Дождевой червь, lumbricus terrestris: новая модель микроинъекции сосудистой сети in vivo для беспозвоночных

Дождевые черви — это новая настольная модель беспозвоночных in vivo для исследования сосудистой системы. Мы представляем методики и оборудование, которые позволяют проводить эффективные хирургические операции и микроинъекции в сосудистую сеть дождевого червя. Описаны хирургические протоколы, техники микроинъекций и порядок производства микропипеток по индивидуальному заказу.

Хотя позвоночные животные незаменимы в биомедицинских исследованиях, исследования часто ограничены такими факторами, как стоимость, длительная внутренняя проверка и этические соображения. Мы представляем дождевого червя как альтернативное, недорогое беспозвоночное, применимое для некоторых предварительных исследований сосудистой системы. Благодаря хирургической доступности дорсальных сосудов дождевого червя, вентральных сосудов и пяти пар псевдосердец, дождевые черви легкодоступны, предлагают недорогое обслуживание и требуют введения только небольших доз данного соединения. Модель дождевого червя обеспечивает простую замкнутую кровеносную систему сосудов со структурой гемоглобина, схожей с кровью человека. Предоставляется протокол обезболивания дождевых червей и выполнения хирургических разрезов для обнажения соответствующих кровеносных сосудов. Микропипетки для комбинированного введения формируются путем нагрева и вытягивания стекла с помощью съемника пипетки и использования системы снятия фаски для создания тонкого игольчатого наконечника микронного масштаба. Затем наконечники используются с микропозиционером и микроинъектором для многократного введения произвольных соединений в сосудистую систему дождевого червя, при наличии больших размеров образцов и небольших объемов соединений. Подробно о тонкостях процедуры инъекций вы узнаете. Размер небольшого сосуда дождевого червя является сложной задачей, особенно в случае брюшного сосуда; Тем не менее, владение представленными методами обеспечивает высокую повторяемость в качестве недорогого решения, что делает исследования с очень большим размером выборки практичными.

Дождевой червь использовался в качестве важного биоиндикатора и биотеста для предыдущих научных применений 1,2,3,4,5,6; Это идеальный организм для оценки биологических рисков, связанных с опасными и токсичными отходами в наземных средах для исследований in situ и биоаккумуляции, таких как биоциды (инсектициды) в почве и неблагоприятных экотоксикологических эффектов 7,8,9,10. Кроме того, благодаря биоразведке, дождевой червь является альтернативным источником фибринолитических, антикоагулятивных, противомикробных и противораковых молекул^11,12; до такой степени, что в 1991 году команда извлекла и очистила лумбрицин из кожи дождевых червей и поместила его на опухоли молочных желез мышей SHN, что привело к ингибированию роста опухоли¹³. Дождевой червь также является педагогически полезной моделью животного происхождения, поскольку его можно использовать для ознакомления студентов с хирургическим вмешательством и пониманием анатомии образца; От изучения кровообращения к электрофизиологии ^14,15.

В наших собственных исследованиях мы изучили реакцию сосудов живых дождевых червей на ультразвук высокой^{интенсивности18}. Мы обнаружили, что разрыв сосуда у червя происходил в условиях, аналогичных тем, которые мы связывали с повреждением микрососудов человека. Наша текущая работа заключается во введении микропузырьков в сосудистую сеть дождевого червя. Микропузырьки состоят из тяжелого газа, заключенного в липидную, альбуминовую или полимерную оболочку, эти агенты могут использоваться в качестве контрастных веществ, а также в качестве средств адресной доставки лекарств.

Этот новый протокол имеет отношение к любому исследованию, в котором будет полезна внутривенная (IV) инъекция соединения, которое могло бы использовать естественные биоиндикаторы дождевого червя. Этот подход основан на внутривенной микроинъекции в одну из нескольких возможных точек входа, включая любое из пяти парных псевдосердец дождевого червя, дорсальный сосуд и вентральный сосуд. Процедура включает в себя сложный хирургический разрез для обнажения сосудов, за которым следует инъекция, контролируемая микропозиционером. Это достигается с помощью специализированных микропипеток, разработанных специально для микроинъекций сосудов дождевых червей. Эти микропипетки позволяют с высокой точностью нацеливаться на сосуды размером до 90 мкм в диаметре.

Этот протокол разработан для улучшения более ранних методов микропипетирования, включая исследование 1948 года по извлечению крови и мочи дождевых червей¹⁶. Как видно на рисунке S1, настройка для этого извлечения может быть сложной и, как утверждает автор, может занять до одного часа или дольше. Подобный метод был разработан в 1970 году, но у автора было несколько сломанных наконечников во время впрыскивания жидкости в гигантские волокна дождевого червя¹⁷. В описанном ниже способе экстракция крови занимает от нескольких секунд до нескольких минут и имеет отношение как к инъекции соединений, так и к экстракции жидкостей дождевых червей. В данном конкретном случае мы вводили контрастные вещества, микропузырьки.

1. Подготовка микропипетки: вытягивающее стекло и скошенный наконечник

1. Вытягивание микропипеток
   1. Включите съемник микропипеток и выберите программу для ввода конкретных параметров для микроинъекции дождевого червя.
   2. Установите параметры на Давление = 500, Тяга = 75, Время = 250, Тепло = 336 и Скорость = 70. Результаты могут варьироваться от пуллера к пуллеру; Поэтому экспериментируйте с параметрами, чтобы добиться желаемого наконечника (размер, острота, форма и т.д.).
   3. Обязательно проведите тест RAMP, чтобы определить теплоту для микропипеток, прежде чем вытаскивать их, так как невыполнение этого требования может привести к выгоранию нити корыта или поломке стекла.
   4. Если необходимо изменить давление воздуха, нажмите кнопку очистки, выберите «нет» (0), когда будет предложено сбросить все значения, и выберите «Изменить давление» (2). Этот процесс может варьироваться от съемщика к пуллеру; Поэтому обратитесь к руководству по прибору, чтобы изменить настройки давления.
   5. Откройте крышку съемника микропипетки и загрузите микропипетку в съемник. В качестве стекла для микропипеток использовалось боросиликатное стекло с филаментной пипеткой: 10 см в длину, внешний диаметр: 1,5 мм и внутренний диаметр: 0,86 мм.
   6. Вставьте пипетку в V-образный паз справа вдоль щели пипетки до тех пор, пока конец пипетки не совпадет с торцом держателя пипетки. Чтобы пипетка могла перемещаться по нити накала на противоположную сторону, протолкните пипетку как можно дальше, следя за тем, чтобы она оставалась на щели пипетки.
   7. Чтобы зафиксировать пипетку, затяните ручку с правой стороны и сдвиньте заблокированную систему вместе с пипеткой, пока она не достигнет другой стороны съемника через нить. Наконец, зафиксируйте левую сторону пипетки на съемнике. Пипетка должна находиться в середине нити; Инструкции о том, как правильно выровнять пипетку, см. в руководстве.
   8. После того, как пипетка будет загружена, закройте съемник, нажмите кнопку вытягивания и подождите, пока пипетка будет извлечена, прежде чем извлекать две получившиеся пипетки.
   9. Растяните ручки, чтобы извлечь пипетки, и будьте осторожны, чтобы не зажать пипетки во время извлечения из щели.
   10. Поместите вынутые микропипетки на держатель для микропипеток или на какую-либо опору, чтобы удерживать микропипетку на месте и обеспечивать легкое вращение без поломки вытянутых микропипеток. Мы разработали собственный держатель для микропипеток, который можно создать в механической мастерской или даже напечатать на 3D-принтере.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
   11. Поместите держатель микропипетки под микроскоп и используйте программу камеры или аналогичное программное обеспечение, чтобы сделать снимок вытянутых микропипеток и записать диаметр наконечника с использованием 10-кратного увеличения ~1000 мм и ~50 мм от наконечника.
   12. Перед съемкой убедитесь, что настройки камеры соответствуют настройкам микроскопа (10x), чтобы обеспечить точность измерений, особенно при измерениях после получения изображения. Настройка 10x находится на горизонтальной ленте панели инструментов, расположенной в верхней части экрана.
   13. Чтобы просмотреть и сделать снимок микропипетки, выберите камеру в программном обеспечении камеры, расположенном в верхнем левом углу, и нажмите кнопку Snap после фокусировки на наконечнике, чтобы получить точные показания. Кнопка «Привязать» расположена на горизонтальной панели инструментов в левой части страницы под вкладкой камеры.
   14. Проведите измерения вынутых микропипеток, чтобы определить, был ли достигнут желаемый размер и консистенция наконечника. Достаточно сделать до 5 пипеток, чтобы определить, постоянно ли вытягиватель и его параметры выдают желаемый размер. Если желаемый размер наконечника не был достигнут или если размер пипетки продолжает изменяться, исследователю может потребоваться поэкспериментировать с различными настройками до тех пор, пока не будет достигнут желаемый размер наконечника, или может потребоваться фиксация расположения нити накала и пипетки, для чего может потребоваться ссылка на руководство по съемнику пипетки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
2. Настройка для снятия фаски с микропипетки и использование измерителя импеданса электродов
   1. Чтобы снять фаску с вытянутых микропипеток, используйте устройство для снятия фаски с микропипетками с измерителем импеданса электрода и 40-кратным стереомикроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другие фаски; Даже собственные станки для снятия фаски успешны, кроме того, с помощью различных микроскопов можно получить различные конфигурации для изучения процесса снятия фаски, включая установку камеры на микроскоп.
   2. Соберите пьедестал/шлифовальную пластину с тонкой пластиной между двумя черными держателями.
   3. Поместите нижнюю пластину магнитами в сторону от тарелки.
   4. Завинтите три части вместе: (1) верхнее стопорное кольцо, (2) тонкую пластину для шлифовки и (3) нижнее стопорное кольцо (магнитное). Определить абразивную поверхность шлифовальной пластины; Для тонкой пластины она имеет фиолетовый цвет и должна быть обращена вверх так, чтобы стекло соприкасалось с кварцевой оптической пластиной.
   5. Нанесите пять капель масла на пьедестале для снятия фаски или столько, сколько необходимо, на кварцевую оптическую плоскость инструмента для снятия фаски и положите сверху собранную пластину. Этого масла может хватить на весь день, но если пластина дергается или не вращается, когда должна, то может потребоваться повторная смазка кварцевой оптической плоскости.
   6. Поверните пластину вручную несколько раз, чтобы распределить масло, после чего инструмент можно включать.
   7. Чтобы настроить измеритель импеданса, добавьте физиологический раствор (0,9% NaCl) на фитиль, который является эталонным проводом, и поместите фитиль на пластину для снятия фаски. Пропитайте ленту так, чтобы получилась схема с микропипеткой, и покройте пластину тонким слоем солевого раствора.
   8. Прикрепите ведущий сегмент к концу провода, который прикреплен к измерителю импенденсии.
   9. Включите переключатель на измерителе импеданса и оставьте в режиме ожидания до тех пор, пока не начнется снятие фаски. Поскольку мы создаем большое отверстие, установите измеритель импеданса электродов на x0,1, когда будете готовы к скосу.
3. Загрузка микропипетки и снятие фаски
   1. Наденьте микропипетку на зажим для пипетки, расположенный на манипуляторе, и затяните ручку, чтобы удерживать ее на месте во время снятия фаски.
   2. Через задний конец микропипетки заполните всю пипетку физиологическим раствором и вставьте проводник в микропипетку, убедившись, что в микропипетке нет пузырьков воздуха. Было замечено, что наличие пузырьков воздуха в микропипетке вызывает вариативность в измерениях.
   3. Включите измеритель импенденса, переключившись из режима "stand-by" на "x0.1". Сопротивление первоначально должно составлять 100 МОм, и когда наконечник микропипетки соприкасается с физиологическим раствором, он должен отображать другие показания.
   4. Чтобы снять фаску с правильным размером отверстия наконечника, перед опусканием микропипетки отрегулируйте угол наклона манипулятора до 35° для достижения равномерного снятия фаски. Угол 30° также достаточен, но между ними 35° имеет меньшее стандартное отклонение, что обеспечивает более равномерное снятие фаски и меньшее ломание наконечника.
   5. С помощью манипулятора расположите наконечник микропипетки примерно на две трети от центра вращения шлифовальной пластины.
   6. С помощью ручки грубой регулировки опустите микропипетку близко к пластине так, чтобы наконечник микропипетки приблизился к физраствору. Если камеры нет, важно посмотреть в микроскоп, чтобы увидеть скос наконечника.
   7. После того, как наконечник микропипетки соприкоснется с физиологическим раствором, показания импедансметра должны снизиться со 100 МОм до значения в диапазоне от 80 до 20 МОм. Это значение будет варьироваться из-за открывания вытянутого стекла.
   8. На этом этапе переключитесь с ручки грубой регулировки на ручку точной регулировки, чтобы опускать пипетку медленнее и не сломать наконечник на пластине. На этом этапе снятия фаски важно одновременно контролировать импедансметр и наконечник.
   9. Во время снятия фаски следите за изменением размера кончика и используйте освещение, чтобы создать хорошую точку обзора во время снятия фаски.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При снятии фаски наконечник станет чрезвычайно блестящим, а отверстие кончика станет больше. На этом этапе крайне важно использовать ручку точной регулировки на манипуляторе, чтобы опустить или поднять микропипетку. После того, как микропипетка будет снята с планшета, если опустить ее обратно на пластину, наконечник может сломаться.
   10. Продолжайте медленно опускать наконечник, пока он не достигнет пластины для снятия фаски, и медленно снимайте фаску, пока не будет достигнуто сопротивление примерно 20 МОм. Овладение этим процессом будет сильной кривой обучения, и потребуется практика, чтобы постоянно снимать фаску на кончике.
   11. При достижении сопротивления 20 МОм поднимите микропипетку из фаски.
   12. Снимите провод с микропипетки и выгрузите микропипетку из фаски. Если оставить микропипетку на фаске, она может либо сломаться, либо создать большее отверстие на конце; Поэтому во время снятия фаски важно следить за измерителем и наконечником.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
   13. Поместите скошенную микропипетку на держатель микропипетки и используйте объектив 10x в программном обеспечении микроскопа для измерения размера отверстия наконечника. Размер выборки в 10 наконечников достаточен для проверки согласованности всех скошенных наконечников.
   14. Перед съемкой убедитесь, что настройка микроскопа (10x) соответствует настройкам камеры. Выбросы могут быть отброшены после измерений раскрытия наконечника.
   15. Чтобы выключить фаску, поверните переключатель в положение «Выкл» как на двигателе приводного ремня, так и на измерителе импеданса.
   16. Открутите пьедестал/шлифовальную пластину, чтобы снять верхнее стопорное кольцо. Не поднимайте пьедестал/шлифовальную пластину, когда они прикреплены друг к другу, так как она может сломаться из-за создаваемого вакуума.
   17. После поднятия верхнего стопорного кольца насадки с помощью винтов сдвиньте тонкую шлифовальную пластину и поднимите последнюю магнитную насадку, чтобы снять ее. Удалите излишки масла с кварцевой оптической пленки с помощью лабораторных салфеток.
   18. Очистите все три компонента деионизированной (DI) водой и промокните насухо, чтобы избежать образования кристаллов соли. После длительного использования вращающаяся магнитная база может испытывать рывки. В этом случае распылите небольшое количество воды DI на приводной ремень, чтобы удалить кристаллизованную соль.
   19. Сотрите излишки масла с обратной стороны шлифовальной пластины, а также с кварцевой оптической пластины.
   20. Используйте деионизионную воду на платформе для снятия фаски, чтобы удалить излишки физиологического раствора, которые могут быть на инструменте, чтобы избежать кристаллизации.
   21. Используйте деионизионную воду для мытья скошенных кончиков. Если наконечники не вымыть, они кристаллизуются, но позже их можно легко смыть деионизированной водой.
   22. Положите глину внутрь пластины и используйте покровное стекло, чтобы предотвратить загрязнение микропипеток.
   23. Сделайте углубления в глине для удержания микропипеток. Когда скошенные кончики готовы к использованию, они готовы к заполнению представляющим интерес соединению и введению в сосудистую сеть дождевого червя. Для этого примера протокола в качестве исследуемого соединения использовались контрастные вещества, микропузырьки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.

2. Калибровка микроинъекторов со скошенными наконечниками

1. Подготовьте тарелку с гидрофобным покрытием.
   1. Накануне покройте две пластины гидрофобным покрытием на поверхности для отверждения в течение ночи. Это химическое вещество должно быть получено из материалов, купленных в магазине, или из материалов собственной лаборатории, если таковые имеются, и требуется не менее 12 часов для отверждения.
   2. Нанесение покрытия представляет собой быстрый двухэтапный процесс. Распылите базовое покрытие, а затем распылите верхнее покрытие.
   3. В капюшоне или на открытом пространстве распылите Base Coat на тарелку после энергичного встряхивания банки с Base Coat, как только шарики для смешивания будут дребезжать в течение одной минуты.
   4. Распылите на пластину базовое покрытие примерно в 6-12 дюймах от поверхности, выполняя проходы во время нанесения покрытия на пластину. Проходы состоят из световых проходов справа налево и далее вверх и вниз. Продолжайте встряхивать, пока пластина покрыта, и следите за тем, чтобы не распылять слишком много, так как это снизит производительность продукта.
   5. Подождите 1-2 минуты, прежде чем наносить еще одно покрытие базовым покрытием. Хотя это и не обязательно, при желании можно нанести дополнительное покрытие.
   6. Подождите 30 минут, пока базовое покрытие высохнет.
   7. Повторите шаги 2.1.3 - 2.1.5 для верхнего слоя.
   8. После того, как пластина затвердела в течение ночи или не менее 12 часов, пластина готова к заполнению минеральным маслом. Заполните тарелку минеральным маслом примерно наполовину.
   9. Поместите пластину с минеральным маслом на ступень микроинжектора.
2. Наденьте скошенные наконечники на микроинъектор.
   1. Подключите микроинъектор непосредственно к лабораторной струе сжатого воздуха. Для этой системы можно использовать баллон со сжатым азотом и регулятор давления, но обратите внимание, что для других систем микроинжекторов может потребоваться другой интерфейс.
   2. Откройте сжатый воздух, откройте регулятор линии низкого давления до 70 фунтов на квадратный дюйм и включите микроинжектор. Не превышайте 80 фунтов на квадратный дюйм, так как система не может выдерживать давление более 80 фунтов на квадратный дюйм.
   3. Наполните наконечники водой с помощью шприца объемом 1 мл с иглой Metal Hub. Если внутренний диаметр пипетки отличается, то для ее размещения потребуется металлическая игла другого калибра.
   4. После заполнения водой загрузите микропипетку на игольчатый держатель джойстикового микроманипулятора. Могут использоваться различные микроинъекторы и микроманипуляторы.
3. Создавайте пузырьки воды для калибровки объема дозирования с помощью скошенной микропипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением любого соединения в сосудистую сеть дождевого червя, микроинъектор должен быть откалиброван для определения правильного объема введения.
   1. Установите параметры на микроинжекторе для давления на уровне 4 PSI и времени на 0,5 секунды. Превышение этих параметров приведет к искажению размеров судна, что неблагоприятно, если только целью исследователя не является изучение расширения судна.
   2. Опустите наконечник пипетки так, чтобы он приблизился к нижней части пластины, но будьте осторожны, чтобы не сломать наконечник в нижней части пластины. Чем ниже кончик в минеральном масле, тем более вязким он будет на кончике, что может привести к поломке.
   3. Начните с края пластины, чтобы максимально эффективно использовать пластину во время калибровки.
   4. Как только это будет установлено, нажмите на педаль, чтобы выпустить пузырь воды в масле.
   5. Пузырь может остаться прилипшим к кончику. Чтобы исправить это, быстро оттяните пластину в противоположном направлении от пузырька, чтобы отделить его от наконечника пипетки.
   6. С помощью программного обеспечения камеры измерьте размер пузырька и рассчитайте объем. Если программное обеспечение камеры недоступно, можно использовать альтернативное программное обеспечение.
   7. Создайте 10 пузырьков и измерьте средний диаметр пузырька, чтобы определить правильный объем, который микропипетка будет вводить в сосудистую сеть дождевого червя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если исследователь заинтересован в дозировании различных объемов, можно манипулировать параметрами давления и времени; Повторите шаги 2.3.1 - 2.3.7.

3. Подготовка к хирургическому вмешательству дождевого червя для выявления специфической сосудистой сети дождевого червя, представляющей интерес

1. Подготовка и измерения дождевых червей
   1. Приготовьте 10% раствор этанола, который обезболит дождевых червей перед операцией.
   2. Держите дождевых червей в стакане объемом 100 мл с почвой между экспериментами.
   3. Держите в стакане только 5-10 дождевых червей за раз, чтобы предотвратить высыхание дождевых червей из-за резких переходов от холодильника к столешнице, от 4 °C до 25 °C.
   4. Поместите дождевых червей в 10% этанол на 30 минут. Если дождевой червь все еще движется через 30 минут, оставьте его в растворе этанола еще на 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда дождевой червь требует больше времени из-за своего размера; Таким образом, время в этаноле может потребоваться регулировать в соответствии с размером дождевых червей, но не более часа. Свыше часа навредит дождевой червь.
   5. Промойте дождевого червя под водой крана, чтобы удалить выделяемую им слизь и этанол.
   6. Положите дождевого червя на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю воду.
   7. После того, как дождевой червь будет обезболиван, запишите вес каждого дождевого червя (г), ширину (мм), длину (мм) и ширину сосуда (мкм). Измерьте вес и габариты дождевого червя до того, как будут сделаны какие-либо надрезы и не растягивая дождевого червя.
   8. После того, как сосуд будет обработан хирургическим путем под микроскопом, используйте программное обеспечение камеры для измерения ширины сосуда. Если программное обеспечение камеры недоступно, будет достаточно микролинейки из нержавеющей стали, хотя она не так точна, как цифровое программное измерение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от интересующего сосуда, перейдите к шагу 3.2 (вентральный сосуд), 3.3 (дорсальный сосуд), 3.4 (вид сердца сверху) или 3.5 (вид сердца сбоку).
2. Обнажение сосудистой сети дождевого червя, вентрального сосуда (способ 1)
   1. Во время хирургической процедуры используйте резиновую прокладку, чтобы прижать дождевого червя, тем самым обнажив сосуд, представляющий интерес для исследователя. Темная часть кожи должна быть обращена вниз.
   2. Чтобы хирургическим путем вскрыть дождевого червя, поместите его на его спинную сторону, более темную часть дождевого червя, где на коже лезвием делается небольшой боковой надрез размером около 1 мм. Этот небольшой разрез позволяет хирургическим ножницам войти внутрь для создания длинного разреза.
   3. Приколите кожу дождевого червя на расстоянии 33 мм друг от друга, сделав отверстие на 27 мм, чтобы обнажить сосуд, используя только четыре штифта для правильного обнажения сосуда. Булавки могут быть добавлены или перемещены, как только дождевой червь будет прижат, чтобы помочь манипулировать кожей дождевого червя.
   4. Хирургическими ножницами сделайте разрез так, чтобы он дотянулся до другого штифта сбоку его тела. Проталкиваясь вверх к коже, он предотвращает любое повреждение внутренней части дождевого червя, такое как разрезание сосудистой сети или кишечника.
   5. После того, как разрез был сделан, приколите или повторно приколите в том месте, где был сделан первый разрез, а затем в конце разреза.
   6. Используя оба хирургических инструмента (хирургические захваты), сдвиньте кожу, чтобы обнажить внутреннюю часть дождевого червя.
   7. Прикалывайте кожу внизу по мере того, как кожа перемещается, и, продвигаясь вверх по дождевым червям, продолжайте осторожно отделять кожу от органов. Оказавшись наверху, поставьте последнюю булавку.
   8. Если сосуд не обнажен, потяните за противоположные стороны кожи дождевого червя, чтобы отделить эластичную ткань дождевого червя, чтобы обнажить вентральный сосуд и еще больше отделить кожу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рывок удалит часть ткани, которая удерживает органы внутри дождевого червя. Будьте осторожны с этим шагом, так как он может непреднамеренно разорвать сосуды дождевого червя. Теперь вентральный сосуд должен быть обнажен, и нервный канатик может функционировать как маркер сосуда, потому что нервный канатик проходит вдоль кожи прямо рядом с вентральным сосудом и параллельно ему. Если вентральный сосуд находится близко к кишечнику, потягивание кожи может еще больше обнажить сосуд. Если нет, оттолкните кишку в сторону, но это может привести к беспорядку в рабочей зоне.
3. Обнажение сосудистой сети дождевого червя, дорсального сосуда (способ 2)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги по обнажению дорсального сосуда аналогичны обнажению вентрального сосуда.
   1. Повторите шаги 3.2.1 - 3.2.3 шага 3.2. Для выполнения этих действий темная часть кожи должна быть обращена вверх.
   2. Хирургическими ножницами разрежьте по направлению к середине дождевого червя на противоположную сторону.
   3. От середины дождевого червя сделайте надрез по направлению к передней части дождевого червя, голове. Надавливание вверх к коже предотвращает любое повреждение внутренней части дождевого червя, такое как разрезание сосуда или кишечника.
   4. После того, как диагональный разрез будет сделан, приколите или повторно приколите место первого разреза, а затем в конце сделанного разреза.
   5. Повторите шаги 3.2.6 - 3.2.9 в шаге 3.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь спинной сосуд должен быть открыт.
4. Обнажение сосудистой сети дождевого червя, вид сверху на сердца (способ 3)
   1. Используйте резиновую подушечку во время хирургической процедуры, чтобы прижать дождевого червя, тем самым обнажив сосуд, представляющий интерес для исследователя.
   2. Чтобы хирургическим путем обнажить дождевого червя, поместите его на его брюшную сторону, светлую часть дождевого червя. Темная часть кожи должна быть обращена вверх.
   3. Используйте четыре булавки, чтобы удерживать кожу дождевого червя и создать окно, чтобы обнажить сердца, представляющие интерес. Дополнительная булавка, всего пять, может быть использована для удержания дождевого червя возле кончика его головы, переднего конца.
   4. Начните прикалывать дождевого червя снизу вверх, начиная с правой стороны, а затем переходя к левой. Приколите дождевого червя, поместив две булавки сверху возле кончика головы, переднего конца и две возле клителлума.
   5. С помощью лезвия сделайте небольшой надрез примерно на 1 мм сбоку дождевого червя.
   6. С помощью хирургических ножниц разрежьте дождевого червя к противоположной стороне.
   7. От середины дождевого червя сделайте надрез по направлению к передней части дождевого червя, пока не дойдете до устья дождевого червя, переднего конца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы ножницы были приподняты к коже, чтобы избежать разрезания сосудистой сети; Лезвие ножниц видно по мере того, как вы проходите через кожу. Убедитесь, что разрез сделан на переднем конце дождевого червя, так как это обеспечит лучшую видимость сердец.
   8. После прикалывания снова приколите дождевого червя, если кожа скручивается в дождевого червя.
   9. Сделайте рывок, чтобы правильно отделить ткани дождевого червя, чтобы правильно обнажить сердца.
   10. Если сердца не обнажены, перемещайте белые семенные пузырьки, так как сердца иногда прячутся под этими пузырьками.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие на сердце может варьироваться от дождевого червя к дождевым червям, все 10 сердец могут быть видны или только половина и так далее. На этом этапе исследователь должен определить, следует ли перемещать органы и ткани, чтобы найти сердца дождевого червя.
5. Обнажение сосудистой сети дождевого червя, вид сердца сбоку (способ 4)
   1. Используйте резиновую подушечку во время хирургической процедуры, чтобы прижать дождевого червя, тем самым обнажив сосуд, представляющий интерес для исследователя.
   2. Чтобы хирургическим путем обнажить дождевого червя, положите его на бок. Так как дождевой червь находится на боку, то должна быть видна как светлая, так и темная сторона дождевого червя.
   3. Повторите шаги 3.4.3 - 3.4.9 из Шага 3.4.
   4. Если сердца не обнажены, перемещайте белые семенные пузырьки, так как сердца иногда прячутся под этими пузырьками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие на сердце может варьироваться от дождевого червя к дождевым червям, все пять сердец могут быть видны или меньше. На этом этапе исследователь должен определить, следует ли перемещать органы и ткани, чтобы найти сердца дождевого червя.

4. Введение соединения в сосудистую сеть дождевых червей

1. Подготовка дождевого червя к комплексному применению
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих конкретных этапов мы вводили контрастные вещества, микропузырьки, в сосудистую сеть дождевого червя в качестве интересующего соединения.
   1. Перед микроинъекцией поместите дождевого червя на ступень микроинъекции и с помощью лабораторной салфетки удалите любые жидкости вокруг интересующего сосуда, тем самым обнажив сосудистую сеть для инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не надавливайте сильно, так как это вызовет кровотечение из сосуда.
   2. Выровняйте интересующую сосудистую сеть по отношению к микропипетке, так как важно, чтобы вентральный сосуд был выровнен для инъекции. Если сердечки представляют интерес, они должны быть перпендикулярны микропипетке.
   3. Сфокусируйте микроскоп на интересующей сосудистой сети и начните опускать микропипетку к сосудистой сети. Перед перемещением любого из манипуляторов джойстика убедитесь, что все они установлены на 0 мм, чтобы обеспечить наилучшую мобильность.
   4. Когда кончик микропипетки соприкасается с сосудом дождевого червя, убедитесь, что угол между сосудом и микропипеткой составляет менее 15°.
   5. Как только микропипетка начнет оказывать давление на сосуд, кровь будет отходить от кончика из-за давления на сосудистую систему. Это хороший показатель правильной установки инъекции.
   6. Чтобы обеспечить успешную инъекцию, с помощью джойстика переместите микропипетку вперед, чтобы обеспечить контакт с сосудистой сетью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не проколоть сосуд. Обратите внимание, что наконечник должен перемещать сосудистую сеть для дорсального и вентрального сосудов в направлении движения микропипетки, а затем грубый циферблат должен использоваться для перемещения наконечника микропипетки вперед, чтобы обеспечить полное проникновение внутрь сосуда. Если планшет является подвижным, его можно использовать для перемещения и прокалывания сосуда в микропипетке вместо использования микроконтроллеров или всех сразу. Сосуд будет проникнут не сразу, но отдача сосуда является показателем правильного проникновения микропипетки. После того, как наконечник проникнет в сосуд, сосуд должен быть прямым и выровнен с микропипеткой. Если это не так, то медленно втяните микропипетку с помощью тонкого регулятора.
   7. Нажмите на педаль, чтобы ввести сосудистую сеть дождевого червя. Разжижение крови является еще одним показателем правильного проникновения после нажатия на педаль.
   8. Медленно втяните микропипетку и оттяните микропипетку в сторону.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, поломка наконечника, когда микропипетка все еще находится в сосуде, является эффективным методом предотвращения кровопотери.

Следующие репрезентативные результаты основаны на наборе конкретных параметров, которые включают в себя настройки, используемые для вытягивания стеклянной пипетки, размер отверстия пипетки, сформированный из заданного угла скоса, а также давление и время микроинъе...

В то время как дождевой червь содержит 10% этанола, особенно если дождевой червь старшего возраста, могут наблюдаться нежелательные эффекты при воздействии более 30 минут; Кишечник начнет разрушаться, и когда дождевого червя хирургическим путем вскроют, его внутренний ...

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была профинансирована стипендией NSF-FDA Scholar-in-Residence Fellowship (NSF-FDA SIR, #1641221), грантом главного научного сотрудника Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA OCS), Национальным научным фондом Integrative Graduate Education and Research Traineeship (NSF IGERT, #1144646) и поддержана Управлением научных и инженерных лабораторий (OSEL) Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA).