Standardize Kolon Sıçanlarda Stent Peritonitini Yükseltir - Septik Akut Böbrek Hasarını İndüklemek İçin Basit, Uygulanabilir Bir Hayvan Modeli

Akut böbrek hasarı (ABH), kritik hastalarda ciddi bir komplikasyondur ve artmış mortalite ile ilişkilidir. Burada, septik ABH patogenezinin anlaşılmasına katkıda bulunabilecek inflamatuar koşullar altında ABH'yi taklit etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir in vivo model sunuyoruz.

Septik hastalarda ABH, patofizyolojisinin anlaşılmasını iyileştirmeye yönelik büyük çabalara rağmen artmış mortalite ve kötü sonuç ile ilişkilidir. Burada, ABH'yi indüklemek için standartlaştırılmış bir septik odağı ve insan sepsisinde karşılaştırılabilir gelişmiş bir hemodinamik izleme ve tedavi sağlamak için yoğun bakım (YBÜ) kurulumunu birleştiren bir in vivo model sunulmaktadır. Sepsis, standardize kolon ascendens stent peritoniti (sCASP) ile indüklenir. ABH, kan ve idrar örneklerinin ölçümü ile fonksiyonel olarak ve histopatolojik skorların değerlendirilmesi ile histolojik olarak incelenir. Ayrıca, ileri hemodinamik izleme ve tekrarlayan kan gazı örneklemesi olasılığı, indüklenen sepsisin şiddetinin farklı bir analizini mümkün kılar.

sCASP yöntemi, septik ABH'yi indüklemek için standartlaştırılmış, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Yoğun bakım kurulumu, sürekli hemodinamik ve gaz değişimi monitörizasyonu, düşük mortalite oranı ve böbrek fonksiyon ve bozukluklarının ayrıntılı analiz imkanı bu kurulumun avantajlarıdır. Bu nedenle, tarif edilen yöntem, septik ABH'nin deneysel araştırmaları için yeni bir standart olarak hizmet edebilir.

Sepsis, kardiyak olmayan yoğun bakım ünitelerinde (YBÜ) %30-50'≈ ölüm oranları ile hala önde gelen ölüm nedeni olmaya devam ^{etmektedir1,2,3}. Şiddetli sepsis ve septik şokun ayırt edici özelliği, kalp ve solunum yetmezliği^gibi uzak organ disfonksiyonu ile ilişkili olduğunda mortalite oranının daha da artmasına neden olan akut böbrek hasarıdır ^4,5,6. Yoğun bakım hastalarında ABH'nin genel insidansı %20 ila 50 arasında ^{değişmektedir7}. ABH'nin sepsiste sonuç ve mortalite açısından önemli rolüne rağmen, altta yatan patomekanizma hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Genel olarak 3 ana bileşen vardır: inflamasyon, toksik yaralanma ve ABH gelişimine katkıda bulunan hemodinamik değişiklikler⁷. Hemodinamik değişiklikler, azalmış renal kan akımı (RBF) ve global veya bölgesel renal iskemiyi kapsar. Burada, sepsisin sistemik hipotansiyon ve/veya endotel bariyeri bozulmasına bağlı olarak böbrek mikrosirkülasyonunda bozulmaya da neden olabileceği göz önünde bulundurulmalıdır⁸. Bu nedenle, septik ABH çalışması her zaman hemodinamik monitörizasyonu içermelidir. ABH ile ilgili son zamanlarda yapılan in vivo çalışmalarda çoğunlukla renal iskemi-reperfüzyon hasarı veya bilateral nefrektomi gibi hayvan modelleri kullanılmıştır. Bu çalışmalar genellikle hemodinamik monitörizasyon ve yoğun bakım eksikliği göstermiştir.

Septik ABH'nin potansiyel yeni patomekanizmalarının ve tedavilerinin araştırılması, tanımlanmış bir septik odak, yoğun bakım kurulumu, öngörülebilir bir sonuç ve organ hasarı olan bir in vivo model gerektirir 9,10,11,12. Burada, septik ABH için daha önce bahsedilen gereksinimleri karşılayan yenilikçi bir kemirgen modelini açıklıyoruz. Septik ABH, standardize kolon ascendens stent peritoniti (sCASP) ile indüklenir. Kullanılan sCASP modeli, bakteri istilasına ve çoklu organ yetmezliğine yol açan bağırsak dışkı sızıntısı ile abdominal sepsise neden olur¹³. CASP sonrası patofizyolojik değişikliklerin insan sepsisindekilere benzer olduğu gösterilmiştir ve bu nedenle CASP sepsis araştırmalarında klinik olarak anlamlı bir modeli temsil etmektedir^11,14.

Ayrıca, deneysel protokolde ileri hemodinamik monitörizasyon ve YBÜ tedavisini içeren bir yoğun bakım (YBÜ) düzeni oluşturulmuştur. Yoğun bakım kurulumu, sıvı resüsitasyonu, intravenöz analjezi uygulaması ve tekrarlayan kan gazı analizine olanak tanır. Böbrek fonksiyonu, kreatinin gibi standart değerlerin ölçümü ve inülin ve p-aminohippurik asit (PAH) klerensi ile değerlendirilir. Ek bilgiler, deneyin sonunda toplanan doku ve organların patohistolojik skorları ile sağlanır. Septik ABH'yi indüklemek için sCASP modeli zaten değerlendirilmiş ve renal patolojide yeni bilgiler ortaya koymuştur¹⁵. Aşağıda sunulan bu protokolün daha fazla uygulanması, septik ABH anlayışının iyileştirilmesine yardımcı olabilir.

Tüm hayvan prosedürleri, Almanya'nın Unterfranken Bölgesi Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve Helsinki Bildirgesi'ne göre yürütüldü.

1. İnvaziv monitörizasyon ve sürekli ilaç tedavisinin cerrahi hazırlığı ve kurulumu

1. Sprague-Dawley sıçanlarını, yerel kurumun hayvan araştırma gözetim organı ve / veya veterinerlik ekibi tarafından onaylanan bir konsantrasyon ve akış hızında hassas buharlaştırıcı tarafından sağlanan izofluran kullanarak uyuşturun. Yavaşlayan ve derinleşen solunum hızını gözlemleyerek yeterli anestezi derinliğini onaylayın ve kuyruk / ayak parmağı sıkışmasından sonra tepkisizliği doğrulayın. Boğazı ve mideyi bir ustura ile tıraş edin.
   Not: Solunum hızının büyük ölçüde azalması, aşırı dozda anestezinin bir göstergesi olabilir ve sonunda bradikne, hipotansiyon ve ölüme yol açabilir.
2. Fareyi bir ısıtma yastığı üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Gözlerin kurumasını önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün. Sıçanın intraoperatif izlenmesine ve / veya yerel kurumun hayvan araştırma gözetim organının ve / veya veteriner ekibinin tavsiyelerine dayalı olarak izofluran konsantrasyonunu ve akış hızını kullanarak uygun anestezik derinliği koruyun. Fareyi otomatik bir ısıtma yastığı üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
   Not: Hipotermi ve termal yaralanma makro ve mikrohemodinamik parametreleri etkiler ve güvenilir bir sonuç elde etmek için kaçınılmalıdır. Vücut ısısını fizyolojik aralıkta tutmak için esnek bir rektal prob ile sıçana bağlanan kontrol mekanizmalı bir ısıtma yastığı kullanılması önerilir.
3. Boyun ve boğazın uygun dezenfeksiyon solüsyonu ile dezenfekte edilmesinden sonra, boğaz medialindeki cildi bir neşter ile kesin ve yaklaşık 2 cm'lik bir kesi yapın. Fareyi çevirin ve oksiputun yaklaşık 1 cm distalinde boynunda cerrahi makasla yaklaşık 1 cm'lik bir kesi yapın.
4. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Sağ juguler veni ve sol karotid arteri makas ve pamuklu çubuklarla nazikçe inceleyin. Gemileri komşu yapılardan inceleyin. Çok fazla sürüklemekten kaçının ve dikkatli yayma hareketleriyle daha fazla hazırlanın.
   Not: Önceden ısıtılmış steril tuzlu su uygulayarak damarları daima nemli tutun.
5. İki kesi arasında bir bağlantı sağlamak için nazikçe ve damarlardan boyuna deri altından yayılma hareketleriyle diseksiyon yapın. Oluşturulan her tünele kelepçeler yerleştirin.
6. Döner cihazdan gelen fırdöndü ve kateterleri %0,9 NaCl ile yıkayın. Kateterleri paslanmaz çelik bir yay içine yerleştirin.
   Not: Kateterler yerleştirilmeden önce sodyum klorür ile yıkanmalıdır, çünkü minimum hava uygulaması hava embolisi nedeniyle ani ölüme yol açabilir.
7. Fareyi çevirin ve takılan kelepçeleri kullanarak kateterleri kelepçeleyin. Kateterleri boyundan boğaza doğru kaydırın. Yayı oksiputun yaklaşık 1 cm distalinde plastik bir düğme ipi ile boynunda 6 tekil dikiş (örn. 4/0) ile sabitleyin.
8. Fareyi tekrar sırtüstü pozisyona getirin. Hazırlanan her kaba yaklaşık 4 cm distal ve proksimalde pamuk iplikleri döşeyin. Arter proksimal kısmını, genellikle subaraknoid anevrizmaları kırpmak için kullanılan bir mikro klips ile klipsleyin. Alternatif olarak, klipsi bırakın ve ipliklerden birini sıkarak arteriyel kan akışını durdurun.
9. Atardamarı cerrahi bir mikro makasla kesin, bir elinizle kesiyi kanca ile açık tutun ve diğer elinizle forseps kullanarak arteriyel kateteri damar içine yerleştirin. Klipsi veya çekilen ipliği açın, kateteri kalbe doğru damarın içine yaklaşık 1 cm ileri itin ve serilen pamuk ipliklerini kullanarak cerrahi düğümlerle sabitleyin.
10. Şah damarı üzerinde 1.8 adımını tekrarlayın ve damar arter kadar sağlam olmadığı için klipsi bırakın.
11. Her iki kateteri de damarlarda düz bir çizgi halinde sabitledikten sonra, boğazdaki yarayı dikişlerle kapatın.

2. sCASP Prosedürü

1. Fareyi sırtüstü pozisyonda tutun, karnı tıraş edin ve karın bölgesini uygun dezenfeksiyon solüsyonlarıyla dezenfekte edin.
   Not: Daima aseptik teknik kullanın.
2. Cerrahi makasla yaklaşık 2 cm uzunluğunda cildin karın orta hattı insizyonunu yapın ve daha sonra periton mağarasını açmak için linea alba boyunca tekrar yapın.
3. Çekal direği tanımlayın ve pamuklu çubuklar kullanarak çekuyu nazikçe dışarı çekin.
4. Çıkan kolonu ileoçekal kapaktan yaklaşık 2 cm distalde anti-mezenterik tarafta bir sütür (6/0) [sütür 1] ile delin ve iki cerrahi düğüm ile sabitleyin. Herhangi bir kolon damarının lezyonlarından kaçının.
5. 10 FR aspirasyon kateterinin distal ucunu - yaklaşık 1,5 cm - kesin. Kateterin bu parçasını, yaklaşık 0,5 cm uzunluğunda dikdörtgen bir flep oluşturacak şekilde makasla kesin. Flebin ortasında bir dikiş (6/0) [sütür 2] ile flebi hazırlayın.
6. Flebi 14G'lik bir iğnenin üzerine koyun ve yükselen kolonu dikiş 1'in^{sabitlendiği iğne ile delin 15}.
7. Hazırlanan plastik tüpü iğnenin üzerindeki kolona yerleştirin. Aynı anda iğneyi yavaşça çıkarın. Tüpü, flep kolonun dışına ve tüpün geri kalanı kolonun içine girecek şekilde konumlandırın.
   1. Plastik tüpün tam olarak yerleştirilmesinden sonra, kolon duvarını ve cerrahi düğümleri dikerek flebi zaten mevcut olan sütür 2 ile sabitleyin. Kolon damarlarının herhangi bir lezyonundan tekrar kaçının. Dikişin 1 serbest uçlarını kolonun dışına çıkan plastik tüpün geri kalanının etrafına koyun ve 2 cerrahi düğüm yapın.
8. Stent çıkışında dışkı görünene kadar pamuklu çubuklar kullanarak çekumdan kolon stentine doğru dışkı sağın.
9. İnce bağırsağı ve kolonu karın mağarasına geri koyun. Bu vesile ile dışkı ile plastik tüp karın zarı ile temas halinde olmalıdır. Dışkıyı periton mağarasına dağıtmak için stenti 2 mL% 0.9 NaCl ile yıkayın.
10. Karın kaverneğini peritonun sürekli bir dikişi (4/0) ile ve daha sonra cildin sürekli bir dikişi (4/0) ile kapatın.

3. Ameliyat Sonrası İşlem

1. İzofluranın solunmasını durdurun ve fareyi kafesine geri koyun.
2. Fentanil (2.0 μg / 100 g vücut ağırlığı / saat) kullanarak venöz hat üzerinden intravenöz analjeziyi başlatın.

4. İkinci gün ölçümlerin hazırlanması

1. sCASP işleminden 24 saat sonra intravenöz olarak 0.5-1.0 mg midazolam uygulayın. Sıçanın intraoperatif izlenmesine ve / veya yerel kurumun hayvan araştırma gözetim organının ve / veya veteriner ekibinin tavsiyelerine dayalı olarak izofluran konsantrasyonunu ve akış hızını kullanarak uygun anestezik derinliği koruyun.
2. Alkol ve solüsyonla tekrar dezenfekte ettikten sonra, yeterli oksijenasyon ve ventilasyon sağlamak için 14 G venöz kanülün plastik tüpü ile trakeotomi yapın.
   1. Bu nedenle boğazdaki dikişi cerrahi makasla açın ve orta hattan soluk borusuna doğru nazikçe açın. Trakeayı cerrahi makasla yaklaşık 2 mm uzunluğundaki iki kıkırdak arasında dikey olarak kesin - sadece cerrahi makas sokacak kadar. Makasla kesiği künt bir şekilde trakea çapının yaklaşık yarısına kadar genişletin. 14 G'lik plastik bir tüpün 1 cm'sini yerleştirin ve 2 dikişle sabitleyin. ¹⁶
      Not: Soluk borusunun kesisi çevrenin yarısından daha büyükse, soluk borusu boyunca giden damarlar zarar görebilir ve bu da ciddi kanama, kan aspirasyonu veya ölümcül bradikardi ile sonuçlanabilir.
   2. F_iO₂ 0.28 ve 0.7 Vol.% izofluran içeren bir kemirgen ventilatörü ile mekanik ventilasyona başlayın ve midazolam (0.7 mg / 100 g BW / s) ve fentanil (7 μg / 100 g BW / s) ile intravenöz anesteziye başlayın. Yeterli ventilasyon ve oksijenasyonu sağlamak için kan gazı analizleri yapın. Bu nedenle, arteriyel kateter yoluyla yaklaşık 0,7 mL kan çekin ve bir kan gazı analizatörü ile ölçün.
      Not: İntravenöz anestezi sadece mekanik olarak kontrol edilen ventilasyon sağlandığında başlamalıdır.
3. 2.1'deki gibi traş ettikten ve dezenfekte ettikten sonra, sağ bacağın derisinde, dizin 0.5 cm proksimalinde 1 cm uzunlamasına bir kesi yapın. Cerrahi makas ve pamuklu çubuklar kullanarak arteri komşu yapılardan kör bir şekilde inceleyin.
   Not: Femoral arter yırtılırsa, proksimal pozisyonda kateter yerleştirilmesi hala mümkündür. Bu nedenle, implantasyona mümkün olduğunca distal olarak başlanması önerilir.
4. Arteri bir kanca ile açarak ve kateteri forseps ile yerleştirerek femoral artere bir termodilüsyon kateteri yerleştirin.
5. Termodilüsyon yöntemi ile kardiyak debiyi ölçmeye başlayın. Bu nedenle, bir kardiyak indeks ölçüm yazılımının ölçümünü başlattıktan sonra 1 mL soğutulmuş NaCl'yi venöz kateter yoluyla manuel olarak hızlı bir şekilde infüze edin. Bu ölçümü iki kez gerçekleştirin.

5. Böbrek fonksiyonunun değerlendirilmesi

1. Derinin ve peritonun dikişlerini makasla açarak laparotomi yapın. İdrar kesesini küçük bir plastik kateter ile kateterize edecek kadar cerrahi makasla kesin. Mesanenin etrafına yaklaşık 7 cm'lik bir pamuk ipliği döşedikten sonra, ipliği sabitleyin, kateteri düğümlerle sabitleyin ve son olarak kateter yoluyla mümkün olduğunca fazla idrar toplayın.
2. 2 mg / mL inülin, 5 mg / mL PAH konsantrasyonları elde etmek için% 0.9 NaCl ve% 0.9 NaCl içinde p-aminohippurik asit sodyum tuzu (PAH)% 0.9 NaCl içinde floresein-izotiyosiyanat-inülini (FITC-İnülin) çözün.
3. Her iki maddenin karışımının 75 μL i.v.'lik bir bolusunu uygulayın, ardından her iki maddenin 3.7 μL / s / 300 g BW oranında sürekli intravenöz infüzyonunu uygulayın.
4. FITC-Inulin ve PAH infüzyonu ile¹⁷ kararlı bir duruma ulaştıktan sonra idrarı 20 dakika boyunca toplayın. Kan gazı analizinin yapılmasıyla ilgili olarak 4.2.1'de açıklandığı gibi arteriyel kateter yoluyla kan örnekleri alın.
5. Floresan spektrometrisi ile idrar ve plazmanın inülin konsantrasyonlarını belirleyin ve anthrone yöntemini kullanarak fotospektrometri ile PAH'ı ölçün¹⁷.

6. Deneylerin sona ermesi

1. Hayvanı yerel yasal düzenlemelere göre ötenazi yapın.
2. Şırınga kullanarak arteriyel kateter yoluyla mümkün olduğunca fazla kan çekin.
3. Oniki parmak bağırsağı ve kalın bağırsağın peritoneal fiksasyonunu keserek alın, bunların bir kısmını cerrahi makas kullanarak çıkarın. Retroperitoneal hazırlayarak böbrekleri hazırlayın ve hasat edin ve yağlı kapsüllerinden serbest bırakın ve üreterden ve bağlı damarlardan kesin. Bir torakotomi yapın ve akciğerleri ve kalbi kesin. Tüm organları formaldehit içinde sabitleyin ve daha önce yayınlandığı gibi histolojik boyamalar yapın. ^15,18

Schick ve ^ark.8 tarafından daha önce yayınlandığı gibi, aşağıdaki sonuçları gösteriyoruz.

Mortalite olmadan sepsis indüksiyonu
CASP modelinde sepsis, kolonun intralüminal yerleşimli bakterilerinin sürekli bir sızıntısı ile indüklenir ve karın boşluğuna yükselir ve fekal peritonit ve bakteriyemi ile sonuçlanır. Bu vesileyle, i...

Septik ABH'nin patofizyolojisi, karmaşıklığı nedeniyle hala bilinmemektedir. Hastalarda yapılan klinik araştırmalar ve denemeler, histopatoloji değişiklikleri, mikrosirkülasyon bozuklukları veya hücresel düzeylerdeki ilaç etkileşimleri ile ilgili yeni içgörülerin kazanılmasını sağlamayacaktır¹⁵. Sepsis¹⁹ ile ilişkili akut böbrek hasarını araştırmak için geliştirilmiş ve yeni hayvan modellerine ihtiyaç oldu?...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

M.A. Schick ve N. Schlegel, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SCHL 1962/2-1 ve SCHL 1962/4-1'den fon aldı.