق مغلف كاره للماء.
    1. في اليوم السابق ، قم بتغطية طبقين بطبقة كارهة للماء على السطح للعلاج طوال الليل. يجب أن تكون هذه المادة الكيميائية من مواد يتم شراؤها من المتجر أو من مواد مختبرية داخلية ، إن وجدت ، وهناك حاجة إلى 12 ساعة على الأقل للمعالجة.
    2. الطلاء هو عملية سريعة من خطوتين. رش بالطبقة الأساسية ثم رشها بالطبقة العلوية.
    3. في غطاء المحرك ، أو في مكان مفتوح ، قم برش الطبقة الأساسية على الطبق بعد هز الطبقة الأساسية بقوة بمجرد أن تهتز كرات الخلط لمدة دقيقة واحدة.
    4. رش اللوحة بطبقة القاعدة على بعد حوالي 6-12 بوصة من السطح عن طريق القيام بتمريرات أثناء طلاء اللوحة. تتكون الممرات من يمر الضوء من اليمين إلى اليسار ثم لأعلى ولأسفل. استمر في الاهتزاز أثناء طلاء اللوحة وتأكد من عدم الإفراط في الرش لأنه سيقلل من أداء المنتج.
    5. انتظر 1-2 دقيقة قبل وضع طبقة أخرى من طبقة القاعدة. على الرغم من أنه ليس ضروريا ، إلا أنه يمكن تطبيق الطلاء الإضافي إذا رغبت في ذلك.
    6. انتظر 30 دقيقة حتى يجف الطبقة الأساسية.
    7. كرر الخطوات 2.1.3 - 2.1.5 للطبقة العلوية.
    8. بمجرد أن تنضج اللوحة طوال الليل أو لمدة 12 ساعة على الأقل ، تصبح اللوحة جاهزة للتعبئة بالزيت المعدني. املأ الطبق في منتصف الطريق تقريبا بالزيت المعدني.
    9. ضع اللوحة بالزيت المعدني على مرحلة الحاقن الدقيق.
  2. قم بتحميل الأطراف المشطوفة على الحاقن الدقيق.
    1. قم بتوصيل الحاقن الدقيق مباشرة بنفاثة هواء مضغوط في المختبر. يمكن استخدام أسطوانة النيتروجين المضغوطة ومنظم الضغط لهذا النظام ، ولكن لاحظ أن أنظمة الحاقن الدقيق الأخرى قد تتطلب واجهة مختلفة.
    2. افتح الهواء المضغوط وافتح منظم خط الهواء منخفض الضغط إلى 70 رطل لكل بوصة مربعة وقم بتشغيل الحاقن الدقيق. لا تتجاوز 80 رطل لكل بوصة مربعة ، حيث لا يمكن للنظام التعامل مع أكثر من 80 رطل لكل بوصة مربعة.
    3. قم بإعادة ملء الأطراف بالماء باستخدام حقنة سعة 1 مل بإبرة محور معدني. إذا كان القطر الداخلي للماصة مختلفا ، فستكون هناك حاجة إلى إبرة معدنية مختلفة لاستيعابها.
    4. بمجرد ردمها بالماء ، قم بتحميل الماصة الدقيقة على حامل الإبرة لجهاز المعالجة الدقيقة بعصا التحكم. يمكن استخدام حاقنات دقيقة ومعالجات دقيقة مختلفة.
  3. قم بإنشاء فقاعات ماء لمعايرة حجم التوزيع من خلال ماصة دقيقة مشطوفة.
    ملاحظة: قبل إدخال أي إعطاء مركب في الأوعية الدموية لدودة الأرض ، يجب معايرة الحاقن الدقيق لتحديد الحجم المناسب للحقن.
    1. اضبط المعلمات على الحاقن الدقيق للضغط عند 4 رطل لكل بوصة مربعة والوقت عند 0.5 ثانية. سيؤدي تجاوز هذه المعلمات إلى تشويه حجم الوعاء ، وهو أمر غير موات ، إلا إذا كان هدف الباحث هو دراسة تمدد السفينة.
    2. اخفض طرف الماصة حتى يقترب من قاع اللوحة ولكن احرص على عدم كسر الطرف الموجود أسفل اللوحة. كلما انخفض الطرف في الزيت المعدني ، كلما كان أكثر لزوجته على الحافة ، مما قد يؤدي إلى الكسر.
    3. ابدأ من حافة اللوحة للاستفادة الكاملة من اللوحة أثناء المعايرة.
    4. بمجرد أن يصبح هذا في موضعه ، اضغط على الدواسة لتوزيع فقاعة ماء في الزيت.
    5. قد تظل الفقاعة عالقة على الحافة. لعلاج ذلك، اسحب اللوحة بسرعة بعيدا في الاتجاه المعاكس من الفقاعة لفصلها عن طرف الماصة.
    6. باستخدام برنامج الكاميرا ، قم بقياس حجم الفقاعة وحساب مستوى الصوت. في حالة عدم توفر برنامج كاميرا، يمكن استخدام برنامج بديل.
    7. قم بإنشاء 10 فقاعات وقياس متوسط قطر الفقاعة لتحديد الحجم الصحيح الذي ستوزعه الماصة الدقيقة في الأوعية الدموية لدودة الأرض.
      ملاحظة: إذا كان الباحث مهتما بتوزيع مجموعة متنوعة من الأحجام ، فيمكن التلاعب بمعلمات الضغط والوقت. كرر الخطوات 2.3.1 - 2.3.7.

3. التحضير لجراحة دودة الأرض لفضح الأوعية الدموية المحددة لدودة الأرض ذات الأهمية

  1. تحضير وقياسات دودة الأرض
    1. تحضير محلول الإيثانول بنسبة 10٪ الذي سيؤدي إلى تخدير ديدان الأرض قبل الجراحة.
    2. احتفظ بديدان الأرض في دورق سعة 100 مل مع تربة بين التجارب.
    3. احتفظ ب 5-10 ديدان أرضية فقط في المرة الواحدة في الدورق لمنع ديدان الأرض من الجفاف بسبب التغييرات المفاجئة من الثلاجة إلى سطح الطاولة ، من 4 درجات مئوية إلى 25 درجة مئوية.
    4. ضع ديدان الأرض في 10٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة. إذا كانت دودة الأرض لا تزال تتحرك بعد 30 دقيقة ، اتركها في محلول الإيثانول لمدة 5 دقائق إضافية.
      ملاحظة: في بعض الأحيان تحتاج دودة الأرض إلى مزيد من الوقت بسبب حجمها. لذلك ، قد يلزم تعديل الوقت في الإيثانول وفقا لحجم دودة الأرض ، ولكن لا يتجاوز أكثر من ساعة. أكثر من ساعة ستضر دودة الأرض.
    5. اشطف دودة الأرض تحت ماء الصنبور لإزالة الوحل الذي تنتجه والإيثانول.
    6. ضع دودة الأرض على منشفة ورقية لإزالة الماء الزائد.
    7. بمجرد تخدير دودة الأرض ، سجل وزن كل دودة أرض (جم) وعرضها (مم) وطولها (مم) وعرض الوعاء (ميكرومتر). خذ وزن وأبعاد دودة الأرض قبل إجراء أي شقوق ودون شد دودة الأرض.
    8. بمجرد تعرض الوعاء جراحيا تحت المجهر ، استخدم برنامج الكاميرا لقياس عرض السفينة. إذا لم يكن هناك برنامج كاميرا متاح ، فستكون المسطرة الدقيقة غير القابل للصدأ كافية ، على الرغم من أنها ليست دقيقة مثل قياس البرنامج الرقمي.
      ملاحظة: اعتمادا على الوعاء المثير للاهتمام ، انتقل إلى الخطوة 3.2 (الوعاء البطني) أو 3.3 (الوعاء الظهري) أو 3.4 (المنظر العلوي للقلوب) أو 3.5 (منظر جانبي للقلوب).
  2. تعريض الأوعية الدموية لدودة الأرض ، الوعاء البطني (الطريقة 1)
    1. استخدم وسادة مطاطية أثناء العملية الجراحية لتثبيت دودة الأرض لأسفل وبالتالي تعريض الوعاء الذي يثير اهتمامه للباحث. يجب أن يكون الجزء المظلم من الجلد متجها لأسفل.
    2. لفتح دودة الأرض جراحيا ، ضعها على جانبها الظهري ، الجزء الداكن من دودة الأرض ، حيث يتم إجراء شق جانبي صغير على الجلد يبلغ حوالي 1 مم بشفرة. يسمح هذا الشق الصغير بدخول المقص الجراحي لإنشاء شق طويل.
    3. قم بتثبيت جلد دودة الأرض على بعد 33 مم ، مما يجعل فتحة 27 مم لكشف الوعاء ، باستخدام أربعة دبابيس فقط لكشف الوعاء بشكل صحيح. يمكن إضافة المسامير أو نقلها ، بمجرد تثبيت دودة الأرض ، للمساعدة في التلاعب بجلد دودة الأرض.
    4. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق للوصول إلى الدبوس الآخر على جانب جسمه. عن طريق الدفع نحو الجلد ، فإنه يمنع أي ضرر في داخل دودة الأرض ، مثل قطع الأوعية الدموية أو الأمعاء.
    5. بمجرد إجراء الشق ، قم بتثبيت أو إعادة التثبيت حيث تم إجراء الشق الأول ثم في نهاية القطع.
    6. باستخدام كلتا الأداتين الجراحيتين (المقابض الجراحية) ، حرك الجلد لكشف دودة الأرض من الداخل.
    7. قم بتثبيت الجلد في الأسفل أثناء تحريك الجلد ، وأثناء تحريك دودة الأرض ، استمر في فصل الجلد عن الأعضاء بعناية. بمجرد الوصول إلى الأعلى ، ضع الدبوس الأخير.
    8. إذا لم يكن الوعاء مكشوفا ، فقم بالسحب على جانبي جلد دودة الأرض لفصل الأنسجة المرنة لدودة الأرض لكشف الوعاء البطني وفصل الجلد بشكل أكبر.
      ملاحظة: ستزيل هذه القاطرة بعض الأنسجة التي تمسك بالأعضاء داخل دودة الأرض. كن حذرا في هذه الخطوة ، لأنها قد تمزق أوعية دودة الأرض عن غير قصد. يجب الآن أن يكون الوعاء البطني مكشوفا ، ويمكن أن يعمل الحبل العصبي كعلامة على الوعاء الدموي ، لأن الحبل العصبي يمتد على طول الجلد بجوار الوعاء البطني وبالتوازي معه. إذا كان الوعاء البطني قريبا من القناة الهضمية ، فإن شد الجلد يمكن أن يكشف الوعاء الدموي بشكل أكبر. إذا لم يكن الأمر كذلك ، ادفع القناة الهضمية إلى الجانب ، لكن هذا قد يتسبب في منطقة عمل فوضوية.
  3. تعريض الأوعية الدموية لدودة الأرض ، الوعاء الظهري (الطريقة 2)
    ملاحظة: تتشابه خطوات كشف الوعاء الدموي الظهري مع التعرض للوعاء البطني.
    1. كرر الخطوات 3.2.1 - 3.2.3 من الخطوة 3.2. يجب أن يكون الجزء الداكن من الجلد متجها لأعلى لهذه الخطوات.
    2. استخدم مقصا جراحيا للقطع باتجاه منتصف دودة الأرض إلى الجانب الآخر.
    3. من منتصف دودة الأرض ، قم بعمل شق باتجاه الجزء الأمامي من دودة الأرض ، الرأس. يمنع الدفع لأعلى نحو الجلد أي ضرر يلحق بداخلي دودة الأرض ، مثل قطع الوعاء الدموي أو الأمعاء.
    4. بمجرد إجراء القطع القطري ، قم بتثبيت أو إعادة تثبيت موقع الشق الأول ثم في نهاية القطع الذي تم إجراؤه.
    5. كرر الخطوات 3.2.6 - 3.2.9 في الخطوة 3.2.
      ملاحظة: يجب الآن أن يكون الوعاء الظهري مكشوفا.
  4. تعريض الأوعية الدموية لدودة الأرض ، منظر علوي للقلوب (الطريقة 3)
    1. استخدم وسادة مطاطية أثناء العملية الجراحية لتثبيت دودة الأرض لأسفل ، وبالتالي تعريض الوعاء الذي يثير اهتمامه للباحث.
    2. لكشف دودة الأرض جراحيا ، ضعها على جانبها البطني ، الجزء الخفيف من دودة الأرض. يجب أن يكون الجزء المظلم من الجلد متجها لأعلى.
    3. استخدم أربعة دبابيس لتثبيت جلد دودة الأرض وإنشاء نافذة لفضح قلوب الاهتمام. يمكن استخدام دبوس إضافي ، ليصبح المجموع خمسة ، لتثبيت دودة الأرض بالقرب من طرف رأسها ، الطرف الأمامي.
    4. ابدأ في تثبيت دودة الأرض من الأسفل إلى الأعلى ، بدءا من الجانب الأيمن ثم الانتقال إلى الجانب الأيسر. قم بتثبيت دودة الأرض ، ووضع دبابيس في الأعلى بالقرب من طرف الرأس ، والنهاية الأمامية ، واثنان بالقرب من البظر.
    5. استخدم شفرة لعمل شق صغير يبلغ حوالي 1 مم على جانب دودة الأرض.
    6. استخدم مقصا جراحيا للقطع باتجاه منتصف دودة الأرض إلى الجانب الآخر.
    7. من منتصف دودة الأرض ، قم بعمل قطع باتجاه مقدمة دودة الأرض حتى تصل إلى فم دودة الأرض ، الطرف الأمامي.
      ملاحظة: من المهم أن يتم رفع المقص على الجلد لتجنب قطع الأوعية الدموية. تظهر شفرة المقص وأنت تمر عبر الجلد. تأكد من إجراء القطع في الطرف الأمامي لدودة الأرض لأن ذلك سيوفر رؤية أفضل للقلوب.
    8. بمجرد تثبيتها ، أعد تثبيت دودة الأرض ، إذا كان الجلد يلتف في دودة الأرض.
    9. قم بعمل سحب لفصل أنسجة دودة الأرض بشكل صحيح لكشف القلوب بشكل صحيح.
    10. إذا لم تتعرض القلوب ، فحرك الحويصلات المنوية البيضاء حولها ، حيث تختبئ القلوب في بعض الأحيان تحت هذه الحويصلات.
      ملاحظة: قد يختلف التعرض للقلب من دودة الأرض إلى دودة الأرض ، وقد تكون جميع القلوب العشرة مرئية أو نصفها فقط وما إلى ذلك. في هذه المرحلة ، يجب على الباحث تحديد ما إذا كان يجب تحريك الأعضاء والأنسجة من أجل تحديد موقع قلوب دودة الأرض.
  5. تعريض الأوعية الدموية لدودة الأرض ، منظر جانبي للقلوب (الطريقة 4)
    1. استخدم وسادة مطاطية أثناء العملية الجراحية لتثبيت دودة الأرض لأسفل ، وبالتالي تعريض الوعاء الذي يثير اهتمامه للباحث.
    2. لكشف دودة الأرض جراحيا ، ضعها على جانبها. نظرا لأن دودة الأرض على جانبها ، يجب أن يكون كل من الجانب الفاتح والمظلم من دودة الأرض مرئيا.
    3. كرر الخطوات 3.4.3 - 3.4.9 من الخطوة 3.4.
    4. إذا لم تتعرض القلوب ، فحرك الحويصلات المنوية البيضاء حولها ، حيث تختبئ القلوب في بعض الأحيان تحت هذه الحويصلات.
      ملاحظة: قد يختلف التعرض للقلب من دودة الأرض إلى دودة الأرض ، وقد تكون جميع القلوب الخمسة مرئية أو أقل. في هذه المرحلة ، يجب على الباحث تحديد ما إذا كان يجب تحريك الأعضاء والأنسجة من أجل تحديد موقع قلوب دودة الأرض.

4. الإدارة المركبة في الأوعية الدموية لدودة الأرض

  1. تحضير دودة الأرض للإعطاء المركب
    ملاحظة: لهذه الخطوات المحددة ، قمنا بحقن عوامل التباين ، الفقاعات الدقيقة ، في الأوعية الدموية لدودة الأرض كمركب محل أهمية.
    1. قبل الحقن المجهري ، ضع دودة الأرض في مرحلة الحقن المجهري ، واستخدم مناديل معملية لإزالة أي سوائل حول الوعاء محل الاهتمام ، وبالتالي تعريض الأوعية الدموية للحقن.
      ملاحظة: لا تمارس ضغطا قويا لأنه سيسبب نزيفا في الوعاء الدموي.
    2. قم بمحاذاة الأوعية الدموية ذات الأهمية مع الماصة الدقيقة ، حيث من المهم محاذاة الوعاء البطني للحقن. إذا كانت القلوب ذات أهمية ، فيجب أن تكون متعامدة مع الماصة الدقيقة.
    3. ركز المجهر على الأوعية الدموية ذات الأهمية وابدأ في خفض الماصة الدقيقة إلى الأوعية الدموية. قبل تحريك أي من معالجات عصا التحكم، تأكد من ضبطها جميعا على 0 مم لضمان أفضل تنقل.
    4. عندما يكون طرف الماصة الدقيقة ملامسا لوعاء دودة الأرض، تأكد من أن الزاوية بين الوعاء والماصة الدقيقة أقل من 15 درجة.
    5. بمجرد أن تبدأ الماصة الدقيقة في الضغط على الوعاء الدموي ، سيتحرك الدم بعيدا عن الطرف بسبب الضغط على الأوعية الدموية. هذا مؤشر جيد على وضع الحقن المناسب.
    6. لضمان الحقن الناجح، استخدم عصا التحكم لتحريك الماصة الدقيقة للأمام للتلامس مع الأوعية الدموية.
      ملاحظة: من المهم عدم ثقب الوعاء. لاحظ أن الطرف يجب أن يحرك الأوعية الدموية، للوعاء الظهري والبطني، في الاتجاه الذي تتحرك فيه الماصة الدقيقة، ومن ثم يجب استخدام القرص الخشن لتحريك طرف الماصة الدقيقة للأمام للسماح بالاختراق الكامل للوعاء. إذا كانت اللوحة قابلة للتحرك ، فيمكن استخدامها لتحريك الوعاء وثقب الماصة الدقيقة بدلا من استخدام المتحكمات الدقيقة أو كلها في وقت واحد. لن يتم اختراق الوعاء على الفور ، لكن ارتداد الوعاء هو مؤشر على الاختراق الصحيح للماصة الدقيقة. بمجرد أن يخترق الطرف الوعاء ، يجب أن يكون الوعاء مستقيما ومحاذاة مع الماصة الدقيقة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بسحب الماصة الدقيقة ببطء باستخدام التحكم الدقيق.
    7. اضغط على الدواسة لحقن الأوعية الدموية لدودة الأرض. يعد تخفيف الدم مؤشرا آخر على الاختراق المناسب بمجرد الضغط على الدواسة.
    8. اسحب الماصة الدقيقة ببطء واسحب الماصة الدقيقة بعيدا.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يعد كسر الطرف أثناء وجود الماصة الدقيقة في الوعاء طريقة فعالة لتجنب فقدان الدم.

النتائج

تستند النتائج التمثيلية التالية إلى مجموعة من المعلمات المحددة التي تتضمن الإعدادات المستخدمة لسحب الماصة الزجاجية، وحجم فتحة الماصة المكونة من زاوية شطف معينة، وضغط ووقت الحقن المجهري. في الشكل 1 ، يتم عرض مخطط للتدفق يمثل العملية من البداية إلى النها?...

Discussion

في حين أن دودة الأرض تحتوي على 10٪ من الإيثانول ، خاصة إذا كانت دودة الأرض أكبر سنا ، فقد تكون هناك آثار غير مرغوب فيها لأوقات التعرض التي تزيد عن 30 دقيقة. ستبدأ الأمعاء في التدهور ، وعندما يتم فتح دودة الأرض جراحيا ، تنتشر أمعائها الداخلية. لذلك ، يتم تشجيعه على استخدام ديد...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة NSF-FDA Scholar-in-Dream (NSF-FDA SIR ، # 1641221) ، ومنحة تحدي كبير العلماء في مكتب إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA OCS) ، والتدريب التكاملي للدراسات العليا والبحث التابع لمؤسسة العلوم الوطنية (NSF IGERT ، # 1144646) وبدعم من مكتب مختبرات العلوم والهندسة (OSEL) في إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3M Vetbond Tissue Adhesive3M Vetbond084-1469SB3mL bottle vet adhesive - liquid band-aide
40x Stereo MicroscopeSutter Instrument Co.BV-10-DNot needed, can add on other scopes
500 Large WormsWindsor Wholesale Bait500 Large
Beveler pedestal oilSutter Instrument Co.008
BladesTed Pella, Inc121-2
Borosilicate Glass with FilamentSutter Instrument Co.BF150-86-10
CameraAmScopeMU500
CameraAmScopeMU1803-CK8MP USB3.0 Microscope Digital Camera
Electrode Impedance MeterSutter Instrument Co.BV-10-C
EthanolSigma AldrichE7023-1LPure ethanol
FilamentSutter Instrument Co.FT315Btrough filament
Grinding PlateSutter Instrument Co.104DFine Plate
Hospital Grade SalineBaxter Healthcare Corporation2F71240.9% Sodium Chloride Irrigation
Joystick MicromanipulatorNarishigeMN-151
KimWipes Kimtech ScienceKimberly-Clark Professional34155
LeafgroLeafGro5892521.5-cu. ft.
Metal Hub NeedleHamilton91024Luer Lock Metal Needle
Micro Vessel ClipsWPI501779-G
MicroinjectorTriTech ResearchMINJ-D
Micropiette Puller Model P-97Sutter Instrument Co.P-97
Micropipette BevelerSutter Instrument Co.BV-10-B
MicroscopeAmScopeSM-8TPW2-144S3.5X-225X Simul-Focal Articulating Microcope
Needle HolderTriTech ResearchMINJ-4
NeverWetRust-OleumNeverWet
Pyrex GlassCorning08747AFisher Manufacturer
Stainless Micro-RulerTed Pella, Inc13635Micro-Ruler mounted on a Handle, 10mm scale, with lines at 0.01mm intervals
Surgical GripsTed Pella, Inc53073Forceps, Hemostat
Surgical scissorsTed Pella, Inc1320Fine Iris Scissors, Straight
U.S.P. Mineral Oil Lubricant LaxativeSwanMineral Oil

References

  1. Stevenson, J. . The Oligochaeta. , 685 (1930).
  2. Reynolds, J. W., Reynolds, W. M. Earthworms in medicine. American Journal of Nursing. 72 (7), 1273 (1972).
  3. Gates, G. E. The earthworms of Rangoon. Journal of the Burma Research Society. 25, 196-221 (1926).
  4. Carr, L. G. K. Interesting animal foods, medicines, and omens of the eastern Indians, with comparisons to ancient European practices. Journal of the Washington Academy of Sciences. 41 (7), 229-235 (1951).
  5. Price, S. F. Kentucky folk-lore. The Journal of American Folklore. 14 (52), 30-38 (1901).
  6. Elmer, J., Palmer, A. F., Cabrales, P. Oxygen delivery during extreme anemia with ultra-pure earthworm hemoglobin. Life Sciences. 91 (17-18), 852-859 (2012).
  7. Eyambe, G. S., Goven, A. J., Fitzpatrick, L. C., Venables, B. J., Cooper, E. L. A non-invasive technique for sequential collection of earthworm (Lumbricus terrestris) leukocytes during subchronic immunotoxicity studies. Laboratory Animals. 25 (1), 61-67 (1991).
  8. Basley, K., Goulson, D. Effects of chronic exposure to clothianidin on the earthworm Lumbricus terrestris. PeerJ. 5, 3177 (2017).
  9. Mvumi, B. M., Gwenzi, W., Mhandu, M. G. Ecotoxicological effects of citrus processing waste on earthworms. Lumbricus terrestris L. Industrial Crops and Products. 110, 123-129 (2017).
  10. Furst, A. My saga with earthworms. Food and Chemical Toxicology. 40 (6), 789-791 (2002).
  11. Cooper, E. L., Hrzenjak, T. M., Grdisa, M. Alternative sources of fibrinolytic, anticoagulative, antimicrobial and anticancer molecules. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 17 (3), 237-244 (2004).
  12. Cooper, E. L., Hirabayashi, K., Balamurugan, M. Dilong: food for thought and medicine. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 2 (4), 242-248 (2012).
  13. Nagasawa, H., et al. Inhibition by lombricine from earthworm (Lumbricus terrestris) of the growth of spontaneous mammary tumours in SHN mice. Anticancer Research. 11 (3), 1061-1064 (1991).
  14. Shannon, K. M., Gage, G. J., Jankovic, A., Wilson, W. J., Marzullo, T. C. Portable conduction velocity experiments using earthworms for the college and high school neuroscience teaching laboratory. Advances in Physiology Education. 38 (1), 62-70 (2014).
  15. National Research Council. . A framework for K-12 science education: Practices, crosscutting concepts, and core ideas. , (2012).
  16. Ramsay, J. The Osmotic Relations of the Earthworm. Journal of Experimental Biology. 26 (1), 46-56 (1949).
  17. Mulloney, B. Structure of the Giant Fibers of Earthworms. Science. 168 (3934), 994-996 (1970).
  18. Kim, Y., Nabili, M., Acharya, P., Lopez, A., Myers, M. R. Microvessel rupture induced by high-intensity therapeutic ultrasound - a study of parameter sensitivity in a simple in vivo model. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5 (1), 5 (2017).
  19. Wahab, R. A., et al. Mechanical bioeffects of pulsed high intensity focused ultrasound on a simple neural model. Medical Physics. 39 (1), 4274-4283 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Lumbricus Terrestris

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved